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(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心，重慶 400016)

1 引言

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 ( methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA) 是引起院內(nèi)感染的重要病原菌[1]。除對(duì)甲氧西林耐藥外，MRSA對(duì)常用的抗生素如β內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖甙類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等均具有抗性，并可引起敗血癥、壞死性肺炎和中毒性休克綜合征等危及生命的感染性疾病[2-4]。因此，MRSA菌株的可靠檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)感染早期階段的有效治療至關(guān)重要[5]。迄今為止，MRSA鑒定的檢測(cè)方法主要是基于培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)方法和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)。然而，基于培養(yǎng)MRSA的微生物檢測(cè)方法存在靈敏度低，操作復(fù)雜且耗時(shí)(24～72小時(shí))等不足[6]。雖基于PCR的基因檢測(cè)方法因其高靈敏度和高時(shí)效而被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但仍然存在儀器設(shè)備昂貴和標(biāo)本易交叉污染等缺點(diǎn)[7]。因此，開發(fā)一種方便且敏感檢測(cè)MRSA的新方法依然很有必要。

DNA檢測(cè)已普遍用于病原體分析、遺傳疾病診斷和法醫(yī)檢測(cè)[8]。mecA(methicillin determinant A) 是染色體上編碼青霉素結(jié)合蛋白的基因，其與MRSA耐藥性密切相關(guān)，因而成為MRSA識(shí)別的“金標(biāo)準(zhǔn)”[9]。在本研究中，將編碼青霉素結(jié)合蛋白基因mecA作為檢測(cè)目標(biāo)(Target)。

納米技術(shù)的出現(xiàn)為通過(guò)信號(hào)放大策略檢測(cè)生物分子開辟了新的途徑[10]。金納米粒子(AuNPs)是一種穩(wěn)定的納米材料，擁有很好的生物相容性，它可以與很多生物分子共軛結(jié)合并且不改變這些分子的性質(zhì)和活性。為了提高金納米粒子表面生物分子的結(jié)合率，Esumi K等[11]合成了以PAMAM dendrimers 聚合物作為載體的納米金功能化的樹狀大分子，Qiu等[12]基于納米金功能化的樹狀大分子，將多個(gè)辣根過(guò)氧化物酶通過(guò)金硫鍵與金氨鍵固定在聚樹狀大分子上，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)境中汞離子的靈敏檢測(cè)。鑒于此，該研究工作欲引入納米金功能化樹狀大分子以提高酶性分子載量，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。

血糖儀由于其便攜性，快速測(cè)定，低成本和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)而受到了廣泛關(guān)注[13]。目前，基于個(gè)人血糖儀已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多種目標(biāo)物的檢測(cè)。Yu Xiang和Yi Lu[14]利用個(gè)人血糖儀結(jié)合功能DNA傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)鈾離子、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、可卡因、干擾素-γ等分析物的檢測(cè)。Qing Wang 等[15]使用適體和商業(yè)化的血糖儀對(duì)心臟生物標(biāo)志物肌紅蛋白進(jìn)行靈敏監(jiān)測(cè)。

本工作將血糖儀與納米金功能化樹狀大分子二者優(yōu)勢(shì)有機(jī)結(jié)合，利用血糖儀建立了一種基于蔗糖酶修飾的納米金功能化樹狀大分子對(duì)mecA基因的靈敏檢測(cè)方法，如圖1所示。將單鏈核酸DNA(MG1)通過(guò)親和素-生物素作用固定于鏈酶親和素修飾的磁珠表面，DNA(MG2)通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與MG1部分結(jié)合，形成帶有toehold的DNA雙鏈。蔗糖酶通過(guò)其半胱氨酸以及賴氨酸殘基，而DNA(MG3)通過(guò)其巰基基團(tuán)分別與金納米粒子相互作用，共同結(jié)合在納米金功能化樹狀大分子(Au-PAMAM)表面，形成蔗糖酶修飾的納米金功能化樹狀大分子(Invertase-labeling gold-dendrimer)。蔗糖酶修飾的納米金功能化樹狀大分子通過(guò)信號(hào)核酸探針MG3與核酸MG2的toehold雜交結(jié)合，從而把修飾有蔗糖酶的納米金功能化樹狀大分子固定在磁珠表面。當(dāng)檢測(cè)靶基因存在的條件下，其與捕獲核酸探針MG2特異性結(jié)合，將蔗糖酶修飾的納米金功能化樹狀大分子置換下來(lái)，經(jīng)磁場(chǎng)分離后，上清液中存在的蔗糖酶催化底物蔗糖產(chǎn)生可直接檢測(cè)的葡萄糖信號(hào)，實(shí)現(xiàn)血糖儀對(duì)mecA基因的定量檢測(cè)。

圖1 基于蔗糖酶修飾的納米金功能化樹枝狀分子對(duì)mecA 基因檢測(cè)原理圖

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

鏈酶親和素修飾的磁珠(平均直徑1 μm)，美國(guó)紐英倫生物技術(shù)有限公司；聚樹狀大分子(乙二胺核，5.0代，甲醇中含量5 wt%)，四氯代氫金合四水化物(HAuCl4.4H2O)，酵母蔗糖酶(Grade Ⅶ invertase from baker’s yeast)，NaBH4，美國(guó)西格瑪公司；Tris-HCl 緩沖液(1 M, pH 7.4) ，PBS緩沖液(0.01 M, pH 7.2-7.4)，纖維素透析袋(分子量截留值為12,000-14,000)，北京索萊寶科技有限公司；三氯乙基磷酸酯(TCEP)，核酸，上海生工生物工程有限公司。

Target: 5′-ATT GGG ATC ATA GCG TCA TTA-3′；

磁珠結(jié)合的核酸MG1:5′-TCA CAG ATG AGT AAA AAA AAA AAA-biotin- 3′；

捕獲核酸探針MG2:5′-TTT TTT ACT CAT CTG TGA TAA TGA CGC TAT GAT CCC AAT-3′；

信號(hào)核酸探針MG3：5′-HS-AAA AAA AAA AAA ATC ATA GCG TCA TTA-3′；

活力型血糖儀：ACCU-CHEK Active，羅氏公司；紫外可見吸收光譜儀：NANO-DROP1000，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；透射電子顯微鏡：H600，日本日立公司；電化學(xué)工作站：CHI660D，上海辰華儀器有限公司；電泳儀：DYY-6C，北京市六一儀器廠；成像儀：美國(guó)伯樂(lè)公司。

2.2 納米金樹枝狀分子(Au-PAMAM)的制備

Au-PAMAM根據(jù)基于聚樹狀大分子為模板的原位還原法制備[16]。首先，將新鮮制備的HAuCl4溶液(10 mL, 20 mM)與2 mL超純水加入12.5 mLPAMAM溶液中，同時(shí)混合溶液攪拌1 h。然后將新鮮制備并儲(chǔ)存于4 ℃中的NaBH4迅速加入到上述溶液中，并攪拌反應(yīng)30 min。當(dāng)溶液的顏色從淺黃色變?yōu)榧t褐色時(shí)說(shuō)明Au-PAMAM已經(jīng)形成。在這個(gè)過(guò)程中，吸附于PAMAM樹狀大分子上的Au(Ⅲ)被還原為零化合價(jià)的Au0。隨后，透析除去雜質(zhì)和游離的金納米顆粒。最后將以上制備的Au-PAMAM復(fù)合物分散于5 mL超純水中，并置于棕色瓶中4℃ 儲(chǔ)存。

2.3 蔗糖酶與DNA修飾的納米金功能化樹狀大分子的制備

利用蔗糖酶上的半胱氨酸或賴氨酸殘基與金納米粒子間的相互作用，以及DNA上的巰基基團(tuán)與金納米粒子間的相互作用制備得到蔗糖酶與DNA修飾的納米金功能化樹狀大分子[16]。首先，將蔗糖酶(40 μL , 1.0 mg/mL)加入到200 μLAu-PAMAM與200 μLPBS(0.01 M, pH 7.4)共400μL的混合液中，并于4 ℃條件下孵育30 min。隨后10 μL 的1.0 μM信號(hào)核酸MG3(溶液含有10 mM Tris-HCl，10 mM TCEP， 0.1 M NaCl，pH 7.4)加入到上述混合液中，并于同樣的條件下孵育4 h(注意：在MG3修飾在金納米粒子表面之前，巰基化的MG3需要經(jīng)過(guò)TCEP于室溫條件下預(yù)處理1 h，以還原形成的二硫化物)。

2.4 適配體磁珠(MG2-MB)的制備

取30 μL 4 mg/mL的鏈霉親和素磁珠溶液，用PBS緩沖液洗3次。然后將4 μL100uM(終濃度3.2 μM)的MG1加至30 μL磁珠溶液中，于37 ℃下孵育30 min，然后磁分離，洗去過(guò)量的MG1；緊接著4 μL100 μM的適配體核酸MG2加入磁珠中，并在37℃下反應(yīng)30 min，磁分離，除去過(guò)量的MG2。最終將制備的MG2-MB分散于120 μLPBS溶液中。

2.5 蔗糖酶修飾的磁珠復(fù)合物(I-MB)的制備

120μL的磁珠溶液去除緩沖液后，60 μL的Au-PAMAM復(fù)合物溶液加入其中，混合液于37 ℃下反應(yīng)1 h。經(jīng)磁場(chǎng)分離后去除未結(jié)合的Au-PAMAM復(fù)合物(用PBS緩沖液清洗3次)，最后將制備好的I-MB分散于60 μL的PBS溶液中，并儲(chǔ)存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.6 基于金功能化樹狀大分子的血糖儀對(duì)靶基因的檢測(cè)

取10 μL 的I-MB，經(jīng)磁場(chǎng)分離后加入10 μL不同濃度的靶基因，并于37 ℃孵育1 h。磁場(chǎng)分離后，取5 μL的上清液與1.7 μL的蔗糖(2 M)混合，并于37 ℃孵育16 h。最終取2 μL反應(yīng)后的混合液用于血糖儀檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 Au-PAMAM的表征

采用透射電鏡(TEM)、電化學(xué)阻抗譜(EIS)和紫外可見吸收光譜(UV-vis)對(duì)Au-PAMAM 進(jìn)行形態(tài)學(xué)表征。如圖2A所示，Au-PAMAM 的透射結(jié)果顯示，其平均尺寸約3 nm。采用EIS對(duì)合成的Au-PAMAM 進(jìn)行表征，可見裸金電極其電荷轉(zhuǎn)移值(charge transfer resistance, Rct)比較大(圖2B曲線c)；當(dāng)裸金電極上修飾PAMAM后，由于PAMAM具有很強(qiáng)的電子傳遞能力，其Rct幾乎成一條直線(曲線a)；而當(dāng)Au-PAMAM固定在裸金電極上時(shí)，其Rct稍有增加，位于單純的PAMAM與裸金電極之間(曲線b)。同時(shí)，采用紫外可見吸收光譜對(duì)PAMAM與Au-PAMAM進(jìn)行表征(圖2C)。單純的PAMAM特征性吸收峰在283 nm處，當(dāng)金納米粒子原位還原在PAMAM上形成Au-PAMAM后，其特征性吸收峰由單峰變成了雙峰，分別是286 nm與520 nm。結(jié)果與之前報(bào)道的相一致[15-16]。這些結(jié)果都表明金納米粒子在PAMAM上已經(jīng)還原成功。

圖2 Au-PAMAM的光學(xué)與電化學(xué)表征A.Au-PAMAM的透射電鏡圖；B. EIS電化學(xué)表征圖：(a)PAMAM，(b) Au-PAMAM，(c)裸金；C. 紫外吸收光譜圖：(a) PAMAM，(b)Au-PAMAM

3.2 核酸雜交的瓊脂糖凝膠電泳表征

瓊脂糖凝膠電泳用以證實(shí)Target與MG2的雜交并釋放出MG3(圖3)。圖中條帶1到4分別表示Target，MG1，MG2和MG3。當(dāng)MG1與MG2雜交后產(chǎn)生了新的條帶5，此產(chǎn)物進(jìn)一步與MG3雜交后產(chǎn)生新的條帶6，條帶6中的雜交產(chǎn)物與靶DNA反應(yīng)，產(chǎn)生新的條帶7。電泳結(jié)果顯示Target能與MG1、MG2和MG3形成的雜交產(chǎn)物反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中所用到的單鏈DNA濃度都是4 μM，雙鏈DNA濃度都是2 μM。

圖3 核酸雜交的電泳表征1.Target；2. MG1；3. MG2；4. MG3；5. MG1+MG2；6. MG1+MG2+MG3；7. MG1+MG2+Target

3.3 Target與鏈酶親和素修飾的磁珠上的捕獲核酸探針MG2雜交

為了進(jìn)一步證明Target能夠與捕獲核酸探針MG2雜交并具有置換出修飾有蔗糖酶的單鏈信號(hào)核酸探針MG3的能力，制備了3種樣品。樣品A加入不含捕獲核酸探針的磁珠中進(jìn)行血糖檢測(cè)，而含有不同濃度靶基因的樣品B(0.001 nM)與C(1 nM)加入含有捕獲核酸探針的磁珠中進(jìn)行血糖檢測(cè)。正如圖4所示，以上樣品觀察到不同的血糖信號(hào)，這證明了該方法具有檢測(cè)靶基因的能力。

圖4 檢測(cè)方法可行性分析

3.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了使該檢測(cè)方法達(dá)到最佳的分析性能，實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA與蔗糖酶的比例、Au-PAMAM的濃度、Target的孵育時(shí)間以及實(shí)驗(yàn)用的蔗糖濃度進(jìn)行了優(yōu)化。DNA與蔗糖酶的比例在該方法的檢測(cè)性能方面起著重要的作用，因?yàn)镈NA濃度過(guò)高，結(jié)合的蔗糖酶量就會(huì)很少，相應(yīng)的產(chǎn)生信號(hào)就比較低，而如果DNA濃度過(guò)低，結(jié)合在磁珠上的信號(hào)核酸比較少，檢測(cè)的血糖信號(hào)同樣也會(huì)較低，因此對(duì)DNA與蔗糖酶的比例進(jìn)行研究尤為必要。如圖5A所示，隨著DNA與蔗糖酶濃度的比例增加，血糖信號(hào)急劇增加，在比例為1∶3時(shí)信號(hào)最大，超過(guò)此比例血糖信號(hào)下降，因此1∶3為最佳DNA與蔗糖酶濃度的比例。由于Au-PAMAM的濃度決定了其表面結(jié)合蔗糖酶的量，因此研究了其在稀釋5倍至100倍濃度下的檢測(cè)能力。如圖5B所示，當(dāng)其稀釋倍數(shù)約為15倍時(shí)，達(dá)到最大的血糖信號(hào)，因此稀釋15倍的Au-PAMAM為其最佳濃度。Target的孵育時(shí)間對(duì)該檢測(cè)方法的最終結(jié)果也有很大的影響，如圖5C所示，孵育90 min時(shí)有一個(gè)最大峰，因此90 min作為我們的Target孵育時(shí)間。最后我們也研究了蔗糖濃度對(duì)血糖信號(hào)的影響(圖5D)，蔗糖濃度在0.2-0.6 M時(shí)，血糖信號(hào)增加，而蔗糖濃度過(guò)高時(shí)基本不變，因此，0.6 M作為蔗糖的最佳濃度。

圖5 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化1.DNA與酶比例的優(yōu)化影響；B. Au-PAMAM濃度的影響；C. Target孵育時(shí)間的影響；D. 蔗糖濃度的影響

4 檢測(cè)方法的分析性能評(píng)估

為了評(píng)估該檢測(cè)方法對(duì)靶基因的分析性能，實(shí)驗(yàn)用一系列不同濃度的靶基因?qū)Ρ痉椒ㄟM(jìn)行了研究。根據(jù)0.1 pM到10 nM不同濃度的Target檢測(cè)到的結(jié)果顯示在圖6。從圖中可以看出，隨著Target濃度的增加，信號(hào)也跟著增加。當(dāng)Target濃度在0.5 pM至1 nM范圍時(shí)，信號(hào)的增加與Target濃度的對(duì)數(shù)有比較好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y(mM)=12.012+2.056logC(nM)，相關(guān)系數(shù)為0.995，檢測(cè)限為0.26 pM(S/N=3),Y代表血糖信號(hào)，C代表靶DNA的濃度。

圖6 檢測(cè)結(jié)果的線性相關(guān)曲線圖

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用血糖儀建立了一種基于蔗糖酶修飾的納米金樹狀大分子對(duì)MRSA mecA基因檢測(cè)新方法。利用納米金樹狀大分子上可以結(jié)合更多酶性分子這一特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了酶性放大。本方法檢測(cè)便攜、靈敏度高，擁有低的檢測(cè)限0.26 pM和寬的檢測(cè)范圍0.5 pM到1 nM。同時(shí)，我們提出的這種檢測(cè)策略，只需要改變捕獲核酸如適配體核酸，就可以實(shí)現(xiàn)其他生物分子的檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法在疾病診斷方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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