卞鳳娥，肖秋紅，郝桂梅，孫永江，陸文利，杜遠鵬，翟衡

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根施褪黑素對NaCl脅迫下葡萄內源褪黑素及葉綠素熒光特性的影響

卞鳳娥，肖秋紅，郝桂梅，孫永江，陸文利，杜遠鵬，翟衡

(山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018)

【目的】研究NaCl脅迫下內源褪黑素（melatonin,MT）及其關鍵代謝物的響應以及施加外源MT對NaCl脅迫下葡萄葉片的光抑制緩解作用，為MT的應用提供參考?！痉椒ā恳砸荒晟柙浴鸂枴咸眩╟v. Vidal Blanc）為試材，進行100 nmol·L-1NaCl和100 nmol·L-1NaCl+MT處理，測定不同處理植株、不同器官內源MT、MT合成前體物質5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）和MT的主要代謝產物2-羥基褪黑素（2-Hydroxymelatonin,2-OHMel）的含量，分析根施MT對NaCl脅迫下葉片葉綠素熒光特性及內源MT代謝的影響?！窘Y果】受NaCl脅迫后，植株不同器官的內源MT、5-HT及2-OHMel與清水對照相比有明顯的時空變化，脅迫7 d時以根系的MT含量最高，其次是嫩梢，成葉中的最低；隨著脅迫時間的延長，根系中的MT含量大幅度下降，而嫩梢中的5-HT含量增加。根施外源MT后與單純的NaCl脅迫相比，顯著提高了前期成葉中的5-HT含量以及后期新根中的MT含量，嫩梢和成葉中2-OHMel的含量。NaCl脅迫后快速葉綠素熒光曲線（OJIP）形狀發(fā)生明顯改變，最大熒光（Fm）及葉片最大光化學效率（Fv/Fm）顯著下降了31.6%和11.6%，非光化學淬滅（NPQ）顯著升高，光系統I（PSI）和光系統II（PSII）的線性電子傳遞速率ETR（I）和ETR（II）均顯著下降；而根施MT后，葉片Fm和Fv/Fm的分別升高了12.9%和7.3%，OJIP曲線中K點和J點分別下降了23.6%和11.3%，增加了葉片對光能的利用效率，線性電子傳遞速率明顯提高?！窘Y論】NaCl脅迫嚴重抑制葡萄葉片光系統活性，但促進了植株中褪黑素的合成；根施MT緩解了光系統活性的抑制程度，促進MT在植株各器官中的代謝和分配，緩解NaCl脅迫對葡萄葉片光合作用的傷害程度。

NaCl脅迫；葡萄；葉綠素熒光；褪黑素；5-羥色胺；2-羥基褪黑素

0 引言

【研究意義】全世界有超過10億hm2的土地受到鹽堿脅迫的影響，中國鹽堿土面積巨大，還有近1/5耕地發(fā)生鹽漬化[1]。西部干旱半干旱地區(qū)是中國重要的葡萄主產區(qū)，大部分葡萄都栽培于鹽堿地上，生長季節(jié)經常出現大面積的黃化現象[2-3]。褪黑素（melatonin，MT）作為一種新發(fā)現的強抗氧化劑，對抵御低溫、高溫、臭氧、重金屬、UV等多種非生物脅迫方面有積極作用[4-8]。研究外源MT對NaCl脅迫的緩解作用及內源MT及其關鍵代謝物的含量變化對MT的應用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】鹽脅迫能夠誘導向日葵[9]及羽扇豆[10]等植物內源MT的增加，而研究表明，施加外源MT能有效地保護鹽溶液灌根處理的黃瓜幼苗的光合系統，提高黃瓜幼苗對鹽的耐受性[11]。外源MT可以通過提高植株抗氧化酶活性及含量等來降低質膜過氧化水平，保持細胞膜的完整性和功能，從而增強黃瓜幼苗對低溫、弱光的適應性[12]。外源MT也可減緩紫外輻射引起的煙草氧化脅迫損傷[13]。外源MT還可以通過提高葉綠素的含量減緩大麥的衰老過程[14]。徐向東等[15]還發(fā)現外源MT能降低黃瓜在高溫脅迫下H2O2含量和O2·-的產生速率，提高植株體內抗氧化酶活性及熱激蛋白的含量，提高碳氮代謝相關酶活性，從而有效提高黃瓜果實碳水化合物及氮素的含量[16]。【本研究切入點】使用外源MT是否能緩解NaCl脅迫對葡萄葉片的傷害，以及在應對脅迫反應過程中MT及其關鍵代謝物的代謝規(guī)律都尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】研究NaCl脅迫下根施MT對葡萄葉片葉綠素熒光特性的影響，以及在應對脅迫反應過程中內源MT及其關鍵代謝物的含量變化，以探討MT在緩解NaCl脅迫方面的作用和機制，為MT在未來農業(yè)方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2016年在山東農業(yè)大學核心葡萄示范園（東經117.06°，北緯36.11°）進行。

1.1 試驗設計

試材為種間雜交品種‘威代爾’（Vidal Blanc）葡萄，其親本為Ugni blanc×Rayon d'Or，采用一年生自根苗，種植于直徑25 cm、高35 cm的花盆中，培養(yǎng)基質為壤土﹕沙﹕草炭=1﹕2﹕1，待長至8—10片完全展開葉時，進行以下處理：

對照（CK）：澆等量清水；

處理1（NaCl）：根澆NaCl溶液（100 nmol·L-1）；

處理2（NaCl +MT）：根澆NaCl+ MT溶液（100 nmol·L-1）。

第一次按不同處理要求澆透至流出，以后每3—4 d澆施一次溶液，對照澆等量清水，共澆施4次，每個處理10盆，每盆1株。處理7 d后，于17：00—18：00取其中5株的嫩梢（頂端3—4 cm）、成葉和新根測定MT、MT的關鍵合成前體物質5-羥色胺（5-HT）和MT的代謝產物2-羥基褪黑素（2-OHMel）的含量。繼續(xù)處理到14 d后，取另外5株測定各項生理指標，然后于當天的17：00—18：00取嫩梢、成葉和新根測定MT、5-HT和2-OHMel的含量。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 褪黑素、5-羥色胺和2-羥基褪黑素的測定 提取方法：參照尹麗媛[17]的方法稍作修改。葡萄樣品在采樣并處理后迅速放入液氮中冷凍，存放在-40℃低溫冰箱中。待制樣時取出，用冷凍研磨機（IKA，A11 basic S25）磨成凍粉，真空式冷凍干燥機（北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司，FD-1A-50）冷凍干燥（≥48 h）。稱取0.5 g葡萄樣品凍干粉，置于10 mL試管中，加入5 mL甲醇（天津市永大化學試劑有限公司，分析純），渦旋震蕩后，浸提10 h。然后用超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-300E）低溫超聲15 min（300 W），隨后在4℃、10 000 r/min條件下用高速冷凍離心機（Anke，GL-20G-II）離心15 min，收集上清液并用0.22 μm濾膜進行過濾，置于新試管中。再加入5 mL甲醇到原離心管中，渦旋混勻，同樣的條件再次離心。將兩次上清液混合在一起，用循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司，SHB-III）和旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，SY-2000）低溫旋轉蒸發(fā)（不超過30℃）。將蒸干后的物質用3 mL 5%甲醇水溶液重新溶解下來，渦旋振蕩，過0.22 μm有機濾膜。然后用固相萃取裝置（Agilent，20 pcs）進行固相萃取，將過濾好的上清液過C18固相萃取小柱（Agilent，100 mg 1 mL），按活化、平衡、上樣、淋洗的順序分別加入5 mL甲醇、5 mL超純水、樣品、5 mL 5%甲醇溶液，速度控制在1 mL·min-1，最后用1 mL 90%甲醇溶液進行洗脫定容到1 mL，過0.22 μm有機濾膜后加入到一次性的液相進樣管中，等待上樣檢測。MT、5-HT和2-OHMel標準品購自美國SIGMA公司，用色譜級甲醇準確配制各標準品溶液后上樣檢測。

檢測條件：儀器為三重四級桿高效液相色譜–質譜聯用儀（DIONEX，UltiMate 3000；Thremo，TSQ Quantum Access max），流動相為甲醇（Thremo，色譜純）和0.05%乙酸水溶液（Thremo，色譜純），流速為0.3 mL·min-1，梯度洗脫條件：流動相為甲醇（A）和含0.05%乙酸的水（B），0—0.8 min時80% B；0.8—2 min時，線性減小至40% B；2—5 min時，維持40% B；5—5.1 min時，線性增大至80% B；5.1—8 min時，維持40% B，結束。進樣量5 μL，柱溫25℃，質譜模式為ESI（電噴霧離子化）正離子模式，檢測方式為SRM（質譜多反應監(jiān)測），噴霧氣介質是N2，毛細管溫度為300℃，噴霧電壓溫為3 000 V，噴霧器溫度為300℃，輔助氣壓為15 V，鞘氣壓為35 V，定性與定量離子、碰撞電壓和保留時間等質譜條件參數見表1。

表1 褪黑素、5-羥色胺和2-羥基褪黑素的質譜條件參數

*定量離子Quantitative ion

1.2.2 葉綠素熒光誘導動力學OJIP曲線的測定及JIP-test分析 用連續(xù)激發(fā)式熒光儀（Handy PEA，Hansatech，英國）測定充分暗適應30 min后的葉片葉綠素熒光誘導動力學曲線（OJIP曲線），測定時間為上午9：00—10：00，自然光強在800—1 200 μmol·m-2·s-1，溫度不高于35℃。從OJIP曲線上可直接獲得如下參數[18-19]：Fo，O點為最小熒光（20 μs）；Fk，K點（300 μs）的熒光；FJ，J點[20]的熒光；FI，I點（30 ms）的熒光；Fm，最大熒光，P點的熒光。參考Strasser等[20]的方法，將OJIP曲線進行O–P段標準化，得到相對可變熒光（Vt）=（Ft-Fo）/（Fm-Fo），ΔVt=（Vt）處理-（Vt）CK，PSII最大光化學效率（Fv/Fm）=（Fm-Fo）/Fm，其中Ft為任意時刻的熒光數值，Vt為任意時刻的可變熒光數值。單位面積有活性反應中心數目（RC/CSm）= Fm×φPo×（Vj/Mo），捕獲的激子將電子傳遞到QA以后的其他電子受體的概率（Ψo）=ETo/TRo=（1-Vj），其中φPo為PSⅡ最大量子效率，Mo為相對熒光曲線的初始斜率，Vj為j點的相對可變熒光。

1.2.3 葉綠素熒光參數的測定 采用英國Hansatech公司的FMS-2型便攜脈沖調制式熒光儀測定熒光參數，測定程序如下：首先對處理前葉片進行30 min暗適應，打飽和脈沖光（12 000 μmol·m-2·s-1），測定起始暗適應下的最大熒光（Fm）。

用Dual-PAM-100（Heinz Walz）雙通道熒光儀參照SUN等[21]的方法，首先對處理前葉片進行30 min暗適應，打飽和脈沖光（12 000 μmol·m-2·s-1），測定起始暗適應下的最大熒光（Fm），光強按10、23、41、113、212、287、565、780和1 215 μmol photons·m-2·s-1的順序每60 s升高一次，每一次照光結束后，打一個飽和脈沖光測定熒光參數，測定參數包括：PSII光化學量子效率Y（II）=（Fm'-Fs）/Fm'；PSII的電子傳遞速率ETR（II）=0.84×0.5×Y（II）×PPFD；PSII實際光化學效率（ФPSII）=（Fm'-Fs）/Fm'；光下最大捕光效率（Fv'/Fm'）=（Fm'-Fo'）/Fm'；光化學淬滅系數（qP）=（Fm'-Fs）/（Fm'-Fo'）；非光化學淬滅（NPQ）=Fm/Fm'-1。PSI光化學量子效率Y（I）=（Pm′-P）/Pm，PSI的電子傳遞速率ETR（I）=0.84×0.5×Y（I）×PPFD。Fo'，光適應下的葉片最小熒光；Fm'，光照后的最大葉綠素熒光；Fs，光適應下的葉綠素穩(wěn)定熒光；P，P700光下信號強度；Pm，P700最大氧化水平；Pm'，光下P700最大氧化水平。

1.3 數據處理

用Microsoft Excel軟件處理數據和制圖，DPS軟件進行單因素方差分析，并進行LSD多重比較，差異顯著性為＜0.05。

2 結果

2.1 NaCl脅迫下葡萄各器官褪黑素、5-羥色胺和2-羥基褪黑素的含量變化

將MT、5-HT和2-OHMel標準樣品溶液上樣檢測，結果如圖1。MT標準樣品保留時間為4.11 min，5-HT標準樣品保留時間為1.03 min，2-OHMel標準樣品保留時間為3.85 min；葡萄器官提取物色譜圖結果見圖2，目標峰保留時間與標準樣品基本一致。

由圖3可以看出，NaCl脅迫7 d后，各器官中的MT和2-OHMel含量與對照的分布規(guī)律一致，MT均以新根的含量最高，嫩梢其次，成葉中的含量最低；2-OHMel以嫩梢的含量最高，成葉其次，新根中的含量最低；而各器官5-HT含量在同一水平。NaCl脅迫14 d后，各器官的MT含量減少，2-OHMel含量增加，分布變化均為嫩梢＞成葉＞新根；5-HT含量分布為成葉＞新根＞嫩梢。

脅迫7 d后，NaCl+MT處理的各器官MT含量仍保持了原趨勢，即以根中的最高，成葉中的最少（圖3-A）；不同器官5-HT含量拉開差距，表現為成葉＞嫩梢＞新根，2-OHMel的含量分布為嫩梢＞成葉＞新根（圖3-C、E）。NaCl+MT處理14 d后，MT的含量分布為嫩梢＞新根＞成葉（圖3-B），5-HT的含量以地上部器官較高，表現為嫩梢＞成葉＞新根（圖3-D），2-OHMel含量以成葉和嫩梢較高，新根很低（圖3-F）。

鹽脅迫顯著提高了各器官的MT含量，脅迫7 d后，植株嫩梢、成葉和新根的MT含量分別比清水處理的提高了1.78、1.54和1.4倍（圖3-A），而NaCl+MT處理下嫩梢中的MT含量與NaCl脅迫相比略有升高但無顯著性差異，成葉和新根中的MT含量分別比單純NaCl脅迫的減少了25.8%和12.7%（圖3-A）；NaCl脅迫顯著提高了地上部嫩梢和成葉的5-HT含量，比CK提高了45.6%和45.1%，但根系卻比CK降低了72.1%，而NaCl+MT處理的成葉中5-HT的含量比單獨NaCl脅迫提高了1.28倍（圖3-C）；單獨NaCl脅迫的成葉和新根中的的2-OHMel含量分別比CK提高了44%和88.5%，嫩梢中的含量則比CK下降了35.2%；NaCl+MT處理的嫩梢、成葉和新根中2-OHMel含量則分別比單獨NaCl脅迫提高了2.5%、27.3%和44.9%（圖3-E）。

NaCl脅迫14 d后，嫩梢和成葉中的MT含量分別比CK升高了97.9%和46.7%，新根中的含量則比CK減少了90.6%；NaCl+MT處理的新根中MT含量比NaCl脅迫大幅度提高了236%，嫩梢僅增加了4.8%，成葉則減少了50%（圖3-B）。單獨NaCl脅迫的嫩梢和成葉中的5-HT含量在脅迫14 d后分別比CK升高了40.7%和110%，新根中的含量則比CK下降了57.5%（圖3-D）；NaCl+MT處理的嫩梢中的5-HT含量比NaCl脅迫提高了89.5%，成葉和新根中則分別減少了19.0%和31.4%（圖3-D）；鹽脅迫14 d后的嫩梢、成葉和新根中的2-OHMel含量分別比CK升高了3.3%、300%和357%；而NaCl+MT處理的嫩梢和成葉中的2-OHMel含量與單獨鹽脅迫相比分別增加了19.8%和47.8%，新根中的含量則減少了75%（圖3-F）。

圖1 褪黑素、5-羥色胺和2-羥基褪黑素標準樣品色譜圖

圖2 葡萄器官提取物色譜圖

2.2 根施MT對NaCl脅迫下葡萄葉片快速葉綠素熒光動力學曲線的影響

葉綠素熒光蘊含著豐富的與光合原初反應有關的信息，葉綠素熒光誘導動力學曲線（OJIP）能夠提供很多關于光系統II（photosystem II，PSII）的光化學信息，熒光檢測技術已經被廣泛用于檢測PSII活性[22-24]。正常生長的‘威代爾’葡萄葉片葉綠素熒光動力學曲線經JIP-test分析發(fā)現其表現出典型的OJIP曲線形狀，而在NaCl脅迫14 d后用PEA測定發(fā)現，NaCl脅迫導致OJIP曲線發(fā)生明顯變形（圖4-A）。O點熒光強度Fo明顯升高，表明反應中心和天線色素可能發(fā)生了解離，而O點熒光是暗適應后的光合機構全部PSII中心完全開放時的熒光強度，反映了PSII天線色素受激發(fā)后的電子密度；P點熒光強度即Fm值反映了PSII的電子傳遞狀況[25]，NaCl脅迫使葉片的Fm值降低了31.6%，說明PSII的電子傳遞受到了抑制。施加MT處理（NaCl+MT）其Fo值與對照無差異，比單獨NaCl脅迫的Fo值提高了12.9%，表明根施MT可以有效減緩NaCl脅迫對葉片PSII的傷害。

對原始OJIP曲線進行標準化后得到相對熒光曲線（圖4-B），與CK相比，NaCl脅迫使K點和J點分別顯著升高了28%和21.5%，表明放氧復合體（OEC）受到傷害，天線捕獲的光能進入電子傳遞鏈的比例降低；而根施MT使K和J分別降低了23.6%和11.3%，表明MT對電子傳遞鏈有一定保護作用。

CK：對照；NaCl：NaCl處理；NaCl+MT：NaCl和MT處理。不同字母表示處理間差異顯著（P＜0.05）。下同

O：最小熒光數值；K：300 μs時的熒光數值；J：2 ms時的熒光數值；I：30 ms時的熒光數值；P：最大熒光數值

以上結果說明NaCl脅迫降低了PSII的光化學活性，減少了葉片單位面積吸收的光能，而根施MT能夠保護天線色素，緩解NaCl脅迫對葡萄葉片PSII的光化學活性的影響，提高電子傳遞效率。

2.3 根施褪黑素對NaCl脅迫下葡萄葉片Fv/Fm、RC/CSm和ΨO的影響

從熒光動力學曲線可以計算與PSII活性相關的參數, 其中PSII的最大光化學效率（Fv/Fm）反映了PSII反應中心原初光能的轉換效率，RC/CSm反映了葉片單位面積內有活性反應中心的數量。從圖5-A可以看出，NaCl脅迫使葉片Fv/Fm呈下降趨勢，與CK相比降低了11.6%；根施MT減緩了Fv/Fm降低的程度，與NaCl脅迫相比增加了7.4%。

RC/CSm表示葉片單位面積內有活性反應中心的數量，ΨO表示捕獲的激子將電子傳遞到QA以后的其他電子受體的概率[26]。如圖5-B、C所示，NaCl脅迫下，RC/CSm比CK下降了38.4%，ΨO下降了25.3%；根施MT后，RC/CSm和ΨO的值分別比單純NaCl脅迫升高了30%和15.9%。

以上結果表明NaCl脅迫傷害了PSII電子供體側和受體側，根施MT對NaCl脅迫有明顯的緩解作用，提高了NaCl脅迫下葉片的最大光化學效率。

2.4 根施褪黑素對NaCl脅迫下葡萄葉片激發(fā)能分配的影響

光下最大光化學效率Fv'/Fm'反映了開放的PSII反應中心原初光能捕獲效率。與CK相比，NaCl處理顯著降低了Fv'/Fm'的值，達48.8%（圖6-A），而添加MT顯著緩解了NaCl對Fv'/Fm'的抑制，NaCl+MT處理比NaCl處理提高了11.3%。ΦPSII是PSII電子傳遞量子產量，反映PSII反應中心在部分關閉情況下的實際原初光化學效率，NaCl處理使葉片ΦPSII降至0.4，比對照降低了34.9%（圖6-B），根施MT后使ΦPSII值升高了22.9%。

NaCl脅迫下葉片光化學淬滅qP降低了18.3%，非光化學淬滅NPQ顯著提高了333%；而根施MT使qP升高了9.6%，NPQ降低了207%（圖6-C、D）。表明NaCl脅迫下葉片吸收的光能更多的以熱耗散形式消耗，根施MT后，葉片吸收的光能被用來進行碳固定的能量顯著增加，而用來熱耗散的相應減少。

2.5 根施褪黑素對NaCl脅迫下葡萄葉片電子傳遞速率的影響

如圖7所示，NaCl脅迫下，光系統I電子傳遞速率ETR（I）和光系統II電子傳遞速率ETR（II）明顯低于對照，光強最大時PSI和PSII的電子傳遞速率分別比對照下降了34.9%和49.4%，表明NaCl脅迫對葉片光系統造成了傷害，電子傳遞速率受到了抑制。根施MT后，光強最大時的ETR（I）和ETR（II）分別比Nacl脅迫升高了28%和46.9%，表明NaCl脅迫下MT對光系統有一定的保護作用，提高了電子傳遞速率。

3 討論

3.1 根施褪黑素加速了NaCl脅迫下葡萄內源MT的代謝和運轉

非生物脅迫能夠誘導植物內源MT的積累。前人研究表明，NaCl脅迫顯著提高了向日葵[9]及羽扇豆[10]等植物中的MT含量；高溫和強光誘導產生的丙二醛（MDA）與上調MT的合成直接相關[27]；暴露在紫外光下的植株MT含量更高, 這被認為是MT清除了紫外光輻射誘導產生的自由基從而產生了光保護作用[28]。Mukherjee等[9]研究表明NaCl脅迫提高了向日葵根部和子葉中5-HT和MT的含量，同時MT合成酶HIOMT的活性也顯著提高。本試驗結果顯示，當葡萄植株遭受到NaCl脅迫時，各器官中的MT及其代謝物水平發(fā)生相應改變，NaCl脅迫前期（7 d），植株各部位的內源MT含量都有所增加，這與在羽扇豆上的研究結果一致[10]；脅迫14 d后，各器官中的MT含量與7 d時相比顯著下降，說明脅迫后期MT大量消耗用于抵御NaCl脅迫。分析MT合成前體物質5-HT的含量發(fā)現，脅迫7 d時地上部器官5-HT含量顯著升高，新根中的含量一直低于對照；脅迫14 d后，成葉中的5-HT含量顯著增加，嫩梢中的含量與7 d時相比有所下降但仍高于對照水平，新根中也有所增加但低于對照。WANG等[29]的研究發(fā)現，線粒體作為褪黑素合成的主要部位，重組線粒體內干旱誘導型的MzSNAT5蛋白在35℃下表現出高的催化5-HT對N-乙酰維生素的酶活性，使植物線粒體內的MT合成增加，從而作為一種有效的自由基清除劑減少植物在脅迫下產生的活性氧升高引起的氧化應激反應，提高植株的抗逆性。而MT的主要代謝產物2-OHMel在植株不同器官及脅迫不同時間的變化規(guī)律與MT及5-HT明顯不同，有隨著脅迫時間延長而增加的趨勢，NaCl脅迫14 d后，2-OHMel在成葉和新根中大量積累，嫩梢中的略有增加，表明成葉和新根中MT代謝旺盛，大量消耗。

圖5 根施褪黑素對NaCl脅迫下葡萄葉片Fv/Fm、RC/CSm和ΨO的影響

圖6 根施褪黑素對NaCl脅迫下葡萄葉片熒光淬滅的影響

圖7 根施褪黑素對NaCl脅迫下葡萄葉片電子傳遞速率的影響

與NaCl脅迫相比，根施MT后并沒有直接促進前期各器官MT含量的增加，但卻促進了MT合成前體物質5-HT在成葉中的積累，以及代謝產物2-OHMel在成葉和新根中的積累，嫩梢和新根中的5-HT則顯著下降，表明施加外源MT促進了成葉和新根中MT的代謝；隨著脅迫時間延長，各器官中的MT含量持續(xù)下降，但新根中的MT含量顯著高于單獨NaCl脅迫處理的；嫩梢和成葉中的2-OHMel大量積累，新根中的顯著下降。說明施加外源MT加速了植株MT的代謝和運轉，表現為新根中的MT含量升高，嫩梢和成葉中的MT大量消耗，代謝為2-OHMel，提高了植株對NaCl脅迫的抗性。

3.2 根施褪黑素緩解了NaCl脅迫對葡萄熒光特性的影響

鹽脅迫可破壞植株離子穩(wěn)態(tài)，使Na+含量升高，K+含量下降，導致滲透脅迫[30]。隨著脅迫時間的延長，植物體內過氧化氫（H2O2）、MDA含量和超氧陰離子（O-2）合成速率均顯著上升[31]，活性氧誘發(fā)膜脂過氧化、膜結合酶活性降低，膜結構破壞，膜透性增加，葉片細胞結構發(fā)生顯著變化[32-33]。葉綠素熒光動力學參數是反映植物對光能的吸收、轉化、傳遞、分配情況的靈敏探針，當發(fā)生脅迫時，PSII反應中心會造成損傷，使光合電子傳遞和PSII的光合作用活力受到抑制，光合受阻，光合速率下降[34-35]。本研究發(fā)現，NaCl脅迫下，葡萄葉片OJIP曲線形狀發(fā)生改變，J點和K點明顯上升，RC/CSm和ΨO下降，表明PSII 活性降低，電子受體側和供體側活性均受到抑制[36]，光合機構出現損傷。同時ΦPSII、Fv'/Fm'、qP和表觀電子傳遞速率顯著降低，NPQ升高，說明脅迫抑制了PSII和PSI的電子傳遞[37-38]，降低了光化學量子產量，天線色素的激發(fā)能用于光化學反應途徑減少，非光化學淬滅量增加。一方面是光合機構受損而導致光化學反應能力降低，天線色素激發(fā)能向非光化學熱耗散轉化；另一方面也是植物在非生物脅迫下通過熱耗散消耗過剩光能，對光合機構進行光保護的應激反應，這與杜天浩等[39]在番茄上的研究結果一致。

MT作為一種有效的內源性自由基清除劑、有價值的啟動劑，能直接清除脅迫產生H2O2等活性氧[40-41]，調節(jié)代謝體內平衡包括氮和主要碳水化合物代謝，離子轉運，激素代謝和光合作用的轉錄物等，增加光合作用和碳水化合物的代謝或通過調節(jié)抗氧化系統相關基因的轉錄水平，調節(jié)轉錄因子、酶和各種信號分子[42-45]，提高植物的抗氧化能力，增加光合作用和碳水化合物的代謝，加強光合運轉效率，從而緩解脅迫對植株造成的傷害[46-47]。本研究結果顯示，根施MT能緩解NaCl脅迫下葉片OJIP曲線中K點的上升幅度，受體側電子傳遞至QA以后的其他電子受體的概率（O）和單位面積有活性反應中心數量（RC/CSm）顯著升高，PSI電子傳遞速率ETR（I）顯著升高，表明MT對電子傳遞鏈具有一定的保護作用，電子傳遞活性有所提高[37,48]，葉片吸收的光能更多的用于光合電子傳遞，提高了葉片的光化學活性，減緩了NaCl脅迫造成的光系統損傷，增加了植株的光合性能。

4 結論

NaCl脅迫嚴重抑制葡萄葉片光系統活性，但其誘導了植物源褪黑素（MT）的積累，根施MT處理能促進MT在植株各器官中的代謝和運轉；另外，根施MT緩解了NaCl對光系統活性的抑制程度，提升了葉片最大熒光Fm和光下最大光化學效率Fv'/Fm'，緩解了NaCl脅迫對葡萄葉片光合作用的傷害程度。表明MT能提高葡萄植株對NaCl脅迫的耐受性。

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（責任編輯 趙伶俐）

Effect of Root-Applied Melatonin on Endogenous Melatonin and Chlorophyll Fluorescence Characteristics in Grapevine under NaCl Stress

BIAN FengE, XIAO QiuHong, HAO GuiMei, SUN YongJiang, LU WenLi, Du YuanPeng, ZHAI Heng

(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong)

【Objective】The content of the endogenous MT, the key metabolites, and the effect of photoinhibition on the leaf were studied in grapevine under NaCl stress, and the results will provide a reference for the application of MT in the future.【Method】One-year old potted ‘Vidal Blanc’ grapevines (cv. Vidal Blanc) were used as materials. The grapevines were irrigated with NaCl (100 nmol·L-1) and NaCl+MT (100 nmol·L-1), and then the content and distribution of the endogenous MT, MT precursors serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT), and then the main metabolites of melatonin 2-hydroxymelatonin (2-OHMel) in different organs of different treatment plants, and the chlorophyll fluorescence characteristics in leaves and the metabolism of endogenous MT were measured and analyzed.【Result】The results showed that there were obvious temporal and spatial changes in the content of endogenous MT, 5-HT and 2-OHMel in different organs of plants under NaCl stress, and the MT content of roots reached the peak value after 7 days treatment, followed by the shoots, and the content of leaves were the lowest. With the prolongation of the stress time, the MT content in the roots decreased significantly, while the 5-HT content in the shoots increased. Compared with the only NaCl stress, the 5-HT content in the leaves, the MT content in the roots and the contents of 2-OHMel in the shoots and leaves increased significantly after root-applied MT. The shape of OJIP curve was significantly changed, Fmand leaf maximum photochemical efficiency (Fv/Fm) significantly decreased by 31.6% and 11.6%, the non-photochemical quenching (NPQ) was significantly increased, and the linear electron transport rate of PSI (ETR(I)) and PSII (ETR(II)) were significantly decreased under NaCl stress. While the Fmand Fv/Fmin leaves were reduced by 12.9% and 7.3%, the increase of K and J points in the OJIP curve was significantly reduced by 23.6%and 11.3%, and the utilization efficiency of the light linear and electron transfer rate is significantly improved under NaCl stress and MT treatment.【Conclusion】NaCl stress induced the inhibition of photosystem activity in grapevine leaves, but promoted the synthesis of MT in the plant. Photoinhibition was alleviated under MT treatment, root-applied MT promoted the metabolism and distribution of MT in various organs of plants, alleviated the damaged degree of photosynthesis of grapevine leaves by NaCl stress.

NaCl stress; grapevine; chlorophyll fluorescence; melatonin; 5-hydroxytryptamine; 2-hydroxymelatonin

2017-07-20；

2017-10-12

國家現代葡萄產業(yè)技術體系建設專項（CARS-29）、長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（IRT15R42）

卞鳳娥，E-mail：bianfengeee@163.com。

翟衡，Tel：0538-8241335；E-mail：zhaih@sdau.edu.cn