陳雅維

河南科技大學 化工與制藥學院，河南 洛陽 471023

S-腺苷蛋氨酸 (S-adenosylmethionine, 簡稱SAM) 存在于所有生物細胞中，是維持細胞正常生理功能的一種活性小分子物質(zhì)[1]。SAM在臨床上應用廣泛，對治療急慢性肝病[2-3]、骨關(guān)節(jié)炎[4]、神經(jīng)綜合征[5]和抑郁癥[6-7]等多種疾病都有一定的療效。此外，SAM也常用于保健品和化妝品中。

SAM 工業(yè)化生產(chǎn)的方法主要有化學法、酶法、全細胞催化法和微生物發(fā)酵法。其中微生物發(fā)酵法生產(chǎn) SAM具有工藝流程簡單、產(chǎn)量高、底物廉價易得等優(yōu)勢而被廣泛應用。釀酒酵母是美國 FDA認定的安全模式生物 (Generally recognized as safe，GRAS)，常用于代謝工程改造生產(chǎn)藥品及食品添加劑。此外，釀酒酵母中的S-腺苷蛋氨酸合成酶 (Methionine adenosyltransferase，MAT)活性高，而且還具備獨特的液泡貯存 SAM 的機制，因此釀酒酵母作為主要的 SAM 天然發(fā)酵菌株被廣泛使用。釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)SAM的研究主要集中在發(fā)酵條件優(yōu)化控制方面[8-10]，少有基因工程[11-12]方面的研究，而且忽視了輔因子對于 SAM合成的重要影響。

輔因子是一類可以和蛋白結(jié)合并對蛋白行使正常催化功能所必需的非蛋白質(zhì)類化合物。與傳統(tǒng)的代謝工程針對酶分子的改造不同，輔因子工程通過直接調(diào)控細胞內(nèi)關(guān)鍵酶的輔因子濃度和形式來實現(xiàn)代謝流的最大化，快速將碳物質(zhì)流導向目標代謝產(chǎn)物[13]。作為胞內(nèi)重要微環(huán)境的輔因子 ATP/ADP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+等參與了微生物細胞內(nèi)大量的代謝反應過程，將物質(zhì)代謝途徑串聯(lián)或并聯(lián)成復雜的網(wǎng)絡(luò)體系，最終使得物質(zhì)代謝流的分配受到輔因子形式和濃度的牽制。因此輔因子工程策略在微生物菌株改造方面將成為有利的工具，用于提高目標代謝物的濃度、產(chǎn)率、生產(chǎn)能力[14-15]以及增強微生物對于環(huán)境的耐受[16]等等。

SAM在微生物體內(nèi)合成過程中受到底物L-蛋氨酸和ATP含量的限制。目前的做法通常是在培養(yǎng)基中加入 L-蛋氨酸以及調(diào)控發(fā)酵工藝來滿足SAM 合成過程中對于限制性底物的需求。事實上，輔因子NADPH對于L-蛋氨酸的合成具有重要作用。如果能通過輔因子工程策略提高菌株自身的L-蛋氨酸合成能力，對于SAM高產(chǎn)菌株的構(gòu)建具有重要意義。

本文通過代謝工程手段在釀酒酵母線粒體及細胞質(zhì)中引入NADH激酶Pos5p，分別擾動細胞質(zhì)及線粒體中的 NADPH水平，研究 NADPH變化對于 SAM合成的影響，并分析細胞氧化還原平衡擾動對于物質(zhì)代謝及產(chǎn)物合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

實驗中所用的菌株和質(zhì)粒見表1。

1.1.2 引物

實驗中所用的引物列于表2。

表1 本研究所用菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this study

表2 用于基因擴增的引物Table 2 Primers used for PCR

1.1.3 酶與試劑

Phusion High-Fidelity DNA聚合酶和各種限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司。T4 DNA連接酶為TaKaRa (大連) 公司產(chǎn)品。2×TaqMix購自博邁德生物技術(shù)公司。SAM標準品及輔因子測定相關(guān)酶及試劑購自Sigma公司。酵母提取物、胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品。其余試劑等均為國產(chǎn)。引物由華大科技 (北京) 公司合成。

1.2 分子操作

1.2.1 釀酒酵母不同區(qū)域NADPH再生重組菌株的構(gòu)建

以 pRSFD-POS5Δ17 為模板，SacⅠ-POS5Δ17-F/SalⅠ-POS5Δ17-R為引物，PCR擴增得到不帶信號肽的POS5Δ17基因。以釀酒酵母基因組為模板，SacⅠ-POS5-F/SalⅠ-POS5-R為引物，PCR擴增得到POS5基因。分別將質(zhì)粒pUC19-PTEF1-TPGI和目的基因POS5Δ17/POS5用SacⅠ/SalⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切片段，T4 DNA連接酶過夜連接，轉(zhuǎn)化，菌落PCR，將篩得的陽性克隆接入LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒送測。測序正確獲得pUC19-PTEF1-POS5Δ17-TPGI和pUC19-PTEF1-POS5-TPGI。

分別以測序正確的重組質(zhì)粒 pUC19-PTEF1-POS5Δ17-TPGI和 pUC19-PTEF1-POS5-TPGI為模板[17]，以SpeⅠ-PTEF1-F/XmaⅠ-TPGI-R 為引物擴增獲得帶有NADPH再生基因表達盒的片段，并將基因片段和表達載體pRS425用SpeⅠ和XmaⅠ酶切，電泳，膠回收，過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliTrans 10。將菌落PCR驗證得到的陽性克隆單菌落接種至試管LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提質(zhì)粒，送測，得到重組質(zhì)粒 pRS425-PTEF1-POS5Δ17-TPGI和pRS425-PTEF1-POS5-TPGI。

培養(yǎng)50 mL釀酒酵母BY4741-MH，制備感受態(tài)并用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化導入重組質(zhì)粒，將菌液涂布在 SC選擇性固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)2–4 d。將長出的單克隆菌落接種至4 mL選擇性SC液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)24–48 h。進行菌落PCR驗證是否轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒。將含有重組質(zhì)粒的菌液于選擇性SC平板上劃線，取單菌落再驗證一次是否為目的菌株，將帶有重組質(zhì)粒的菌株保存至甘油管，用于后續(xù)的發(fā)酵實驗。帶有pRS425-PTEF1-POS5Δ17-TPGI的菌株命名為NBYSM-1，帶有pRS425-PTEF1-POS5-TPGI的菌株命名為NBYSM-2，帶有空質(zhì)粒pRS425的菌株作為對照PBYSM-0。

1.2.2 NADPH再生系統(tǒng)在釀酒酵母細胞中的定位表征菌株構(gòu)建

以 pRSFD-POS5Δ17 為模板，SacⅠ-POS5Δ17-F/POS5Δ17(gfp)-R為引物，PCR擴增得到帶有g(shù)fp重疊序列的POS5Δ17基因。以釀酒酵母基因組為模板，SacⅠ-POS5-F/POS5(gfp)-R為引物，PCR擴增得到帶有g(shù)fp重疊序列的POS5基因。以pET28a-gfp為模板，以gfp(POS5)-F/SalⅠ-gfp(POS5)-R為引物，擴增得到帶有POS5重疊序列的gfp片段。通過overlap PCR分別將POS5和gfp以及POS5Δ17和gfp融合在一起。分別將質(zhì)粒 pUC19-PTEF1-TPGI和目的基因POS5-gfp和POS5Δ17-gfp用SacⅠ/SalⅠ酶切，按照 1.2.1所述的方法即可獲得測序正確的重組質(zhì)粒pUC19-PTEF1-POS5Δ17-gfp-TPGI和 pUC19-PTEF1-POS5-gfp-TPGI。同理，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRS425-PTEF1-POS5Δ17-gfp-TPGI和 pRS425-PTEF1-POS5-gfp-TPGI，并進行釀酒酵母轉(zhuǎn)化，獲得陽性克隆菌株。

1.3 菌種保藏及培養(yǎng)條件

1.3.1 菌種保藏

挑取劃線純化后的釀酒酵母單菌落接種于 YPD(10 g/L酵母粉，20 g/L 蛋白胨，20 g/L葡萄糖) 或者SC液體培養(yǎng)基中 (6.7 g/L YNB，20 g/L葡萄糖，1.4 g/L復合氨基酸，不含亮氨酸和尿嘧啶)，30 ℃培養(yǎng)24 h。取300 μL 50%無菌甘油與700 μL種子發(fā)酵液均勻混合，置于–80 ℃超低溫冰箱備用。

1.3.2 種子培養(yǎng)

將斜面或者平板上的菌落接入 50 mL YPD或者 SC液體培養(yǎng)基中 (加入相應的氨基酸母液)，30 ℃培養(yǎng)24 h獲得種子液。

1.3.3 搖瓶培養(yǎng)

本實驗所用的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為SC培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基。按照初始OD600為0.1加入相應體積的種子液至搖瓶中，30 ℃培養(yǎng)。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測定

取1 mL發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，使用分光光度計測定樣品在600 nm波長下的吸光度作為菌體生物量。

1.4.2 SAM的萃取及含量測定

發(fā)酵液離心后用10% (W/V) 高氯酸在30 ℃下振蕩萃取2 h。13 000 r/min離心10 min，通過0.22 μm濾膜后，置于–20 ℃待測。

SAM的濃度測定采用HPLC (島津，日本) 方法。色譜條件：C18色譜柱 (北京艾杰爾科技有限公司，中國)；紫外檢測器：260 nm；流動相：0.01 mol/L甲酸銨，用乙酸調(diào)節(jié)pH至3.5；流速：1.0 mL/min[18]。

1.4.3 其他代謝物測定

乙醇和甘油等副產(chǎn)物使用HPLC方法 (賽默飛，美國) 測定。色譜條件為：色譜柱：HPX-87H(伯樂，美國)；檢測器：示差折光檢測器和紫外檢測器 (254 nm)；柱溫：50 ℃；流動相：5 mmol/L硫酸；流速：0.6 mL/min[19]。

1.4.4 NAD (H) 和NADP (H) 的含量測定

胞內(nèi)的 NADPH、NADP+、NADH和 NAD+的濃度采用循環(huán)酶催化法測定[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 NADH激酶在釀酒酵母線粒體及細胞質(zhì)中的定位表征

已有文獻報道NADH激酶Pos5p定位于釀酒酵母線粒體基質(zhì)中[21]。為確保強啟動子 PTEF1對于NADH激酶在細胞質(zhì)及線粒體中的表達，分別將POS5和POS5Δ17基因[22]與gfp基因進行融合表達，利用激光共聚焦顯微鏡確定NADH激酶在細胞中的位置。從圖1A可看出，未融合GFP的菌株沒有產(chǎn)生熒光。圖 1B表明不帶信號肽的NADH激酶Pos5p定位于釀酒酵母細胞質(zhì)中，使得整個細胞充滿熒光。圖 1C可明顯看出有線狀的熒光結(jié)構(gòu)，這說明帶信號肽的 NADH激酶Pos5p定位于釀酒酵母線粒體中，與文獻報道的線粒體結(jié)構(gòu)一致[21]。

圖1 NADH激酶在釀酒酵母細胞中的定位 (A：對照菌BY4741；B：Pos5p (POS5Δ17編碼) 在細胞質(zhì)中的定位；C：Pos5p (POS5編碼) 在線粒體中的定位)Fig.1 Localization of NADH kinase in the S.cerevisiae.(A) Control strain BY4741.(B) Pos5p(POS5Δ17 encoded) localized in the cytoplasm.(C)Pos5p (POS5 encoded) localized in the mitochondrion matrix.

2.2 NADPH再生系統(tǒng)對于胞內(nèi)吡啶核苷酸的擾動

分別研究了NADPH再生菌株在SC培養(yǎng)基中發(fā)酵15 h和24 h的胞內(nèi)吡啶核苷酸水平，結(jié)果見圖 2。重組菌 NBYSM-1和 NBYSM-2在不同發(fā)酵時間下，胞內(nèi)的 NADPH水平和NADPH/NADP+均高于對照菌PBYSM-0。其中，發(fā)酵 15 h，菌株 NBYSM-2胞內(nèi)的NADH/NAD+下降了36.83%，NADPH/NADP+提高了28.63%。菌株NBYSM-1胞內(nèi)的NADH/NAD+下降了15.62%，NADPH/NADP+提高了11.96%。與發(fā)酵15 h的情況相似，發(fā)酵 24 h重組釀酒酵母 NBYSM-1胞內(nèi)的NADPH/NADP+比率要遠遠高于 NBYSM-2，但是NADH/NAD+比率略低于NBYSM-2。

2.3 分區(qū)域調(diào)控NADPH對于SAM合成的影響

圖2 NADPH調(diào)控策略改造菌株發(fā)酵不同時間胞內(nèi)吡啶核苷酸的濃度變化 (A：發(fā)酵15 h胞內(nèi)NAD+/NADH濃度以及NADH/NAD+比率；B：發(fā)酵15 h胞內(nèi)NADP+/NADPH濃度以及NADPH/NADP+比率；C：發(fā)酵24 h胞內(nèi)NAD+/NADH濃度以及NADH/NAD+比率；D：發(fā)酵24 h胞內(nèi)NADP+/NADPH濃度以及NADPH/NADP+比率)Fig.2 Effects of the NADPH regulation strategy on the concentration of intracellular pyridine nucleotide in the control and recombinant strains under different cultivating time.Intracellular concentrations of NAD+/NADH and NADH/NAD+ratio at 15 h (A), concentrations of NADP+/NADPH and NADPH/NADP+ ratio at 15 h (B), concentrations of NAD+/NADH and NADH/NAD+ ratio at 24 h (C) and concentrations of NADP+/NADPH and NADPH/NADP+ ratio at 24 h (D) were evaluated.S0: PBYSM-0; S1: NBYSM-1; S2: NBYSM-2.

圖3 NADPH調(diào)控策略對于不同菌株發(fā)酵的生物量 (A) 及SAM濃度 (B) 的影響Fig.3 Effects of the NADPH regulation strategy on the biomass (A) and SAM titer (B) in the control and recombinant strains.

從圖3可以看出，對照菌株的生物量略高于重組菌株?？赡苁怯捎谥亟M菌中的NADPH再生系統(tǒng)消耗NADH生成NADPH，而減少了NADH氧化磷酸化合成ATP的水平，從而使得菌體生長略低于對照菌。不同菌株胞內(nèi) SAM含量相差較大，其中NADPH再生的兩株菌中胞內(nèi)SAM含量均遠遠高于對照菌。與對照菌PBYSM-0相比，菌株 NBYSM-1發(fā)酵 24 h胞內(nèi) SAM濃度提高3.28倍，菌株NBYSM-2胞內(nèi)SAM濃度提高1.79倍。而在NADPH再生的兩株菌中，線粒體內(nèi)NADPH再生的菌株 NBYSM-2胞內(nèi)的 SAM 含量要低于NBYSM-1。其中發(fā)酵24 h，菌株NBYSM-1胞內(nèi)SAM濃度比菌株NBYSM-2高1.8倍。

3 討論

釀酒酵母中NADPH的產(chǎn)生來源主要是磷酸戊糖途徑 (PPP) 的氧化部分以及異檸檬酸脫氫酶、乙醛脫氫酶和蘋果酸酶的催化反應。但是操作 PPP氧化部分的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶[23]以及異檸檬酸脫氫酶來調(diào)控釀酒酵母胞內(nèi)NADPH水平，會消耗1個碳產(chǎn)生CO2，降低產(chǎn)物得率。此外，通過中心代謝途徑的關(guān)鍵酶來調(diào)控胞內(nèi)氧化還原平衡會對整體的代謝流產(chǎn)生較大影響。而通過引入單獨靶向輔因子相關(guān)反應的酶能更有效直接地調(diào)控胞內(nèi)輔因子水平，同時在盡量不影響其他物質(zhì)代謝途徑的前提下解析輔因子對產(chǎn)物合成的影響。

細菌來源的轉(zhuǎn)氫酶可以將 NADH直接轉(zhuǎn)化為NADPH。然而在釀酒酵母中表達轉(zhuǎn)氫酶，卻起到相反的催化效果，NADPH被轉(zhuǎn)化為NADH[24]。另外一種方法則是引入ATP介導的NADH激酶將NADH轉(zhuǎn)化為NADPH。盡管Pos5p被認為是釀酒酵母線粒體內(nèi)NADPH的主要來源，關(guān)于它的機理研究還是不甚清晰[21]。從圖2和圖3中可知，菌株NBYSM-1胞內(nèi)NADPH、NADPH/NADP+比率以及SAM濃度均高于對照菌PBYSM-0和重組菌NBYSM-2。這說明NADH激酶在釀酒酵母細胞質(zhì)中的表達對 SAM 合成起到一定的促進作用。

圖4 NADPH調(diào)控策略對菌株發(fā)酵中乙醇 (A) 和甘油 (B) 濃度的影響Fig.4 Effects of the NADPH regulation strategy on the ethanol titer (A) and glycerol titer (B) in the control and recombinant strains.

乙醇和甘油的生成都需要消耗NADH，但實際在好氧發(fā)酵條件下，乙醇和甘油的生成途徑不同。甘油主要是由于發(fā)酵過程糖酵解中產(chǎn)生的過剩NADH被氧化而產(chǎn)生，而乙醇則是由有氧呼吸途徑產(chǎn)生。理論上，NADH的減少均會影響甘油和乙醇這些 NADH依賴的副產(chǎn)物的生成。從圖 4可看出，對照菌PBYSM-0和 NBYSM-1菌株生成的乙醇濃度相近，而線粒體中NADPH提高的菌株NBYSM-2乙醇濃度有所上升。由 圖4 B可知，3株菌的甘油生成能力差異較為明顯，重組菌株合成甘油的能力均有不同程度降低，其中NBYSM-2菌株的甘油濃度降低最多。有文獻報道分別在細胞質(zhì)中表達了形成水的 NADH氧化酶 (來源于肺炎鏈球菌的nox基因) 以及交替氧化酶 (來源于莢膜組織胞漿菌的aox基因)，發(fā)現(xiàn)表達了aox基因的菌株中乙醇生成量大幅度下降，而表達nox基因的菌株的甘油生產(chǎn)量大大降低[25]。有報道表明通過敲除GDH1 (編碼細胞質(zhì)中NADPH依賴的谷氨酸脫氫酶) 改變細胞氧化還原平衡，會減少甘油的生成[26]。雖然 NADH激酶介導的NADPH再生系統(tǒng)是以消耗1分子NADH來產(chǎn)生1分子NADPH，但是胞內(nèi)的NAD (H) 和NADP(H) 涉及到數(shù)個代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝反應，不能簡單地用等比例換算來分析結(jié)果。

綜上所述，甘油的減少和乙醇的增多是由于打亂了細胞復雜的氧化還原平衡所致。而NADH的減少和NADPH的增多，最終使得重組菌的細胞質(zhì)和線粒體均處于略高的氧化態(tài)。從 SAM濃度的提高和副產(chǎn)物甘油、乙醇的變化可以看出，NADPH再生系統(tǒng)起到了一定的物質(zhì)重新分配作用，消耗了NADH，提高了NADPH的胞內(nèi)水平，從而促進了釀酒酵母中SAM的合成。

然而輔因子NADPH調(diào)控SAM合成的能力有限，最終沒有獲得 SAM產(chǎn)量的大幅度提升。這可能是由于輔因子牽涉胞內(nèi)眾多反應，難以實現(xiàn)產(chǎn)物定向調(diào)控。此外，SAM的合成過程不僅僅受到 NADPH的限制，ATP的不足同樣會影響SAM的合成。因此，后續(xù)的研究可以考慮同時調(diào)控胞內(nèi)ATP以及NADPH水平和比例，以進一步提高 SAM產(chǎn)量，為構(gòu)建高產(chǎn) SAM的菌株奠定基礎(chǔ)。

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