(黑龍江省農墾科學院測試化驗中心，佳木斯 154007 )

草甘膦(Glyphosate，PMG)又名鎮(zhèn)草寧、農達，分子式為C3H8NO5P，是1971年美國孟山都公司研發(fā)的一種有機磷除草劑，因其兼具內吸、傳導性、滅生性及非選擇性，同時不易在生物體內累積，故廣泛應用于農業(yè)生產中一年生和多年生雜草防除，是目前世界上應用最廣、生產量最大的除草劑[1,2]。草甘膦及其在植物中的主要代謝物氨甲基膦酸(Aminomethyl-phosphonic acid，APMA，分子式為CH6NO3P)均屬于強極性、易溶于水的高沸點化合物，具有不易揮發(fā)、無紫外吸收等特性，因此用常規(guī)方法分析檢測十分困難[3]。

目前， PMG和APMA殘留檢測的方法主要有色譜法(GC[4]、LC[5]、IC[6])、質譜法(GC/MS[7]、ICP/MS[8]、LC/MS/MS[9-13])、光譜法[14]等。光譜法雖然操作簡便，但其靈敏度不高，而離子色譜法[6]只能適用于水樣等簡單基質，用于植物源樣品檢測時干擾太大；用氣相色譜和氣質聯(lián)用技術檢測時，需要將PMG和APMA衍生轉化為可氣化物質，其引入試劑多、過程相對繁瑣，效率較低[4,7]；用LC/MS/MS法直接檢測時[13]，由于PMG和APMA分子量(分別為169、111)均較小，其主要碎片離子的質荷比多在100以下，檢測實際樣品時受基質干擾嚴重，靈敏度較低，因此柱前衍生——液質聯(lián)用法成為近年來國內外檢測PMG和APMA殘留的主流方法[9-12]。以9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)做為衍生試劑，在硼酸鹽緩沖溶液中與PMG和APMA水提取液相容性好，過程簡單，其衍生產物在LC/MS/MS中響應信號高，碎片離子干擾小，適合定性定量分析。

目前，采用柱前衍生—LC/MS/MS法檢測茶葉、稻米等基質中PMG和APMA殘留的報道很多[9-13]，專門針對大豆基質的報道很少。行業(yè)標準[15]的適用范圍雖然包括了大豆基質，但該方法在實驗過程中試劑用量大、操作繁瑣(反復調pH值)、衍生時間長(需過夜)，尤其是使用陽離子交換柱(CAX)洗脫時需要加入11 mL 1%的鹽酸甲醇水(20/80，v/v)，水分含量過高導致旋轉蒸發(fā)時很難蒸干，容易造成PMG和APMA回收率不穩(wěn)定。本文專門針對大豆這類高蛋白、高脂肪含量的特殊基質，采用純水作為提取試劑，二氯甲烷去除脂溶性雜質，C18固相萃取小柱凈化后采用FMOC-Cl衍生，最后用UPLC/MS/MS測定。該方法前處理過程簡便、快速、靈敏度高，適用于大豆中PMG和APMA的殘留檢測。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

草甘膦、氨甲基膦酸(純度≥99%，德國Dr.Ehrensorfer公司)；FMOC-Cl(純度>99%，Sigma公司)，使用時配置成10g/L的丙酮溶液；乙腈、二氯甲烷、甲酸、乙酸銨(色譜純，美國Fisher公司)；十水四硼酸鈉(優(yōu)級純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，使用時配置成50g/L的水溶液；實驗用水為Millipore純水儀制備；C18固相萃取小柱(200mg/3ml，美國Agilent公司)。

1.2 儀器與設備

Acquity UPLC型超高效液相色譜儀(Waters公司)；XEVO TQ-S三重四級桿質譜儀(Waters公司)；CR21GⅢ型高速離心機(HITACHI公司)；KQ5200DB型臺式超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)；渦旋混合器(IKA公司)。

1.3 標準溶液的配置

分別稱取草甘膦和氨甲基膦酸標準品10mg(精確到0.1mg)，用水溶解并定容至10mL，配置成質量濃度為1.0 mg/mL標準儲備液，于4℃冰箱保存待用；使用時用水逐級稀釋成所需濃度的混合標準工作液。

1.4 樣品前處理

提取：稱取粉碎均勻后的試樣1.0g(精確到0.01g)于50mL聚乙烯離心管中，加入10.0mL超純水，渦旋混合30 s并超聲提取20 min后，以10000 r/min離心3 min，將上清液轉移至另一離心管中，加入5 mL二氯甲烷渦旋混合30 s，以10000 r/min離心3 min，上清液待凈化。

凈化：取2.5 mL上清液加入到C18固相萃取柱(使用前依次用3mL甲醇和3mL超純水活化)中，棄去最初的幾滴流出液(約0.5 mL)，將剩余部分用5 mL玻璃管收集，待衍生。

衍生：取1.0 mL凈化液于5 mL離心管中，依次加入1.0 mL 50g/L的硼酸鈉溶液和1.0 mL 10g/L的FMOC-Cl衍生液，混勻后室溫下衍生2 h，以10000 r/min離心3 min，取上清液過0.22m有機系微孔濾膜后，供UPLC/MS/MS分析測定。

1.5 液相色譜及質譜條件

液相色譜：色譜柱:WatersBEH C18(1.7 μm，50mm×2.1mm)；柱溫：30℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：2 μL；流動相A：乙腈；流動相B： 2 mmol /L 的乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～0.5min，10% A；0.5～3. 0 min，10%～100% A；3. 0 ～4. 0 min，100%A，4 ～4.1min，100% A～10% A，4.1 ～5.0min 10% A。

質譜：離子源：電噴霧離子源( ESI+) ；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測( MRM)；毛細管電壓：3.2 kV；離子源溫度：150℃；去溶劑氣溫度：500℃；去溶劑氣流量：1000 L /h；定性、定量離子對及碰撞能量見表1。

表1 PMG-FMOC和 AMPA-FMOC的MRM質譜參數(shù)

﹡quantitative ion

2 結果與討論

2.1 色譜及質譜條件的優(yōu)化

流動相的選擇：對比了酸性體系(0.1%甲酸水溶液)與非酸性體系(乙酸銨水溶液)分別于甲醇、乙腈的流動相體系組合，結果發(fā)現(xiàn)兩種分析物在酸性體系中分離效果欠佳，峰形拖尾嚴重，而在非酸性體系中其色譜分離效果得到明顯改善，峰形對稱；乙腈比甲醇體系洗脫能力更強，可以有效縮短分析時間。故本研究采用乙酸銨水溶液+乙腈流動相體系，并比較了1、2、5 mmol/L三種乙酸銨濃度與乙腈的組合，結果發(fā)現(xiàn)隨著乙酸銨濃度的增加，目標物響應值雖略有提高但相差不大，而同時儀器背景值卻顯著升高，綜合考慮目標物信號強度、信噪比、色譜分離效果以及分析時間等因素，本實驗最終選擇了2 mmol /L 乙酸銨水溶液+乙腈分析體系。

質譜的選擇：PMG、 AMPA對應的衍生物PMG-FMOC、AMPA-FMOC分子量分別為391、333。用超純水配置10 mg/L 混合標準溶液直接注射到質譜中，在正負離子模式下分別進行母離子全掃描，發(fā)現(xiàn)正離子模式下392、334具有很好的響應，然后分別以392、334為母離子進行子離子全掃描，各得到兩組豐度高、干擾小的子離子對進行MRM監(jiān)測，最終確定的質譜條件見表1。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

提取溶液的選擇：PMG和APMA屬于強極性物質，易溶于水，難溶于有機溶劑，故一般采用極性溶劑提取，如純水及KOH、NaHCO3溶液等[9-14]。實驗發(fā)現(xiàn)，用堿性溶液提取后，大豆中脂肪、蛋白等物質會與堿性物質發(fā)生反應，導致離心后的提取液異常渾濁，不利于后期凈化和衍生，因此本實驗采用純水作為提取試劑，再經二氯甲烷液液萃取去除脂溶性雜質。

凈化柱的選擇：研究發(fā)現(xiàn)，對提取后的溶液不經SPE凈化直接進行衍生， PMG和APMA的回收率均不足30%，且精密度很差，這可能是由于大豆中富含脂肪、蛋白質等物質干擾衍生過程，故本實驗比較了對脂肪、蛋白質有很好去除效果的C18、中性Al2O3、HLB固相萃取SPE柱的凈化效果，結果發(fā)現(xiàn)提取液經中性Al2O3凈化后，PMG和APMA幾乎檢測不到；而C18凈化后目標物回收率為92.7%、90.8%，HLB為83.6%、80.5%。故本實驗選取了凈化效果更好，成本相對低廉的C18固相萃取小柱。

衍生條件的優(yōu)化：FMOC-Cl的衍生機制是在堿性環(huán)境下(pH=9.0)通過FMOC-Cl基團取代目標化合物氮原子上的氫，從而生成較穩(wěn)定的化合物FMOC-Cl。參照行業(yè)標準[15]及文獻報道[9-12]所選用的緩沖液濃度，本實驗采用50g/L的硼酸鈉水溶液緩沖液體系，設置的衍生試劑質量濃度為1、2、5、10、20 g/L FMOC-Cl丙酮溶液，按照本文1.4步驟對PMG和APMA質量濃度為0.5 mg/L的純水溶液和大豆空白基質溶液分別進行衍生，結果見圖1。結果表明，在純水溶液中，F(xiàn)MOC-Cl濃度為2 g/L時，PMG和APMA的峰面積已達到最大，隨著衍生化試劑濃度的升高，其峰面積無明顯變化；而在大豆空白基質溶液中，F(xiàn)MOC-Cl低濃度(1、2g/L)時，PMG和APMA幾乎檢測不到，其峰面積隨衍生化試劑濃度增加而加大，濃度到達一定程度(10 g/L)時，峰面積不再變化。產生這種現(xiàn)象的原因，可能是由于盡管大豆提取液經過了二氯甲烷和C18小柱的凈化，但還是會有少量水溶性蛋白、脂肪等雜質殘留在凈化液中，這些雜質可能會與衍生試劑反應，影響目標物的衍生效果。研究還發(fā)現(xiàn)，當FMOC-Cl濃度為20 g/L時，得到的PMG和APMA色譜峰產生拖尾現(xiàn)象，可能是由于衍生試劑化學性質較活潑，其用量大時，過量的FMOC-Cl會迅速轉化成FMOC-OH，干擾目標物峰形。在50g/L硼酸鈉水溶液、10 g/L FMOC-Cl丙酮溶液條件下，考察不同時間(0.5h、1h、2h、4h、8h和16h)對衍生效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)，2 h后PMG和APMA的測定值無明顯增加。因此，本實驗最終選定的衍生條件為50g/L硼酸鈉水溶液、10 g/L FMOC-Cl丙酮溶液，室溫下衍生2 h。

圖1 衍生試劑濃度對不同基質中PMG和APMA衍生效率的影響

2.3 基質效應的考察

基質效應(主要是抑制)是LC/MS/MS儀器檢測時經常遇到的現(xiàn)象。由于本實驗采用極性很強的水作為提取劑，大豆中的色素、脂肪酸等極性較強的物質也有少部分進入到最后的上機液中，在離子化帶電過程中會與目標物產生競爭，抑制目標物的離子化效率。實驗考察了用PMG和APMA的純水標樣去標定經過本文1.4步驟處理后的大豆空白基質溶液配置的同濃度標樣，其色譜圖見圖2。結果發(fā)現(xiàn)，PMG在純水和大豆空白基質中峰面積基本一致，而APMA在大豆空白基質中的峰面積僅為純水中的55.7%，產生了明顯的基質抑制效應。為了消除基質干擾，本實驗選用大豆樣品空白基質配置不同濃度的標準溶液來繪制標準曲線進行校準。

圖2 PMG和APMA標準溶液(0.02 mg/L)MRM色譜圖

2.4 線性范圍和定量限

用大豆空白基質溶液分別配置0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的PMG和APMA混合標準溶液，按本文1.4步驟衍生后測定，以各自定量離子的峰面積為Y對應質量濃度X(mg/L)做標準曲線，得到的線性方程和相關系數(shù)見表2。結果表明，這兩種物質在0.001～0.5 mg/L濃度范圍內線性良好，相關系數(shù)R分別為0.9996和0.9993。以10倍信噪比(S/N)計算，該方法PMG和APMA的定量限(LOQ)均為0.01 mg/kg。

表2 PMG和APMA大豆基質標準溶液的線性方程、相關系數(shù)和定量限(LOQ)

2.5 回收率和精密度

稱取大豆空白試樣1.0 g，分別添加0.02、0.2、2 mg/kg水平的PMG和APMA混合標樣，每個水平重復6次，按照本文1.4步驟前處理方法處理后上機檢測，實驗結果見表3。從表3可以看出，PMG的平均回收率為80.2%～91.5%，相對標準偏差(RSD，n=6)為3.37%～6.96%；APMA的平均回收率和RSD分別為77.7%～89.3%和4.11%～8.27%。

表3 大豆中PMG和APMA的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

3 結語

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC/MS/MS)測定大豆中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留的分析方法。該方法靈敏度高，PMG和APMA定量限(LOQ)達到0.01 mg/kg，能滿足大豆產品相關限量標準要求。同時該方法具有較高的準確度和精密度，前處理步驟簡單快速，特別適合大批量大豆樣品的檢測。

[1]蘇少泉,滕春紅. 草甘膦應用現(xiàn)狀與未來發(fā)展[J].世界農藥, 2014,36(3):8-11.

[2]Botero A M, Ibanez M, Sancho J V, et al. Direct liquid chromatography-tandem mass spectrometry determination of underivatized glyphosate in rice, maize and soybean[J]. Journal of Chromatogrraphy A, 2013, 1313: 157-165.

[3]Goodwin L, Startin J R, Kelly B J, et al. Analysis of glyphosate and glufosinate by capillary electrophoresis-mass spectrometry utilizing a sheathless microelectrospray interface[J]. Journal of Chromatogrraphy A, 2003, 1004: 107-119.

[4]胡繼業(yè),趙殿英,寧君,等. 氣相色譜-氮磷檢測器測定草甘膦在土壤和蘋果中的殘留量[J].農藥學學報, 2007, 9(3):285-290.

[5]杭學宇,汪怡,王芹,等. 柱前衍生-固相萃取-高效液相色譜熒光法測定蔬菜中草甘膦[J]. 食品安全質量檢測學報,2016,7(5):1822-1826.

[6]邱慧敏, 耿金菊, 韓超, 等. 串聯(lián)毛細管離子色譜法測定水中亞磷酸根、磷酸根、草甘膦和氨甲基膦酸[J].分析化學, 2013(12):1910-1914.

[7]AOAC Official Method 2000.05. Determination of Glyphosate and Aminomethylphosphonic Acid in Crops, 2000.

[8]Guo Z X, Cai Q T, Yang Z G. Determination of glyphosate and phosphate in water by ion chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry detection[J].Journal of Chromatogrraphy A,2005,1100: 160-167.

[9]吳曉剛, 陳孝權, 肖海軍, 等. 柱前衍生-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時檢測茶葉中草甘膦和草銨膦的殘留量[J].色譜, 2015(10):1090-1096.

[10] 馮月超,馬立利,賈麗, 等.多壁碳納米管分散固相萃取-液質聯(lián)用技術測定茶葉中草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸殘留量[J]. 食品安全質量檢測學報, 2014, 5(4):1147-1154.

[11]諸力,陳紅平,周蘇娟, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定不同茶葉中草甘膦、氨甲基膦酸及草銨膦的殘留[J]. 分析化學, 2015(2):271-276.

[12] 曹趙云, 牟仁祥, 陳銘學. 液相色譜-串聯(lián)質譜法測定稻米中的草甘膦和氨甲基膦酸殘留[J].色譜, 2010, 28(8):743-748.

[13]周爽, 徐敦明, 林立毅, 等. 反反相色譜-串聯(lián)質譜法直接測定植物源性食品中草甘膦及其代謝物殘留[J]. 分析測試學報,2013, 32(2):199-204.

[14]李國鵬, 周彩榮, 石曉華, 等. 分光光度法測定草甘膦生產廢水中草甘膦和甘氨酸的含量[J]. 鄭州大學學報(理學版) ,2012, 44(2):81-84.

[15] SN/T 1923-2007進出口食品中草甘膦殘留量的檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法.