唐秀華，周喆，唐琴，陳佳佳，謝鳳，洪瑤新，黃詩(shī)林，陳志丹,3,4*，孫威江1,,3,4*

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茶樹3基因cDNA全長(zhǎng)克隆及其表達(dá)分析

唐秀華1,3,4，周喆1,3,4，唐琴1,3,4，陳佳佳1,3,4，謝鳳1,3,4，洪瑤新1,3,4，黃詩(shī)林2，陳志丹2,3,4*，孫威江1,2,3,4*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；3. 福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；4. 福建茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)開發(fā)基地，福建 福州 350002

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）由多基因家族編碼，是花青素等多酚物質(zhì)合成途徑的起始酶，對(duì)其合成具有調(diào)控作用。本研究以紫化茶樹武夷奇種C18茶樹為材料，采用RACE技術(shù)克隆獲得基因cDNA，命名為3（登錄號(hào)為KY865305），分析其生物信息學(xué)特征，并檢測(cè)不同葉色茶樹品種（系）中的花青素總量及茶樹PAL家族成員基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，獲得3基因全長(zhǎng)cDNA為2?518?bp，包含一個(gè)完整的2?130?bp開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），編碼709個(gè)氨基酸。序列分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)為穩(wěn)定親水性蛋白，預(yù)測(cè)分子量為77.40?kD，理論等電點(diǎn)為6.26；Blast分析序列發(fā)現(xiàn)3與芒果的相似性最高，為87%。而在同源進(jìn)化樹分析中與芍藥的親緣關(guān)系較近。紫化茶樹的花青素總量和a、c、3（e）基因表達(dá)量均高于常規(guī)綠葉茶樹和白化茶樹。這表明茶樹a、c、3（e）基因上調(diào)表達(dá)可能促進(jìn)茶樹花青素合成積累，使得茶樹葉片呈現(xiàn)紫色。

茶樹；3基因；克?。幌鄬?duì)表達(dá)量；花青素

花青素（）屬于水溶性色素，不穩(wěn)定，需要與糖苷配基組成花青苷，以糖苷的形式存在于液泡中?；ㄇ嗨睾铣赏緩剑?階段以苯丙氨酸為底物，由、和4上游結(jié)構(gòu)基因共同催化完成；第2階段以香豆酰CoA為底物，由、、中游結(jié)構(gòu)基因共同催化完成；第3階段以二氫黃酮醇為底物，由、（）和下游結(jié)構(gòu)基因共同催化完成[1]。其中是花青素合成的起始酶，也是限速酶，即代謝過程中催化反應(yīng)速度最慢的酶，亦可改變代謝方向。基因是由多基因家族編碼，合成中間產(chǎn)物4-香豆酰輔酶A，參與植物形成次級(jí)代謝產(chǎn)物，如花青素、兒茶素、木質(zhì)素等多種類黃酮化合物。

近年來，對(duì)植物基因的研究從酶提取、測(cè)定活性過渡到抗逆性、基因克隆和表達(dá)量分析等方面。目前，多種植物中的基因已被鑒定并進(jìn)行更深入的研究。2011年以來，相繼從水稻[2]、甘蔗[3]、美洲南瓜[4-5]、鴨梨[6]、小麥[7]、李子[8]等經(jīng)濟(jì)作物中克隆基因cDNA全長(zhǎng)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。在茶樹（）上，從生理生化、分子生物學(xué)等不同水平上對(duì)武夷奇種紫化茶樹進(jìn)行相關(guān)研究[9-11]，表明紫紅色的嫩梢中花青素總量顯著高于綠色的成熟葉，且基因表達(dá)量顯著高于成熟綠葉，但茶樹基因cDNA全長(zhǎng)克隆及其序列分析還未見報(bào)道。

芽葉紫化茶樹作為一種優(yōu)異茶樹種質(zhì)資源而廣為人知，在生產(chǎn)實(shí)際中也因獨(dú)特的功能性和品質(zhì)特征而有較大的應(yīng)用價(jià)值。茶樹基因與芽葉紫化性狀調(diào)控顯著相關(guān)，發(fā)掘和鑒定茶樹基因?qū)ρ芯坎铇溲咳~色澤形成和高花青素含量的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。本研究首次克隆了茶樹L3基因的全長(zhǎng)序列，對(duì)L3基因的基本生物信息學(xué)特征進(jìn)行分析，并探究花青素總量和茶樹PAL家族成員基因在不同葉色茶樹葉片中的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究L3基因調(diào)控高花青素的芽葉紫化茶樹的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自武夷星茶業(yè)有限公司種質(zhì)資源圃，于2016年秋季采摘紫化茶樹武夷奇種C18的第1葉位葉片，按照五點(diǎn)采樣法混合均勻后迅速用液氮冷凍，置–80℃冰箱保存，用于基因克隆。于2017年夏季采摘常規(guī)綠葉茶樹朝陽(yáng)、水仙和武夷奇種83，紫化茶樹武夷奇種和武夷奇種73，白化茶樹白雞冠和御金香，共7份，取各茶樹品種（系）生長(zhǎng)發(fā)育良好、形狀大小一致的第2葉位葉片，每個(gè)品種（系）設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，樣品用液氮速凍，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，如圖1。

1.2 茶樹總RNA的提取及cDNA的合成

參考OMEGA植物總RNA提取試劑盒的說明書提取上述各茶樹品種（系）樣品的總RNA，采用RNase-Free DNase I Set試劑盒（OMEGA）消除基因組DNA，采用超微量分光光度計(jì)（賽默飛，NanoDrop 2000c）測(cè)定各RNA濃度，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各RNA的完整性，于–80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用Promega GoScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.3 茶樹CsPAL3基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及驗(yàn)證

參照SMARTer?RACE 5′/3′Kit（Clontech）試劑盒說明書的方法分別合成5′/3′RACE-Ready cDNA。參考GenBank上已登錄的茶樹、葡萄、荷花、胡蘿卜、棗等基因的保守序列，使用DNAMAN設(shè)計(jì)引物（表1）。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行加樣和5′/3′RACE的巢式PCR擴(kuò)增，切膠回收，連接至載體pMD19-T(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109(TaKaRa)，37℃培養(yǎng)過夜。通過藍(lán)白斑篩選與菌落PCR鑒定，挑取陽(yáng)性單菌落，送至華大基因測(cè)序。

根據(jù)上述3段序列進(jìn)行拼接，在其編碼區(qū)的兩端設(shè)計(jì)引物-F和-R，用高保真酶Prime STAR? GXL DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增編碼區(qū)片段，反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性4?min；98℃、10?s，56℃、15?s，68℃、135?s，共30循環(huán)；最后68℃延伸10?min。切膠回收，連接至載體pEASY-Blunt Zero（全式金生物），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α (TaKaRa)，于37℃過夜培養(yǎng)，鑒定陽(yáng)性克隆，送至華大基因測(cè)序，驗(yàn)證3的cDNA全長(zhǎng)序列。

1.4 茶樹CsPAL3基因的生物學(xué)信息分析

通過ProtParam軟件預(yù)測(cè)茶樹3蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，GOR IV軟件預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISSMODEL軟件預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)；通過TMHMM和TMPred軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；通過SignalP 4.1 Server軟件預(yù)測(cè)茶樹3基因編碼氨基酸的信號(hào)肽；通過FoldIndex軟件預(yù)測(cè)該蛋白無序化程度；通過NetPhos 3.1 Server對(duì)3進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過ProtScale進(jìn)行預(yù)測(cè)其疏水性/親水性；通過PSORT II Prediction軟件預(yù)測(cè)茶樹3基因的亞細(xì)胞定位；運(yùn)用MEGA6.0軟件中的近鄰相接法（Neighbor-Joining, NJ）（1000 BootStrap）構(gòu)建3基因同源進(jìn)化樹。

注：1：朝陽(yáng)，2：水仙，3：武夷奇種83，4：武夷奇種C18，5：武夷奇種73，6：白雞冠，7：御金香。

1.5 不同葉色的茶樹品種（系）花青素總量的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[9]方法提取不同葉色的茶樹品種（系）花青素總量。在紫外分光光度計(jì)下分別檢測(cè)530?nm和657?nm處的吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算茶樹花青素總量（干物重），OD/g=(OD530－0.25×OD657)/M。

1.6 茶樹PAL基因家族成員的表達(dá)分析

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsPAL3基因的全長(zhǎng)cDNA克隆

采用SMART RACE技術(shù)，擴(kuò)增得到1?580?bp的中間產(chǎn)物、1?696?bp的5′RACE產(chǎn)物和1?388?bp的3′RACE產(chǎn)物。通過拼接得到2?518?bp的茶樹3基因的全長(zhǎng)cDNA序列。經(jīng)過高保真酶擴(kuò)增，克隆測(cè)序，得到大小為2?130?bp的ORF片段，編碼709個(gè)氨基酸，見圖2和圖3。

2.2 茶樹CsPAL3基因的生物學(xué)信息分析

該蛋白含有保守功能結(jié)構(gòu)域PLNO2457，屬于PLNO2457超級(jí)家族。通過ProtParam在線軟件預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為77.40?kD，等電點(diǎn)6.26，說明該蛋白為酸性蛋白質(zhì)。709個(gè)氨基酸中，Leu（11.0%），Ala（8.6%），Gly（8.2%），Glu（7.9%）的頻率較高。帶負(fù)電荷的氨基酸數(shù)（Asp+Glu）為80個(gè)，正電荷的氨基酸數(shù)（Arg+Lys）為73個(gè)。消光系數(shù)（M-1cm-1 γ=280?nm）為48?360，其不穩(wěn)定系數(shù)僅為35.34，故屬于穩(wěn)定類蛋白。其半衰期在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)為30?h，在酵母細(xì)胞內(nèi)大于20?h，在大腸桿菌內(nèi)大于10?h。由GOR IV軟件預(yù)測(cè)結(jié)果可知，茶樹3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈3種常見結(jié)構(gòu)組成。其中無規(guī)則卷曲占45.13%的比例，α-螺旋占44.43%的比例，延伸鏈占10.44%的比例，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白缺失β-螺旋結(jié)構(gòu)。通過SWISSMODEL軟件預(yù)測(cè)3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，該模型與歐芹（）的蛋白匹配度最高，為83.83%。

注：M：DL2000，A：中間產(chǎn)物的菌落PCR，B：5′RACE產(chǎn)物的菌落PCR，C：3′RACE產(chǎn)物的菌落PCR，D：ORF擴(kuò)增。

注：下劃線為起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，陰影部分為PAL酶特征序列。

用在線軟件TMHMM Server v.2.0和TMpred預(yù)測(cè)3蛋白的跨膜螺旋區(qū)，該蛋白在膜外，不是膜蛋白，無跨膜螺旋區(qū)。用SignalP 4.1軟件預(yù)測(cè)，表明蛋白無信號(hào)肽，不是分泌蛋白。對(duì)3的ORF區(qū)域編碼的蛋白進(jìn)行FoldIndex預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，僅有7.89%的氨基酸（56個(gè)位點(diǎn)）組成的結(jié)構(gòu)為無序結(jié)構(gòu)，說明3不是無序蛋白。在NetPhos 3.1 Server中對(duì)3進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，如圖4顯示，該序列含有58個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中18個(gè)Thr（蘇氨酸）位點(diǎn)，34個(gè)Ser（絲氨酸）和6個(gè)Tyr（酪氨酸）位點(diǎn)。磷酸化位點(diǎn)約占全序列的8.2%，主要能夠被蛋白激酶C（PKC），蛋白激酶A（PKA），cdc2蛋白（cdc2）和酪蛋白激酶Ⅱ(CKII)等蛋白激酶磷酸化。通過ProtScale軟件預(yù)測(cè)分析，根據(jù)“正值為疏水性，負(fù)值為親水性，負(fù)值越大說明親水性越高”的原理，由圖5可知，3氨基酸殘基在整個(gè)區(qū)域中所表現(xiàn)的親水性要大于疏水性，而且大部分分值都處于較為低的位置，故3蛋白是偏向親水性的，為親水性蛋白。通過PSORT II Prediction在線軟件對(duì)3基因的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，其亞細(xì)胞定位主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。

2.3 茶樹CsPAL3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過3的氨基酸同源序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與最新登錄的e（登錄號(hào)為KY615672）相似性為99%，與芒果（，登錄號(hào)為KF956009）的相似性為87%，與早年登錄的1（登錄號(hào)為D26596）和2（登錄號(hào)為AY694188）相似性為80%。將茶樹3與已報(bào)道的茶樹及其他植物的蛋白序列，構(gòu)建PAL氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。結(jié)果顯示，這些植物PAL可以分為A、B兩大類，其中兩條茶樹都聚類在A類中，且與芍藥（）的關(guān)系較近。

2.4 不同葉色的茶樹品種（系）花青素總量分析

圖7表明，紫化茶樹第2葉位葉片的花青素總量均顯著高于常規(guī)綠葉茶樹和白化茶樹?？梢?，高花青素是茶樹呈紫化現(xiàn)象的主要原因。

2.5 茶樹PAL基因家族成員的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析茶樹基因家族成員在不同葉色茶樹品種（系）的表達(dá)差異。圖8顯示，朝陽(yáng)和武夷奇種73中的b基因表達(dá)量均明顯高于其他品種；水仙中的d基因表達(dá)量最高；朝陽(yáng)中的f基因表達(dá)量最高。紫化茶樹（武夷奇種18）a、c、3（e）基因表達(dá)量均顯著高于常規(guī)綠葉茶樹和白化茶樹，且葉片越紫，相對(duì)表達(dá)量越高?？赏茰y(cè)a、c、3（e）基因上調(diào)表達(dá)可能促進(jìn)茶樹花青素合成與積累。

圖4 CsPAL3 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖5 CsPAL3 氨基酸序列親/疏水性分析

圖6 CsPAL3 氨基酸序列進(jìn)化樹分析

注：1：朝陽(yáng)，2：水仙，3：武夷奇種83， 4：武夷奇種C18，5：武夷奇種73， 6：白雞冠，7：御金香。下同。

圖8 CsPAL 家族成員在不同葉色茶樹品種（系）的表達(dá)

3 討論

芽葉紫化茶樹作為一種特異的茶樹種質(zhì)資源，葉色呈現(xiàn)紫紅色和富含花青素是紫化茶樹的特異之處，并且高花青素含量是茶樹葉片呈紫紅色的主要原因。當(dāng)、、、、、、、、等結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量上調(diào)時(shí)，可促進(jìn)紫化茶樹花青素積累，紫紅色變深[1,13-14]。李智[15]研究三年生鳩坑品種茶樹在不同光照、溫度、氮素處理?xiàng)l件下，其花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)情況、酶活性及花青素含量之間的變化規(guī)律。結(jié)果顯示，強(qiáng)光、適當(dāng)?shù)蜏亍⑷钡T導(dǎo)等均可正向調(diào)控茶樹花青素代謝合成關(guān)鍵酶基因的高表達(dá)及花青素積累，最有效誘導(dǎo)茶樹花青素合成的光質(zhì)是紫外光。在不同光照處理下，花青素含量與、和的酶活性及相應(yīng)的基因表達(dá)趨勢(shì)一致；在不同溫度處理下，花青素含量與的酶活性及相應(yīng)的基因表達(dá)趨勢(shì)一致；在缺氮處理下，花青素含量與、、、和的酶活性及相應(yīng)的基因表達(dá)趨勢(shì)一致，與劉健偉[16]研究結(jié)果一致。該研究表明茶樹紫化現(xiàn)象受光照、溫度和氮素等外界環(huán)境因子影響較大，誘導(dǎo)或抑制調(diào)控茶樹花青素代謝合成，使得茶樹呈現(xiàn)不同葉色。

本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)，從茶樹中成功克隆1個(gè)編碼酶的3基因，該基因開放閱讀框?yàn)??130?bp，編碼709個(gè)氨基酸，與其他植物的具有較高的相似性，并且含有酶特征序列。該蛋白為親水酸性蛋白質(zhì)，無跨膜螺旋區(qū)，預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中，這將有助于3結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究?；ㄇ嗨乜偭吭谧匣铇淦贩N（系）中含量最高，更充分證明高花青素含量是茶樹葉片呈紫紅的主要原因。采用qPCR技術(shù)，檢測(cè)茶樹家族成員基因在不同葉色茶樹品種（系）中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明，a、c、3(e)基因表達(dá)量在紫化茶樹中表達(dá)量顯著高于常規(guī)綠葉茶樹和白化茶樹，其中富含花青素的武夷奇種C18最高。由此可推測(cè)，a、c、3(e)基因表達(dá)量與花青素含量呈正相關(guān)，可能調(diào)控茶樹花青素合成，其他家族成員的基因表達(dá)情況未發(fā)現(xiàn)規(guī)律。這與周瓊瓊等[9]研究基因在幼嫩紫葉中相對(duì)表達(dá)量顯著高于成熟綠葉的結(jié)果一致，與周天山等[17]研究紫化茶樹各葉位中花青素含量均顯著高于對(duì)照綠葉茶樹，且基因均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)的結(jié)果一致。聶慶娟等[18]研究不同葉色的美國(guó)紅櫨葉片，發(fā)現(xiàn)紅色葉片中，花青素含量高，酶活性高；王海偉等[19]研究不同粒色小麥籽粒，發(fā)現(xiàn)有色小麥在不同時(shí)期籽?；ㄇ嗨睾颗c活性變化趨于一致，且呈顯著正相關(guān)，表明是有色小麥籽?；ㄇ嗨睾铣傻年P(guān)鍵酶；趙瑩等[20]通過低質(zhì)量濃度T-2處理馬鈴薯可提高酶活性，增強(qiáng)苯丙烷代謝，進(jìn)而促進(jìn)花青素的積累。由此可推測(cè)，茶樹花青素含量可能與酶活性呈正相關(guān)的關(guān)系。張澤煌等[21]研究不同顏色果肉楊梅，發(fā)現(xiàn)是花青素合成密切相關(guān)的關(guān)鍵酶，在紅果肉中明顯上調(diào)表達(dá)；Li等[22]研究秋海棠分別在強(qiáng)光和低溫處理下，花青素含量均顯著上升，但在低溫處理2天時(shí)，顯著上調(diào)，之后呈下調(diào)趨勢(shì)，與強(qiáng)光處理的結(jié)果一致。

花青素是植物呈色的主要色素，含量高低是茶樹葉色不同的主要原因。是花青素合成的上游基因，還參與其他類黃酮物質(zhì)合成，不同于僅控制花青素合成的下游基因。因此后續(xù)應(yīng)該進(jìn)一步克隆該基因的全長(zhǎng)基因組序列，并獲得啟動(dòng)子序列，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子核心元件及調(diào)控花青素合成相關(guān)順式元件。借助過表達(dá)或基因敲除等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化驗(yàn)證3的基因功能，以期培育高花青素茶樹品種，提高經(jīng)濟(jì)效益。

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Cloning and Expression Analysis of a Full Length cDNA of3 Gene in Tea Plant ()

TANG Xiuhua1,3,4, ZHOU Zhe1,3,4, TANG Qin1,3,4, CHEN Jiajia1,3,4, XIE Feng1,3,4, HONG Yaoxin1,3,4, HUANG Shilin2, CHEN Zhidan2,3,4*, SUN Weijiang1,2,3,4*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. College of Tea, Fujian Agriculture and Forestry University, Quanzhou 362400, China; 3. Tea Industry Engineering Technology Research Center of Fujian Province, Fuzhou 350002, China; 4. Tea Industry Technology Development Base of Fujian Province, Fuzhou 350002, China

The phenylalanine ammonia-lyase (PAL) belongs to a multi-gene family. PAL is the first enzyme in theflavonoid biosynthetic pathway, which plays a key role in regulating flavonoid biosynthesis. The full length cDNA sequence of one phenylalanine ammonia-lyase () gene was obtained from purple tea cultivar Wuyi Qizhong C18 () by rapid amplification of cDNA ends PCR(RACE-PCR) and named as3 (GenBank accession no. KY865305). The full-length cDNA ofwas 2?518?bp, with an ORF of 2?130?bp, which encodes a protein of 709 amino acids.Bioinformatics analysis showed it is a stable hydrophilic protein, withthe predict molecular and theoretic isoelectric points of 77.40?kD and 6.26. Blast analysis indicated that3 had the highest similarity (87%) with homologue gene in, and had the closest genetic relationship with homologue gene inaccording to phylogenetic tree analysis. The total anthocyanin contents and the expressionofa,c,3 in the purple shoots of tea plants were significantly higher than the green and white tea plants. It suggests that the enhanced expression levels ofa,c,3 genesmight promote the accumulation of anthocyanins, therebylead to the purple color in tea plants.

tea plant,3 gene, cloning, relative expression, anthocyanins

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)01-033-10

2017-10-16

2017-11-09

紫化芽葉茶樹種質(zhì)資源的挖掘保存與創(chuàng)新利用（2015N5008）、福建省科技重大專項(xiàng)專題項(xiàng)目（2015NZ0002-1）、福建省科技重大專項(xiàng)專題（2017NZ0002-1）

唐秀華，女，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究。*通訊作者：swj8103@126.com; asbulletdan@163.com.