吳 松，李 怡，陳惠宇，杜亞琴，張 萍，汪 偉，李貴森，王 莉，丁涵露(.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 6007；.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院.四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 成都 6007)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病最為常見(jiàn)而嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，炎癥反應(yīng)在糖尿病腎病中具有重要的致病作用，肝X受體(LXR)是核受體家族成員中一種重要的核受體，在哺乳動(dòng)物中存在LXRα和LXRβ 兩種亞型[1]。LXR功能性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，除參與膽固醇、脂類和葡萄糖等物質(zhì)代謝外，還通過(guò)激活其下游靶基因ABCA1發(fā)揮重要的抗炎作用[2]。既往文獻(xiàn)報(bào)道LXR激動(dòng)劑可改善糖尿病腎病小鼠腎損傷，但LXR在小鼠體內(nèi)表達(dá)水平及LXR激動(dòng)劑對(duì)其活性的影響未見(jiàn)報(bào)道。2016年9月至2017年8月筆者觀察LXR激動(dòng)劑對(duì)糖尿病腎病小鼠db/db鼠腎臟中LXRα和LXRβ表達(dá)水平及其活性的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1試劑T0901317(Sigma公司)；Trizol(Thermo公司)；兔抗人LXRα、兔抗人LXRβ(購(gòu)自abcam公司)；鼠抗人GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗(北京博奧森公司)；ECL曝光(CST公司)。qRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；所需引物由上海生工合成。

1.2動(dòng)物飼養(yǎng)及分組6周齡雄性db/db小鼠14只，6周齡雄性C57BL/6小鼠(n=7)作為對(duì)照組(均購(gòu)自南京君科生物工程有限公司)。在溫控20～24 ℃、12小時(shí)光暗周期和隨機(jī)進(jìn)食條件下飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，檢測(cè)db/db小鼠血肌酐為(38.3±3.8)μmol/L，尿微量白蛋白為(162.9±32.1)μg/24 h，對(duì)照組小鼠血肌酐(29.1±10.6)μmol/L，尿微量白蛋白(22.8±2.8)μg/24 h，提示本實(shí)驗(yàn)db/db小鼠出現(xiàn)糖尿病腎損害。將db/db小鼠隨機(jī)分為db/db組和db/db+T0901317組(均n=7)。對(duì)照組和db/db組喂飼生理鹽水[50 μl /(只·天)×7d]，db/db+T0901317組喂飼T0901317[12.5 mg/(kg·d)×7d]；4周后以脊椎脫臼法處死并收集標(biāo)本。

1.3實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)db/db小鼠腎組織ABCA1MrnaTrizol法提取各組小鼠腎組織總RNA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增42個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，循環(huán)閾值(Ct)比較法進(jìn)行mRNA表達(dá)的相對(duì)定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行，ΔΔCT=(CT實(shí)驗(yàn)組目的-CT實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參)-(CT對(duì)照組目的-CT對(duì)照組內(nèi)參)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。

表1 目的基因的引物序列

1.4Westernblot檢測(cè)腎組織LXRα、LXRβ表達(dá)

上述各實(shí)驗(yàn)分組在db/db小鼠處理后立即收集腎組織加蛋白裂解液提取總蛋白，檢測(cè)細(xì)胞總蛋白濃度后取10 μg蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，100 V(恒壓)1小時(shí)后，將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜以含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，分別加入LXRα抗體(1∶1000)、LXRβ抗體(1∶1000)，GAPDH抗體(1∶10000)，4 ℃過(guò)夜，室溫孵育HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶1000)2 h，化學(xué)發(fā)光顯色，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Image J圖像分析軟件分析光密度，進(jìn)行半定量分析后取均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LXR激動(dòng)劑T0901317對(duì)腎組織ABCA1mRNA表達(dá)的影響對(duì)照組、db/db組和db/db+T0901317組的ABCA1 mRNA表達(dá)分別為(1、0.52±0.06)和(1.65±0.35)。與對(duì)照組相比，db/db+T0901317組ABCA1 mRNA表達(dá)上調(diào)，db/db組ABCA1 mRNA表達(dá)下調(diào)(P< 0.05)。

2.2LXR激動(dòng)劑T0901317對(duì)腎組織LXRα和LXRβ表達(dá)的影響如圖1所示，LXRα、LXRβ表達(dá)于db/db小鼠腎臟。與對(duì)照組相比，db/db組LXRα、LXRβ表達(dá)量明顯下調(diào)(P< 0.05)；與db/db組相比，db/db+T0901317組LXRα表達(dá)水平上調(diào)(P< 0.05)，而LXRβ表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)；與對(duì)照組相比，db/db+T0901317組LXRα表達(dá)上調(diào)(P< 0.05)，見(jiàn)表3。

圖1 LXR激動(dòng)劑T0901317對(duì)腎組織LXRα和LXRβ表達(dá)的影響

表3 各組LXRα和LXRβ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

※與對(duì)照組比較，P< 0.05

3 討論

炎癥在DN進(jìn)展中起到重要作用，炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)出現(xiàn)升高等變化[3]。LXR-α主要表達(dá)在膽固醇代謝組織比如肝臟、脂肪、腎臟、巨噬細(xì)胞，LXR-β在機(jī)體各種組織中廣泛表達(dá)。當(dāng)LXR在與相應(yīng)DNA順式作用元件結(jié)合時(shí)，通常也是與視黃醇X受體α(RXRα)形成異源二聚體。LXR激動(dòng)劑使LXR/RXR異源二聚體空間構(gòu)象發(fā)生改變，與輔助抑制子脫離、去抑制并募集輔助激活因子，再通過(guò)與相應(yīng)靶基因啟動(dòng)子上的LXR反應(yīng)元件結(jié)合，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄；而ABCA1是其重要的靶基因，也是ABC轉(zhuǎn)錄蛋白家族之一，在控制膽固醇流出、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、磷脂代謝及炎癥等方面發(fā)揮重要作用，并且有研究表明LXR通過(guò)下調(diào)ABCA1發(fā)揮抗炎功能[4]。LXR激動(dòng)劑抑制促炎因子和促纖維因子的表達(dá)，減輕糖腎病理改變。LXR調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抑制炎癥的靶細(xì)胞之一是巨噬細(xì)胞，而對(duì)于存在腎損傷的糖尿病小鼠(STZ誘導(dǎo))，當(dāng)巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)LXRα可顯著改善腎損傷。另外，LXR受體激動(dòng)劑能提高兔系膜細(xì)胞ABCA1表達(dá)，促進(jìn)其介導(dǎo)的膽固醇流出，說(shuō)明LXR-α通過(guò)ABCA1途徑參與腎臟脂質(zhì)的平衡[5]。慢性腎功不全患者巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加與ABCA1表達(dá)下調(diào)有關(guān)，抑制ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)，抑制炎癥導(dǎo)致的脂質(zhì)失調(diào)，減緩炎癥加重的脂質(zhì)腎損害中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，延緩腎小球硬化和腎臟病進(jìn)展[6]。LXRα和LXRβ均表達(dá)于腎臟，但在db/db小鼠中未見(jiàn)報(bào)道。我們研究證實(shí)，LXRα和LXRβ表達(dá)db/db小鼠腎臟，鑒于ABCA1表達(dá)升高代表LXR活化采用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，T0901317可使腎組織ABCA1 mRNA表達(dá)明顯升高，另外，western blot證實(shí)T0901317上調(diào)LXRα表達(dá)，而LXRβ蛋白表達(dá)無(wú)變化，提示T0901317主要通過(guò)LXRα作用于其目的基因ABCA1。同時(shí)，對(duì)照組ABCA1 mRNA、LXRα和LXRβ表達(dá)水平均高于db/db組，考慮炎癥抑制LXR表達(dá)進(jìn)而作用于LXRα-ABCA1途徑使ABCA1 mRNA表達(dá)減少。

總之，雖然LXR激動(dòng)劑T0901317可能主要上調(diào)db/db小鼠腎臟LXRα表達(dá)水平進(jìn)而通過(guò)LXRα-ABCA1途徑發(fā)揮抗炎作用，為糖尿病的抗炎策略提供新依據(jù)。

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