林偉東，陳志丹，孫威江1,*，楊如興

?

基于SCoT標(biāo)記的福建茶樹(shù)品種（系）遺傳多樣性分析

林偉東1,2,4，陳志丹2,3,4，孫威江1,2,3,4*，楊如興5

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2. 閩臺(tái)特色作物病蟲(chóng)生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002；3. 福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 福州 350002；4. 福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；5 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015.

利用SCoT標(biāo)記對(duì)福建茶樹(shù)資源進(jìn)行分析，構(gòu)建適用于福建茶樹(shù)資源SCoT-PCR擴(kuò)增體系。從38條SCoT引物中篩選出的16條多態(tài)性引物，構(gòu)建了55份茶樹(shù)品種（系）的SCoT標(biāo)記指紋圖譜。對(duì)55份材料共擴(kuò)增出219條條帶，多態(tài)性條帶為216條，平均每條引物擴(kuò)增出13.8條，多態(tài)性比率PPB為93.15%，55份供試材料的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity, GS）介于0.49~0.85，平均為0.67。SCoT標(biāo)記分析55份供試材料共兩個(gè)群體的觀測(cè)等位基因數(shù)Na為1.93，有效等位基因數(shù)Ne為1.54，Nei基因多樣性為0.32，香農(nóng)指數(shù)Shannon為0.48，遺傳分化Gst為0.067，基因流Nm為7.01。在遺傳相似系數(shù)為0.64處，將55份茶樹(shù)資源分成2大類(lèi)。

茶樹(shù)；SCoT；遺傳多樣性；親緣關(guān)系

福建省氣候溫暖，雨量充沛，適合各類(lèi)茶樹(shù)生長(zhǎng)，素有“茶樹(shù)品種寶庫(kù)”之稱(chēng)。福建有國(guó)家級(jí)、省級(jí)茶樹(shù)良種50余種，為福建茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了寶貴的物質(zhì)基礎(chǔ)，也為育種工作者選育新品種奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。福建種植茶樹(shù)歷史悠久，經(jīng)過(guò)歷代茶人的栽培，長(zhǎng)期以來(lái)茶樹(shù)之間發(fā)生復(fù)雜的雜交、自交，形成豐富多樣的茶樹(shù)資源。隨著茶樹(shù)種質(zhì)資源的日益增加，以及對(duì)資源創(chuàng)新利用的日益加深，找到高效、快速的鑒定茶樹(shù)種質(zhì)資源的方法十分重要。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)作為鑒定作物品種的主要方法之一，在茶樹(shù)指紋圖譜構(gòu)建、遺傳關(guān)系鑒定中應(yīng)用較為成熟。SCoT標(biāo)記也叫目標(biāo)密碼子多態(tài)性標(biāo)記，是Collard等[1]在2009年開(kāi)發(fā)的一種基于單引物擴(kuò)增的新型分子標(biāo)記。依據(jù)植物基因中起始密碼子（ATG）側(cè)翼序列設(shè)計(jì)單引物，擴(kuò)增的序列與性狀基因相關(guān)或與基因相近。SCoT與ISSR、RAPD標(biāo)記相似，具有充當(dāng)上下游的單引物；但又有不同之處，SCoT標(biāo)記的單引物與方向相反的相鄰基因ATG翻譯起始位點(diǎn)相結(jié)合，擴(kuò)增獲取目的基因或與之相近的DNA片段[2]，再根據(jù)植物側(cè)翼區(qū)域保守性翻譯起始位點(diǎn)的位置，假設(shè)A、T、G 3個(gè)堿基分別標(biāo)為＋1、＋2、＋3起始密碼子堿基，則固定G、A、C、C 4個(gè)堿基在＋4、＋7、＋8、＋9的位置，這幾個(gè)堿基的位置是固定不變的，而在－3、－6、－9的位置偏好堿基G[3]，其余位置可根據(jù)堿基的序列不同呈現(xiàn)豐富的多態(tài)性而進(jìn)行堿基的填充。引物長(zhǎng)度一般為18?bp，可以保證標(biāo)記的重復(fù)性，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)盡量避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，應(yīng)保證引物GC含量在50%~70%之間。

目前已在多種植物中對(duì)SCoT的擴(kuò)增體系進(jìn)行了優(yōu)化，例如柿子、玫瑰、荔枝、牡丹、大豆、葡萄等[4]。SCoT標(biāo)記在多種植物中得到應(yīng)用，并優(yōu)化了在各植物中擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系；但在茶樹(shù)上的應(yīng)用較少，目前只在陜西茶樹(shù)資源多樣性上有研究，而在福建茶樹(shù)資源中的研究尚未發(fā)現(xiàn)。本研究利用SCoT標(biāo)記對(duì)福建55份茶樹(shù)品種（系）進(jìn)行分析，旨在建立和優(yōu)化SCoT-PCR擴(kuò)增體系并構(gòu)建55份福建茶樹(shù)品種（系）的SCoT分子指紋圖譜，為茶樹(shù)種質(zhì)鑒定工作提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)材料主要為福建省已經(jīng)認(rèn)定的茶樹(shù)品種及部分地方茶樹(shù)品系，共計(jì)55個(gè)茶樹(shù)樣品（表1）。采樣地點(diǎn)分別為武夷星茶業(yè)有限公司品種園（武夷山）與福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所的茶樹(shù)種質(zhì)資源圃（福安）。每個(gè)樣品均隨機(jī)采摘30個(gè)茶樹(shù)一芽二葉新梢，混合均勻后分成3份，錫箔紙包裝后，放入液氮中固樣保存，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于－80℃冰箱中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶樹(shù)基因組DNA提取

茶樹(shù)基因組DNA提取采用Biospin試劑盒方法提取，按照生物學(xué)重復(fù)提取DNA，操作方法做適當(dāng)修改，用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)茶樹(shù)DNA質(zhì)量，利用核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA的純度與濃度。

表1 供試材料與來(lái)源

續(xù)表1

編號(hào)Code樣品名Sample name采集地Collect site品種類(lèi)型CuLtivar type 10毛猴武夷星品種園茶樹(shù)新品系 11白牡丹武夷星品種園茶樹(shù)新品系 12大紅袍武夷星品種園福建省審定 13黃觀音武夷星品種園國(guó)家級(jí)鑒定 14金牡丹武夷星品種園國(guó)家級(jí)鑒定 15鐵觀音武夷星品種園國(guó)家級(jí)審定 16本山武夷星品種園國(guó)家級(jí)審定 17杏仁茶武夷星品種園福建省審定 18黃旦武夷星品種園國(guó)家級(jí)審定 19八仙武夷星品種園國(guó)家級(jí)審定 20梅占武夷星品種園國(guó)家級(jí)審定 21毛蟹武夷星品種園國(guó)家級(jí)審定 22肉桂武夷星品種園福建省審定 23水仙武夷星品種園國(guó)家級(jí)審定 24軟枝烏龍武夷星品種園茶樹(shù)新品系 25大紅武夷星品種園茶樹(shù)新品系 26大葉烏龍武夷星品種園國(guó)家級(jí)審定 27鳳圓春武夷星品種園福建省審定 28福云6號(hào)武夷星品種園國(guó)家級(jí)鑒定 29金玫瑰武夷星品種園茶樹(shù)新品系 30紫玫瑰武夷星品種園福建省審定 31紫牡丹武夷星品種園國(guó)家級(jí)鑒定 32福鼎大白茶福安茶科所國(guó)家級(jí)審定 33福鼎大毫茶福安茶科所國(guó)家級(jí)審定 34悅茗香武夷星品種園國(guó)家級(jí)鑒定 35九龍大白茶福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所福建省審定 36早春毫福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所福建省審定 37福安大白茶福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家級(jí)鑒定 38福云7號(hào)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家級(jí)鑒定 39黃奇福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家級(jí)鑒定 40霞浦元宵茶福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所福建省審定 41福云10號(hào)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家級(jí)鑒定 42朝陽(yáng)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所福建省審定 43綠芽佛手福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所福建省審定 44福云20號(hào)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所福建省審定 45政和大白茶福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家級(jí)審定 46霞浦春波綠福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家級(jí)鑒定 47紅芽佛手福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家級(jí)鑒定 48白芽奇蘭福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所福建省審定 49金鎖匙武夷星品種園茶樹(shù)新品系 50半天妖武夷星品種園茶樹(shù)新品系 51向天梅武夷星品種園茶樹(shù)新品系 52老君眉武夷星品種園茶樹(shù)新品系 53胭脂柳武夷星品種園茶樹(shù)新品系 54留蘭香武夷星品種園茶樹(shù)新品系 55鬼洞白雞冠武夷星品種園茶樹(shù)新品系

1.2.2 引物來(lái)源

本試驗(yàn)所用引物均來(lái)自植物研究中已公布的SCoT引物，詳見(jiàn)表2。

1.2.3 SCoT擴(kuò)增體系優(yōu)化與引物篩選

（1）SCoT擴(kuò)增體系優(yōu)化。SCoT擴(kuò)增體系參考陳熙[5]所用體系，稍作優(yōu)化。設(shè)計(jì)基礎(chǔ)體系為：總體積15?μL，全式金2ｘEasy Taq PCR Super Mix 7.5?μL，50?ng·μL-1DNA 1?μL，濃度為100?μmol·L-1的引物1?μL，ddH2O補(bǔ)足。在此基礎(chǔ)上參照表3進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，篩選出最適SCoT-PCR擴(kuò)增體系。SCoT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性180?s；94℃變性60?s，退火60?s，72℃延伸60?s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸600?s，以此程序篩選出最適的SCoT-PCR擴(kuò)增體系。

（2）SCoT引物及退火溫度篩選。SCoT-PCR引物為通用引物，在植物研究中不同物種可以交叉使用，做進(jìn)一步篩選，找到適合福建茶樹(shù)擴(kuò)增的引物。以7個(gè)有代表性樣品基因池為模板，以引物合成時(shí)顯示的為中心，+4℃和–4℃為最高和最低溫度，以?xún)?yōu)化后的體系進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行最適退火溫度的篩選。

表2 引物名稱(chēng)

表3 SCoT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化參數(shù)

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

（1）根據(jù)電泳圖譜的條帶分布，電泳圖中每個(gè)條帶都是1個(gè)位點(diǎn)，是引物與DNA的結(jié)合點(diǎn)。將PCR電泳圖中的位點(diǎn)與DNA Maker進(jìn)行對(duì)比，顯示有條帶標(biāo)為1，而相對(duì)位置沒(méi)有條帶的標(biāo)為0，建立（0，1）矩陣表。

（2）對(duì)Excel表中所統(tǒng)計(jì)的（0，1）矩陣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算多態(tài)性條帶百分比（PPB, Percentage of bands）和多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL, Percentage of polymorphic loci）。PPB指所有供試材料的全部擴(kuò)增位點(diǎn)中多態(tài)性位點(diǎn)占總帶數(shù)的百分?jǐn)?shù)（PPB=多態(tài)性位點(diǎn)/擴(kuò)增總帶數(shù)）；PPL指每個(gè)引物擴(kuò)增結(jié)果全部條帶中多態(tài)性位點(diǎn)占這引物跑出總位點(diǎn)數(shù)的百分比（PPL=該引物多態(tài)性條帶/該引物擴(kuò)增全部條帶）。

（3）利用Popgene 32軟件，可計(jì)算香農(nóng)指數(shù)（Shannon, Shannon’s information index）、基因多樣性指數(shù)（Nei’s gene diversity index）、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na, Oberved number of alleles）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei遺傳一致度和Nei遺傳距離等參數(shù)。

（4）應(yīng)用Splittree 4.0軟件計(jì)算出樣品之間的無(wú)根進(jìn)化樹(shù)，分析樣品之間相對(duì)進(jìn)化順序。

（5）根據(jù)Ntsys 2.10e聚類(lèi)，得到GS遺傳相似系數(shù)。用于分析兩材料間遺傳差異大小。依據(jù)SHAN程序按照UPGMA法構(gòu)建樣品資源（系）間聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度與質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

吸取茶樹(shù)總DNA 3?μL在凝膠中經(jīng)電泳和凝膠成像拍照，結(jié)果顯示基因組DNA條帶清晰、亮度較好（圖1），幾乎沒(méi)有雜質(zhì)殘留在點(diǎn)樣孔附近，表明提取的DNA較為完整，純度較高，可滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

使用微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度和純度，由表4可看出A260/A280值均在1.79~2.10之間，表明DNA純度較高，檢測(cè)DNA濃度值最高達(dá)到2?709.6?ng·μL-1，最小值95.3?ng·μL-1，濃度較好，可以滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 擴(kuò)增體系優(yōu)化分析

本試驗(yàn)PCR擴(kuò)增使用了全式金的2ｘEasyTaq PCR SuperMix，其中包含了Taq酶、dNTPS、Mg2+離子，因此對(duì)擴(kuò)增體系的優(yōu)化主要對(duì)DNA模板、引物和Mix反應(yīng)液這3個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，通過(guò)擴(kuò)增條帶的多少與清晰度判斷最適用量。圖2為DNA的6個(gè)加樣量梯度篩選實(shí)驗(yàn)，圖2中條帶清晰度相當(dāng)。對(duì)比圖中各泳道條帶，確定SCoT擴(kuò)增體系加50?ng·μL-1的DNA模板用量為2.0?μL時(shí)擴(kuò)增效果最佳。

同樣以單因素實(shí)驗(yàn)法對(duì)擴(kuò)增體系中的Mix用量進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)為Mix用量的6個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)，分別為15?μL總體積中加入6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5?μL 6個(gè)梯度。從圖3可看出，6個(gè)泳道的清晰度相當(dāng)，綜合對(duì)比各泳道條帶，確定在SCoT-PCR擴(kuò)增體系中所加2ｘEasyTaq PCR SuperMix的量為8.5?μL，可以使SCoT-PCR擴(kuò)增效果達(dá)到最佳。

使用單因素法對(duì)濃度為100?μmol·L-1引物進(jìn)行梯度試驗(yàn)，篩選最適引物用量（圖4），設(shè)置6個(gè)梯度，加樣量分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5?μL。從圖4中對(duì)比各個(gè)泳道的條帶數(shù)和清晰度，最終選定100?μmol·L-1引物的加樣量為2.0?μL時(shí)，可以使SCoT-PCR擴(kuò)增效果達(dá)到最優(yōu)。綜合以上對(duì)50?ng·μL-1DNA模板用量、2ｘEasyTaq PCR SuperMix用量和100?μmol·L-1引物用量的梯度實(shí)驗(yàn)，最終確定SCoT-PCR擴(kuò)增體系為：50?ng·μL-1DNA模板用量為2.0?μL、2ｘEasyTaq PCR SuperMix用量為8.5?μL、100?μmol·L-1引物用量為2.0?μL，由此體系擴(kuò)增的SCoT-PCR擴(kuò)增圖譜效果最佳。

注：M：DL 2000 DNA Marker；1~12為表1前12個(gè)樣品。

表4 DNA質(zhì)量檢測(cè)

注：M: DL 2000 DNA Marker；0.5~3.0 代表所加DNA 的量。

2.3 篩選出的SCoT引物及多態(tài)性分析

利用優(yōu)化的體系對(duì)38條引物進(jìn)行擴(kuò)增效果篩選（圖5）。在選擇DNA模板時(shí)選擇7個(gè)有代表性的茶樹(shù)DNA基因組，組成基因池模板DNA。對(duì)比各泳道之間條帶，選擇清晰度好、條帶數(shù)多、條帶重復(fù)出現(xiàn)的引物。最終獲得16條擴(kuò)增條帶數(shù)多、條帶清晰、擴(kuò)增穩(wěn)定的引物，詳見(jiàn)表5。對(duì)16條引物進(jìn)行最適退火溫度篩選，以引物合成時(shí)顯示的為中心，+4℃和–4℃為最高和最低溫度，根據(jù)PCR儀自動(dòng)分布溫度梯度進(jìn)行最適退火溫度的篩選。以電泳圖譜中有清晰條帶，多態(tài)性好的泳道對(duì)應(yīng)溫度為最適退火溫度，最后得到16條引物的最適退火溫度，如圖6為部分引物S6、S7、S8、S9、S10、S11的退火溫度電泳圖。綜合上述結(jié)果，得到16條引物的最適退火溫度（表5）。對(duì)55個(gè)茶樹(shù)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到16份55個(gè)茶樹(shù)樣品的擴(kuò)增圖譜。16條引物的擴(kuò)增情況詳見(jiàn)表5。從表中可知，16條引物共擴(kuò)增出219個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)204個(gè)，多態(tài)性比率PPB為93.15%。其中引物SCoT11擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多，達(dá)17個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性條帶17條；引物SCoT1擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最少，為10條，多態(tài)性條帶9條；16條引物平均擴(kuò)增條帶數(shù)為13.69條，平均多態(tài)性條帶為12.75條，位點(diǎn)平均多態(tài)性比率為93.15%。綜合16條SCoT引物對(duì)55個(gè)茶樹(shù)樣品擴(kuò)增結(jié)果可知，供試茶樹(shù)樣品資源的遺傳背景較為豐富。

2.4 根據(jù)SCoT分析的55份實(shí)驗(yàn)樣品的多樣性分析

對(duì)SCoT分析的55個(gè)茶樹(shù)樣品的0、1矩陣表進(jìn)行分析，獲取55份茶樹(shù)樣品的遺傳相似系數(shù)GS。共獲得1?485個(gè)相似系數(shù)數(shù)據(jù)，相似系數(shù)在0.49~0.85，均值為0.67。相似系數(shù)最大的兩材料為品系306和春蘭品種，相似系數(shù)為0.85，表明二者親緣關(guān)系較近；相似系數(shù)最小的兩個(gè)樣品是老君眉和軟枝烏龍。原產(chǎn)地來(lái)自安溪的鐵觀音、黃旦、毛蟹、本山兩兩之間的相似系數(shù)介于0.72~0.81，具有較高的相似性，這與它們都產(chǎn)自相同地理位置息息相關(guān)。以黃旦和鐵觀音為親本的幾個(gè)子代之間的相似系數(shù)大多集中在0.72~0.76區(qū)域，相似系數(shù)較高，其主要原因是子代得到了親本相同或相近的遺傳信息，所以表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。同是引種自武夷山武夷星品種園的7個(gè)品系，金鎖匙、半天妖、老君眉、胭脂柳、留蘭香、鬼洞白雞冠兩兩之間的相似系數(shù)在0.68~0.78之間，相似系數(shù)較高，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的很大原因在于它們種植地理位置相同，受到的環(huán)境因素、作用因子相近，出現(xiàn)了近似的性狀和遺傳背景。將1?485個(gè)GS以0.036為間距，分成10組，分析GS的頻數(shù)頻率條形、折線圖（圖7），55個(gè)茶樹(shù)樣品遺傳相似系數(shù)在0.670~0.706區(qū)域數(shù)量最多；兩側(cè)不成對(duì)稱(chēng)分布，左側(cè)GS數(shù)目明確多于右側(cè)GS數(shù)目；大部分趨于0.598~0.742區(qū)域，個(gè)數(shù)為1?157，占77.91%。

注：M：DL 2000 DNA Marker；6.0~8.5代表所加Mix的量。

注：M：DL 2000 DNA Marker；1.0~3.5代表所加引物的量。

注：M：DL 2000 DNA Marker；S1~S19 代表引物1~19。

圖6 引物S6、S7、S8、S9、S10、S11 退火溫度電泳圖

表5 55個(gè)茶樹(shù)品種（系）SCoT引物及其擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)55個(gè)茶樹(shù)資源的0/1數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化格式后，應(yīng)用Popgene 32軟件處理。獲得觀測(cè)等位基因數(shù)Na為1.93，有效等位基因數(shù)Ne為1.54，Nei基因多樣性為0.32，香農(nóng)指數(shù)Shannon為0.48。遺傳分化Gst為0.067，意味著茶樹(shù)品種間的遺傳變異發(fā)生情況較少。兩種群間遺傳物質(zhì)的傳遞變化，主要是通過(guò)花粉和種子為途徑進(jìn)行[6]。當(dāng)Nm>1時(shí)，群體間基因交流起到較好的均質(zhì)作用，較高的基因交流可增加不同種間遺傳物質(zhì)的傳遞，減小兩群體間遺傳分化的發(fā)生[7]；分析得到55個(gè)茶樹(shù)樣品間的Nm為7.01，Nm>1，表明種間遺傳物質(zhì)傳遞較為豐富，這主要由于茶樹(shù)間種植地相隔較近，加強(qiáng)了各品種間遺傳物質(zhì)的交流。同時(shí)，茶樹(shù)花期大部分在10—11月，此時(shí)雨水較少，有利于花粉的傳播，增強(qiáng)了花粉在種間的交流。采自武夷山武夷星品種園和福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所品種園兩群體間的Nei遺傳距離為0.05，Nei遺傳一致度為0.95。

2.5 55個(gè)樣品材料的聚類(lèi)分析

利用軟件Ntsys 2.10e對(duì)SCoT標(biāo)記的55個(gè)茶樹(shù)品種（系）聚類(lèi)分析，建立55份供試材料之間的聚類(lèi)樹(shù)狀圖（圖8）。當(dāng)相似系數(shù)GS在0.64時(shí)，55個(gè)供試品種（系）可以分成2大類(lèi)群，兩大類(lèi)群又分成若干亞群，第一大類(lèi)群包含44個(gè)品種（系），第二大類(lèi)群包含11個(gè)品種（系）。第一大類(lèi)群中聚在了一起，說(shuō)明這兩個(gè)品種間相似性較高，具有較近的親緣關(guān)系。第一大類(lèi)群中包含原產(chǎn)地來(lái)自安溪的幾個(gè)品種（鐵觀音、黃旦、毛蟹、本山），以及黃旦和鐵觀音的自交、雜交后代，306品系和春蘭品種在相似系數(shù)0.85時(shí)主要包括黃玫瑰、黃觀音、金觀音、金牡丹、春蘭、306、瑞香等。同是佛手的紅芽與綠芽佛手在GS為0.74時(shí)被聚在了一起，主要因?yàn)樵谘啃誀钌媳憩F(xiàn)差異較大。第二大類(lèi)中只有11個(gè)品種（系），分成兩個(gè)亞類(lèi)，第一亞類(lèi)是引自武夷山武夷星品種園的7個(gè)品系，它們被聚在一起很大因素來(lái)自長(zhǎng)期擁有相同的種植環(huán)境，變異條件相同，也就有了較近的親緣關(guān)系。而第二大類(lèi)的第二亞類(lèi)4個(gè)材料是同是取自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所品種園的材料，擁有數(shù)十年的種植歷史，受相同環(huán)境作用，而表現(xiàn)為較近的關(guān)系。

圖7 基于SCoT標(biāo)記的供試材料間遺傳相似系數(shù)的頻數(shù)分布直方圖

圖8 基于SCoT 分子標(biāo)記的茶樹(shù)聚類(lèi)圖

2.6 供試品種（系）進(jìn)化樹(shù)分析

應(yīng)用軟件Splittree 4.0對(duì)SCoT標(biāo)記的55份供試材料進(jìn)行無(wú)根進(jìn)化樹(shù)分析（圖9），基于SCoT標(biāo)記所構(gòu)建的55份供試材料的無(wú)根進(jìn)化樹(shù)分成3簇，每大簇中又分成若干小簇。圖中綠色區(qū)域小簇中留蘭香、鬼洞白雞冠、胭脂柳、老君眉、向天梅、半天妖、金鎖匙7個(gè)品系被分在了一起，這與聚類(lèi)圖結(jié)果相同，具有相同進(jìn)化方向。福云10號(hào)是福安大白茶與云南大葉種雜交后代選育而來(lái)，圖中福云10號(hào)與福安大白茶在同一枝干，進(jìn)化方向與雜交選育結(jié)果相符。藍(lán)色區(qū)域福云7號(hào)與福云20號(hào)具有相同進(jìn)化方向，都來(lái)自相同的親本。其他在親本上沒(méi)有親緣關(guān)系的茶樹(shù)，例如霞浦春波綠、朝陽(yáng)、政和大白茶、福鼎大白茶、紅芽佛手、鳳圓春、早毫春、紫玫瑰、福云6號(hào)因?yàn)榉N植在相同環(huán)境，長(zhǎng)期受相似因素作用，出現(xiàn)了相似變異，從而出現(xiàn)相同進(jìn)化方向。黃色區(qū)域306、春蘭、金觀音、瑞香及黃觀音與黃玫瑰具有相同進(jìn)化方向，這主要是由它們遺傳物質(zhì)的來(lái)源相同，親本均為黃旦與鐵觀音。鐵觀音、本山、黃旦、毛蟹、梅占也表現(xiàn)出相同進(jìn)化方向，這很大因素在于它們間起源地理位置相同，而且在后期的引種過(guò)程保持了原有進(jìn)化關(guān)系。SCoT標(biāo)記除了檢測(cè)到以上相同親本或者相同地理來(lái)源而出現(xiàn)的進(jìn)化方向相同外，也有親緣關(guān)系相近但未被分在同一進(jìn)化方向的茶樹(shù)資源，例如綠芽佛手與紅芽佛手在進(jìn)化樹(shù)分布中與進(jìn)化方向不符，兩材料性狀不同，雖受相同環(huán)境作用，但發(fā)生了不同的變異。

圖9 基于SCoT 分子標(biāo)記的茶樹(shù)進(jìn)化樹(shù)

2.7 SCoT標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜

根據(jù)SCoT擴(kuò)增圖譜條帶的有無(wú)，采用特殊條帶法和不同引物擴(kuò)增條帶相結(jié)合的方式，可高效鑒定供試材料。特殊條帶法是根據(jù)某一位點(diǎn)只存在于某一材料，而在其他材料中未發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)為依據(jù)，所以特殊條帶往往表現(xiàn)出專(zhuān)一性。通過(guò)對(duì)比擴(kuò)增圖譜，未發(fā)現(xiàn)特殊條帶，所以構(gòu)建55份供試材料的指紋圖譜只能采用不同引物條帶相結(jié)合的方式鑒定材料。通過(guò)反復(fù)對(duì)比擴(kuò)增圖譜條帶分布情況，最后挑選SCoT1、SCoT3、SCoT5、SCoT6、SCoT7這5條引物擴(kuò)增譜帶中的部分條帶，共計(jì)15個(gè)位點(diǎn)，構(gòu)建了55份供試材料的DNA分子指紋圖譜（圖10）。此圖譜具有較高的鑒別效果，圖譜中的引物SCoT1的5個(gè)位點(diǎn)可以鑒別出7個(gè)供試材料編號(hào)（編號(hào)與樣品名稱(chēng)同表1），分別為8、20、24、45、50、51、52。引物SCoT3的兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合引物SCoT1的5個(gè)位點(diǎn)可以鑒別出12個(gè)材料，分別為1、13、28、29、31、35、36、40、41、43、53、55。引物SCoT5的3個(gè)位點(diǎn)結(jié)合引物SCoT1和SCoT3可鑒別出24個(gè)材料。引物SCoT6、SCoT7的5個(gè)位點(diǎn)結(jié)合SCoT1、SCoT3、SCoT5的10個(gè)位點(diǎn)可以鑒別出剩余的12個(gè)供試材料。SCoT標(biāo)記只用15個(gè)位點(diǎn)就構(gòu)建了55份供試材料的指紋圖譜，構(gòu)建效果較高，且每份材料都有不一樣的圖譜構(gòu)成。

3 討論

3.1 擴(kuò)增體系與多態(tài)性

SCoT標(biāo)記是一種新型分子標(biāo)記，在茶樹(shù)研究中的應(yīng)用比其他類(lèi)型分子標(biāo)記少。它是利用單引物充當(dāng)上下游引物，專(zhuān)門(mén)對(duì)密碼子區(qū)域側(cè)翼序列ATG設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR。具有擴(kuò)增效果好、步驟較少、不同物種間引物通用性強(qiáng)等特點(diǎn)。因?yàn)槭腔赑CR擴(kuò)增反應(yīng)，受到各種環(huán)境的影響，當(dāng)應(yīng)用于不同物種中時(shí)，反應(yīng)體系和條件也會(huì)存在一定的差異。因此，使用SCoT方法時(shí)，應(yīng)首先對(duì)其擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系一般有兩種方法：一是采用單因素試驗(yàn)法，即對(duì)幾種因素進(jìn)行篩選，從而得到最佳擴(kuò)增體系。夏志強(qiáng)等[8]采用此方法對(duì)木薯的PCR擴(kuò)增各參數(shù)水平進(jìn)行篩選。二是采用正交實(shí)驗(yàn)法，設(shè)計(jì)與分析各因素水平，根據(jù)擴(kuò)增圖表各水平得到最佳擴(kuò)增體系，這種試驗(yàn)方法帶有很大的主觀意識(shí)因素。本試驗(yàn)需優(yōu)化的因素有DNA模板濃度、引物濃度、2ｘSuperTaq Master Mix，所以采用單因素法確定最佳擴(kuò)增體系，本試驗(yàn)中采用此方法可快速高效地確定最佳體系，省去正交法繁雜的過(guò)程。

注：序號(hào)1-55 和表1 樣品對(duì)應(yīng)。Note: No.1-55 Correspond to the sample in table 1.

由于選用材料基因組不同，引物與DNA模板結(jié)合位點(diǎn)有所差異，除了需對(duì)引物篩選外，最適退火溫度也是影響擴(kuò)增效果的一大因素，實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要對(duì)引物最適退火溫度進(jìn)行篩選[9]。Tm較大，條帶少而亮，有效條帶少會(huì)影響多態(tài)性，影響最后判定的正確率。退火溫度較低時(shí)，條帶多，弱帶也多，差異性就較少，泳道雜亂，可信度降低，也無(wú)法有效達(dá)到鑒定效果。因此在選定退火溫度時(shí)要綜合考慮泳道擴(kuò)增圖譜清晰度與有效性條帶。本研究在保證有效性條帶多、泳道條帶清晰的前提下，都選用較高退火溫度，這樣可以使可重復(fù)性更好。

本試驗(yàn)將SCoT標(biāo)記應(yīng)用在福建茶樹(shù)樣品材料的親緣關(guān)系分析，檢測(cè)出福建茶樹(shù)樣品資源具有較高的遺傳多態(tài)性。16條引物對(duì)55個(gè)茶樹(shù)樣品共擴(kuò)增到219個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)204個(gè)，多態(tài)性比率PPB為93.15%，略低于陳熙[5]利用SCoT標(biāo)記分析陜西茶樹(shù)樣品的PPB（96.14%），這是因?yàn)椴煌琒CoT引物擴(kuò)增不同樣品資源的結(jié)合區(qū)域不同造成的。遺傳相似系數(shù)集中在0.49~0.85之間，寬于陳熙所研究陜西兩兩材料的遺傳相似系數(shù)（0.48~0.74）[5]說(shuō)明福建茶資源間遺傳背景較寬，具有較廣的茶樹(shù)遺傳物質(zhì)。結(jié)果表明，SCoT標(biāo)記能夠較好地區(qū)分供試材料，可用于分析茶樹(shù)資源間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，鑒定遺傳關(guān)系相同或相近的材料，構(gòu)建茶樹(shù)指紋圖譜。

3.2 SCoT方法研究的茶樹(shù)樣品多樣性研究

茶葉是福建省主要的經(jīng)濟(jì)作物，目前福建茶樹(shù)品種的選育主要依靠傳統(tǒng)育種為主，從自然雜交、人工雜交的后代中分離出優(yōu)良單株，通過(guò)幾年的性狀鑒定、茶葉品質(zhì)鑒定，性狀優(yōu)良，品質(zhì)較好的最后認(rèn)定為新品種，但這種育種工作年限長(zhǎng)、進(jìn)展緩慢。SCoT分子標(biāo)記是基于茶樹(shù)基因組的育種輔助手段，可以排除多年田間實(shí)驗(yàn)環(huán)境影響，客觀真實(shí)的反應(yīng)研究材料的遺傳基礎(chǔ)，達(dá)到快速判定品種，減少育種時(shí)間。陳熙[5]對(duì)陜西的50份供試材料進(jìn)行分析，得到PPB為96.62%，此方法可以較好地區(qū)分各茶樹(shù)樣品，可用于鑒定陜西茶樹(shù)材料。本研究中55個(gè)茶樹(shù)樣品的PPB為93.15%，多態(tài)性較好，表明SCoT標(biāo)記能用于福建茶樹(shù)樣品判定。分析圖8中55個(gè)福建茶樹(shù)樣品材料的聚類(lèi)分析圖，發(fā)現(xiàn)有些茶樹(shù)樣品能夠根據(jù)地理來(lái)源而分在一類(lèi)中，有些則不能按照地理來(lái)源分在一起，可能原因是茶樹(shù)為異花授粉的植物，在長(zhǎng)期生長(zhǎng)中花粉的傳播使茶樹(shù)間發(fā)生了雜交。有些茶樹(shù)樣品可以與親本聚在一起，有些則未按照親本與子代親緣關(guān)系聚在一起，未分在一起的可能原因是子代在長(zhǎng)期人工選育、引種過(guò)程受當(dāng)?shù)丨h(huán)境因素的改變發(fā)生了變異，還可能與當(dāng)?shù)氐娜后w種發(fā)生基因交流，從而出現(xiàn)基因的丟失。因此在育種工作中還應(yīng)當(dāng)注重保護(hù)優(yōu)良品種及當(dāng)?shù)匾吧后w種，避免野生群體種優(yōu)良基因在基因流過(guò)程中丟失。

圖9的無(wú)根進(jìn)化樹(shù)與圖8的分類(lèi)存在很大的相似之處，但兩種方法的分類(lèi)方式也有不同之處，造成這種差異可能由于兩種方法揭示的背景不盡相同。聚類(lèi)分析重在將親緣關(guān)系相近或種植環(huán)境相同的茶樹(shù)聚在一起，這種分類(lèi)受環(huán)境因素、人工栽培的影響較大。而圖9中的無(wú)根進(jìn)化樹(shù)重在揭示兩兩材料間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，茶樹(shù)演化、進(jìn)化的先后。聚類(lèi)分析的結(jié)果可以為育種工作者選育親本時(shí)提供直觀的參考，對(duì)鑒定不同茶樹(shù)種質(zhì)具有很大的幫助；而無(wú)根進(jìn)化樹(shù)可以看出樣品間進(jìn)化先后，也可反映供試樣品間的進(jìn)化或雜交順序。由6個(gè)SCoT擴(kuò)增效果較好引物，其擴(kuò)增圖譜中的部分位點(diǎn)構(gòu)建的55個(gè)茶樹(shù)材料的指紋圖譜，具有高效的判定效果。SCoT標(biāo)記的擴(kuò)增片段是位于目標(biāo)密碼子側(cè)翼區(qū)域，擴(kuò)增片段很可能是某一基因或者接近于某一基因所在的位置。能夠真實(shí)反應(yīng)材料的遺傳背景，可檢測(cè)出很小的差異片段，在不同材料的鑒定上優(yōu)勢(shì)較大。因此采用SCoT標(biāo)記組建的分子鑒定圖可真實(shí)反應(yīng)材料間差異，為珍惜茶樹(shù)資源及優(yōu)異品種的保護(hù)提供很好的保障，為品種和品系的鑒定，為茶樹(shù)種子、苗木檢測(cè)提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。

[1] Collard BY , Mackill D. Start codon targeted (SCoT) polymorphism: A simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants [J]. Plant MolecuLar Biology Reporter, 2009, 27(1): 86-93.

[2] 張俊麗. 扇脈杓蘭遺傳多樣性的SCoT分析及扇脈組的親緣地理學(xué)研究[D]. 上海: 華東師范大學(xué), 2016: 50-70.

[3] 韓國(guó)輝, 向素瓊, 汪衛(wèi)星, 等. 柑橘SCoT分子標(biāo)記技術(shù)體系的建立及其在遺傳分析中的應(yīng)用[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2011, 38(7): 1243-1250.

[4] 龍治堅(jiān), 范理璋, 徐剛, 等. SCoT分子標(biāo)記在植物研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2015, 16(2): 336-343.

[5] 陳熙. 陜西茶樹(shù)種質(zhì)資源DNA指紋圖譜構(gòu)建[D]. 陜西: 陜西理工學(xué)院, 2016: 55-57.

[6] 劉晶. 中國(guó)豆梨與川梨的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué),2013: 17-19.

[7] 錢(qián)鑫, 李全健, 連靜靜, 等. 瀕危植物扇脈杓蘭野生居群遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2013, 32(6): 1445-1450.

[8] 夏志強(qiáng), 鄒枚伶, 王文泉. 木薯SRAP擴(kuò)增體系的建立與優(yōu)化[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2008, 24(9): 457-460.

[9] 李傳代. 女貞ISSR分子標(biāo)記的引物篩選[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào), 2010, 14(2): 183-186, 192.

Analysis of Genetic Diversity of Fujian Tea Varieties by SCoT Markers

LIN Weidong1,2,4, CHEN Zhidan2,3,4, SUN Weijiang1,2,3,4*, YANG Ruxing5

1. College of HorticuLture, Fujian AgricuLture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Fujian-Taiwan Joint Centre for Ecological Control of Crop Pest, Fuzhou 350002, China; 3. Anxi College of Tea Science, Fujian AgricuLture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 4. Fujian Tea Industry Engineering Technology Research Center, Fuzhou 350002, China; 5. Tea Research Institute, Fujian Academy of AgricuLtural Sciences, Fu’an 355015, China

SCoT-PCR amplification system is constructed to analyze the tea resources in Fujian. Totally 16 polymorphic primers were screened from 38 SCoT primers to construct fingerprints of 55 tea cultivars (lines). A total of 219 bands were amplified from 55 materials, with 216 polymorphic bands.The average bands amplified by each primer and polymorphic ratio were 13.8 and 93.15%. The Genetic similarity (GS) of 55 tea resources ranged from 0.49 to 0.85, with an average of 0.67. The SCoT marker analysis showed that theobserved number of alleles was 1.93 in these two tea groups.The effective number of alleles, Nei gene diversity, Shannon’s information index, genetic differentiation and the gene flow were 1.54, 0.32, 0.48, 0.067 and 7.01, respectively. When the genetic similarity coefficient was set to 0.64, the tea resources could be divided into two major categories.

tea[(L.)O.Kuntze],SCoT, genetic diversity, genetic relationship

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)01-043-15

2017-06-13

2017-08-24

福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)專(zhuān)題項(xiàng)目（2015NZ0002-1）、福建省區(qū)域發(fā)展重大項(xiàng)目（2014N3014）、福建高校產(chǎn)學(xué)合作項(xiàng)目（2015N5008）、福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JA15184）

林偉東，男，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用方面的研究。*通訊作者：swj8103@126.com