楊忠信，李曉宇，蔡 靜，黃志昂，張雙林(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 .胸外科，.心內(nèi)科，.病理科，.呼吸科，河南 開封 475001)

肺癌是一種發(fā)病率高、死亡率高的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。肺癌的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，生活環(huán)境、職業(yè)環(huán)境、遺傳因素、吸煙等均可能與肺癌的發(fā)生有關(guān)，其早期發(fā)病癥狀不明顯，大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于肺癌的晚期，嚴(yán)重影響了肺癌的治療[1，2]。肺癌的發(fā)生與多種癌基因和抑癌基因的調(diào)控有關(guān)，采用基因技術(shù)靶向治療和診斷肺癌已經(jīng)成為目前研究的重點(diǎn)。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX2)在惡性腫瘤中高表達(dá)，是一個(gè)與紡錘體有關(guān)的微管相關(guān)蛋白，受到細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控[3]。有研究顯示，TPX2在宮頸癌[4]、肺癌[5]、甲狀腺癌[6]等多種癌癥中過度表達(dá)，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種癌基因。在乳腺癌等癌細(xì)胞中干擾TPX2表達(dá)可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[7]。本研究探討TPX2對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤能力的影響，為研究TPX2在肺癌發(fā)病中的作用奠定基礎(chǔ)，為靶向TPX2治療肺癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料肺癌細(xì)胞A549購自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。BALB/c裸鼠18只，18～22 g，4～6周齡，均購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒購自于北京solarbio；含有siRNA TPX2和siRNA陰性對(duì)照的慢病毒由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)多克隆抗體、TPX2多克隆抗體、p53多克隆抗體購自于美國(guó)Abcam；TPX2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物由上海生工合成；RNA提取試劑盒購自于美國(guó)Thermo。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染將保存有A549細(xì)胞的凍存管放在37 ℃的水浴中，不斷晃動(dòng)，使細(xì)胞在1 min內(nèi)融化，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，接種到T25細(xì)胞瓶中，放在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞密度為80%時(shí)，把原來的細(xì)胞培養(yǎng)液吸除以后，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)將細(xì)胞洗滌兩次，加入3 ml的含有0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞1 min，1000×g離心10 min，棄酶消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前的8 h，取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞，以每毫升含有3×104個(gè)/ml種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%后，按照MOI=50加入病毒液，10 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后，用puromycin篩選感染率超過90%的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。將感染siRNA TPX2和siRNA陰性對(duì)照的慢病毒的細(xì)胞記為siRNA TPX2組和siRNA-NC組，同時(shí)以不做處理的細(xì)胞為Control組。

1.3RT-PCR取穩(wěn)定感染后的Control組、siRNA-NC組、siRNA TPX2組細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的RNA，加入20 μl的DEPC處理后的雙蒸水將RNA溶解后，在-80 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Realtime PCR檢測(cè)TPX2水平。PCR程序?yàn)椋?4 ℃，5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，10 min；共40個(gè)循環(huán)。用ABI prism 7300 SDS Software軟件分析，用2-△△Ct法計(jì)算TPX2 mRNA水平?！鳌鰿t=(實(shí)驗(yàn)組目的基因的Ct-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因的Ct)-(Control組目的基因的Ct-Control組內(nèi)參基因的Ct)。GAPDH上游引物為5，-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3’，下游引物5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。TPX2上游引物為5，-AACAATCCATTCCGTCAA-3’，下游引物5，-TGCAGGTGGCATACAAGG-3’。

1.4Westernblot 取穩(wěn)定感染后的Control組、siRNA-NC組、siRNA TPX2組細(xì)胞，用細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中的總蛋白，用BCA法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。用10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳。把蛋白樣品與上樣緩沖液混合煮沸5 min后，每孔加入30 μg的蛋白樣品，80 V電壓電泳，觀察溴酚藍(lán)到分離膠和濃縮膠的交界處以后，把電壓調(diào)整到100 V，直到溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠的底端。轉(zhuǎn)膜：0.1 A的電泳轉(zhuǎn)膜1.5 h，把蛋白凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上?？贵w孵育：5%脫脂奶粉在室溫封閉1 h后，用PBST(PBS中加吐溫)洗滌3次，加入一抗(1∶1500稀釋)4 ℃過夜反應(yīng)，PBST洗滌3次，加入二抗(1∶2000稀釋)在室溫孵育1 h后，DAB顯色，用Bio-Rad顯影，以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

1.5MTT取Control組、siRNA-NC組、siRNA TPX2組細(xì)胞，按照每毫升含有2×104個(gè)細(xì)胞/ml接種到96孔板中，每孔中加入200 μl的細(xì)胞懸浮液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h以后，將細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，在每孔中加入180 μl的細(xì)胞培養(yǎng)液和20 μl的噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)溶液，在CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清，在每個(gè)孔中加入150 μl的二甲基亞砜溶液，混合后，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm的A值。

1.6流式細(xì)胞術(shù)取Control組、siRNA-NC組、siRNA TPX2組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，把細(xì)胞培養(yǎng)液上清吸除以后，加入胰蛋白酶消化后，用PBS將細(xì)胞沉淀洗滌3次，轉(zhuǎn)移到離心管中，1000×g離心5 min，用PBS將細(xì)胞沉淀制成1×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液，1000×g離心5 min，棄上清，加入150 μl的結(jié)合緩沖液，混合后，加入5 μl的膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)和10 μl的碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，避光孵育后，加入200 μl的結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7裸鼠成瘤取18只裸鼠，隨機(jī)分成3組，每組6只。將Control組、siRNA-NC組、siRNA TPX2組細(xì)胞配制成每毫升含有5×107個(gè)細(xì)胞的懸浮液，按照每只裸鼠200 μl接種到裸鼠的左側(cè)的腋窩皮下，18只裸鼠均出現(xiàn)腫瘤，在20 d后，脊椎離斷法將裸鼠處死以后，用游標(biāo)卡尺記錄腫瘤的短徑和長(zhǎng)徑，計(jì)算腫瘤的體積，稱量腫瘤的重量。腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2。測(cè)量結(jié)束后，取腫瘤組織，Western blot法檢測(cè)組織中 Cleaved Caspase-3、TPX2、p53水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1慢病毒感染后TPX2水平如圖1和表1中所示，siRNA-NC組細(xì)胞中TPX2 mRNA和蛋白水平與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。siRNA TPX2組細(xì)胞中TPX2 mRNA和蛋白水平與Control組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染TPX2 siRNA可以抑制肺癌細(xì)胞中TPX2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

圖1 Western blot檢測(cè)TPX2表達(dá)

表1 三組TPX2表達(dá)水平比較

*與Control組比較，P< 0.05

2.2TPX2對(duì)細(xì)胞增殖凋亡影響如圖2和表2所示，siRNA-NC組A值和凋亡率與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。siRNA TPX2組細(xì)胞A值與Control組比較明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。下調(diào)TPX2 可以抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。

圖2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

2.3TPX2對(duì)裸鼠成瘤影響如表3所示，siRNA-NC組細(xì)胞腫瘤體積和腫瘤重量與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。siRNA TPX2組細(xì)胞腫瘤體積和腫瘤重量與Control組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。下調(diào)TPX2 可以抑制肺癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力。

表2 三組A值和凋亡率比較

*與Control組比較，P< 0.05

表3 三組腫瘤體積和腫瘤重量比較

*與Control組比較，P< 0.05

2.4腫瘤組織中CleavedCaspase-3、TPX2、p53表達(dá)水平如見圖3和表4所示，siRNA-NC組Cleaved Caspase-3、TPX2、p53表達(dá)水平與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。siRNA TPX2組Cleaved Caspase-3、p53表達(dá)水平與Control組比較明顯升高，TPX2表達(dá)水平與Control組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。下調(diào)TPX2 可以促進(jìn)Cleaved Caspase-3、p53表達(dá)。

圖3 Western blot檢測(cè)腫瘤組織中Cleaved Caspase-3、TPX2、p53水平

表4 三組腫瘤組織中Cleaved Caspase-3、TPX2、p53水平比較

*與Control組比較，P< 0.05

3 討論

TPX2最初發(fā)現(xiàn)于有爪蟾蜍中，因其作為Xklp2靶蛋白而命名，在有絲分裂中G1/S期表達(dá)上調(diào)，而在S/G2期主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，分裂期主要在紡錘體極表達(dá)[8]。TPX2是一種微管蛋白，參與Xklp2的C端同微管結(jié)合的過程，也與染色體的不穩(wěn)定有關(guān)。關(guān)于染色體不穩(wěn)定性與腫瘤發(fā)生的關(guān)系已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，大致可以概括為：致癌劑通過影響染色體或者是紡錘體的蛋白，或者基因毒性劑把有絲分裂的基因突變后，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，另外染色體不穩(wěn)定還可以誘發(fā)染色體核型的破壞，導(dǎo)致催化性染色體核型的形成，而癌前性、致死性、癌性等核型的產(chǎn)生均是由此產(chǎn)生的，而TPX2是與腫瘤染色體不穩(wěn)定關(guān)系最為密切的基因[9～12]。

近年來的研究顯示，多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)有TPX2的過表達(dá)，并且與癌癥的分期等有關(guān)[13]。楊上英等[14]用RT-PCR檢測(cè)TPX2在肺癌組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，TPX2在肺癌組織的過表達(dá)率高達(dá)64%。本研究通過小RNA干擾技術(shù)下調(diào)肺癌細(xì)胞中TPX2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)下調(diào)TPX2后的肺癌細(xì)胞的增殖能力下降，凋亡增加，進(jìn)一步用下調(diào)TPX2后的肺癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下，癌細(xì)胞的裸鼠成瘤能力下降，腫瘤的重量和體積均明顯下降，TPX2發(fā)揮抑癌基因的作用。

TPX2的作用機(jī)制較為復(fù)雜，TPX2可以通過作用于Aurora A而引起激酶構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致Aurora A的T288朝內(nèi)，從而保護(hù)已經(jīng)被磷酸化的蘇氨酸避免去磷酸化，而當(dāng)TPX2的N端減少時(shí)，Aurora A的磷酸化的T288暴露，極容易被蛋白磷酸酶去磷酸化，因此，TPX2可以通過調(diào)控Aurora A的磷酸化影響Aurora A的活化[15，16]。p53是一種抑癌基因，在腫瘤中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，p53能夠抑制Aurora A活性，而這種抑制作用只有在Aurora A和TPX2沒有結(jié)合時(shí)才能產(chǎn)生，也就是說在p53水平下降后，Aurora A才能引起中心體擴(kuò)增[17]。Pascreau等[18]研究顯示，TPX2可以抑制Aurora A導(dǎo)致的p53活性升高。在蔣沛月研究TPX2調(diào)控宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TPX2下調(diào)后，可以促進(jìn)p53的轉(zhuǎn)錄[19]。Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的凋亡執(zhí)行因子，其活化后形成Cleaved Caspase-3標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆的階段[20，21]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)TPX2表達(dá)后的肺癌細(xì)胞接種到裸鼠皮下后，腫瘤組織中的p53水平升高，并且凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的活化水平也升高，下調(diào)TPX2可能通過激活p53信號(hào)通路影響肺癌細(xì)胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤能力。

綜上，TPX2表達(dá)下調(diào)后，肺癌細(xì)胞增殖受阻，凋亡增多，裸鼠成瘤能力下降，這可能與p53有關(guān)，對(duì)于其具體的作用機(jī)制仍然需要深入研究。癌癥的發(fā)生是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，加上細(xì)胞內(nèi)基因和信號(hào)通路之間的交叉性，TPX2在癌癥中的作用和機(jī)制需要在后續(xù)研究中繼續(xù)探討。本研究只在一種肺癌細(xì)胞中進(jìn)行了研究，由于癌細(xì)胞的特性不同，后續(xù)還需要在多種肺癌細(xì)胞中進(jìn)行多方面的驗(yàn)證。本研究為靶向TPX2治療肺癌提供了理論基礎(chǔ)，為研究TPX2在肺癌發(fā)病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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