柯彩霞，范艷利，蘇楓，徐莉，閆云君

華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074

酶的固定化技術(shù)是指將天然的游離酶限定在一定空間內(nèi)或完全附著在某固態(tài)結(jié)構(gòu)上而不能自由移動的一種生物技術(shù)，是一種常用、有效、便捷的生物酶修飾手段，對酶的催化活性和操作穩(wěn)定性具有極大的改善和提升。圖1直觀地展示了相比于游離酶而言，固定化酶在催化反應(yīng)中所具有的優(yōu)勢[1]。

最早被發(fā)現(xiàn)的固定化形式是天然存在的生物膜系統(tǒng)，它們存在于河流中的石塊、人類的牙齒、水管等天然環(huán)境中[2]。20世紀(jì)70年代以來，人類對生物膜的認(rèn)識逐漸加深并將其利用于生產(chǎn)生活和社會改造中，固定化技術(shù)便由此誕生并逐步發(fā)展起來[3]。固定化技術(shù)對生物酶的改造效果受多方面因素的影響，如固定化載體、反應(yīng)介質(zhì)、制備條件、酶分子性質(zhì)及有機(jī)溶劑等；對于不同的固定化對象，目前沒有普適性的策略，需要根據(jù)酶的特性以及應(yīng)用需求來選擇合適的固定化方法[4]。近10年來，本團(tuán)隊(duì)對酶的固定化技術(shù)進(jìn)行了大量研究[5-7]，發(fā)現(xiàn)多數(shù)傳統(tǒng)固定化技術(shù)所使用的方法策略均較為成熟且相似，在酶的催化特性改善上取得了一些成果，但其發(fā)展仍受到普適性低、工業(yè)成本高等因素的限制。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展以及學(xué)科間的相互滲透，酶的固定化技術(shù)研究取得了一定的突破，新型固定化技術(shù)的探索研究已成為領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，涌現(xiàn)了多種新型固定化載體與技術(shù)[8]。

1 傳統(tǒng)固定化技術(shù)概況

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，傳統(tǒng)的固定化技術(shù)主要分為吸附、共價結(jié)合、包埋和交聯(lián)四大類。

吸附法是最簡單的固定化方式，它利用酶與載體間的弱作用力，如范德華力、疏水作用力和表面張力等，因而極易發(fā)生酶的脫吸附。大孔樹脂、多孔硅玻璃、分子篩等材料是傳統(tǒng)固定化技術(shù)的優(yōu)良載體，也是第一代工業(yè)用固定化酶研發(fā)的熱點(diǎn)材料。吸附法制備固定化酶的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單、酶活回收率高、載體易回收、成本低、見效快、不需要化學(xué)修飾，但同時也伴隨固定化酶不穩(wěn)定、酶蛋白易流失、載體會對產(chǎn)物造成一定吸附等缺點(diǎn)[9]。

圖1 游離酶 (A) 和固定化酶 (B) 反應(yīng)示意圖[1] (游離酶催化反應(yīng)，反應(yīng)完成后通常需要透析等復(fù)雜方法將產(chǎn)物與游離酶分離；而對于固定化酶，簡單的過濾等方法即可分離產(chǎn)物與催化劑)Fig.1 The illustration of reactions catalyzed by free (A) and immobilized enzyme (B)[1].In the reaction of free enzyme,the enzyme has to be separated via dialysis from the product.However, immobilized enzyme can be separated through the simple filtration.

共價結(jié)合法是通過共價鍵將酶表面的氨基酸殘基與載體表面活性基團(tuán)連接而形成的一種穩(wěn)定的固定化策略。這種方法通常要求載體上包含有較多的化學(xué)基團(tuán)或具有較強(qiáng)的可修飾性，以便與酶分子產(chǎn)生化學(xué)鍵偶聯(lián)，常見的化學(xué)鍵有異脲鍵、重氮鍵、環(huán)氧基、烷基、羧基等。多步法固定化是一種加強(qiáng)共價結(jié)合穩(wěn)定性的固定化技術(shù)，Mateo等[10]提出了一種“訂制”功能性環(huán)氧樹脂固定化酶的方法，主要分為兩步，首先是對酶分子和固定化載體進(jìn)行物理或化學(xué)的預(yù)處理，使其帶上后續(xù)反應(yīng)所需的官能團(tuán)；然后利用酶分子表面的親核官能團(tuán)與載體上的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的多重共價反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)酶的共價固定。共價結(jié)合法制備固定化酶具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，與吸附法相比幾乎沒有酶分子泄漏，通常能在一定程度上提高其熱穩(wěn)定性，但在共價反應(yīng)的過程中，酶分子易發(fā)生構(gòu)象改變，導(dǎo)致活性降低。

包埋法是指利用具有格子結(jié)構(gòu)的凝膠材料或具有多功能的半透膜，使酶分子被固定于特定的結(jié)構(gòu)之中，如卡拉膠、聚乙烯亞胺、聚丙烯酰胺等聚離子聚合物材料[11]。這種固定化方法具有固定化率高、可用于多種目的分子的共固定等優(yōu)點(diǎn)；但其主要缺陷在于，若催化反應(yīng)發(fā)生較快，反應(yīng)產(chǎn)物的積累難以很快地透過膠膜釋放到反應(yīng)溶劑中，從而降低反應(yīng)速率甚至導(dǎo)致膠膜材料的破裂。

交聯(lián)法是一種無載體固定化策略，它利用雙功能或多功能的交聯(lián)劑 (如戊二醛、二羧酸、己二酰亞胺酸二甲酯等) 使酶分子之間發(fā)生化學(xué)連接，形成一種大型的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)，且獲得疏水性而可從溶液中分離出來，從而得到固定化酶。由于交聯(lián)反應(yīng)的無序性，可能在酶的活性中心發(fā)生交聯(lián)而使酶活降低或失活，大大降低固定化酶的酶活回收率。同時，由簡單交聯(lián)形成的固定化酶交聯(lián)體的機(jī)械性能較差，因此交聯(lián)法很少被單獨(dú)應(yīng)用于酶的固定化，通常與其他固定化方法結(jié)合，以鞏固或提高原有固定化策略的效果。Jancsik等[12]采用先包埋后交聯(lián)的方法，分別將β-半乳糖苷酶、青霉素?；负腿┛s酶包埋于聚乙烯醇膜內(nèi)，然后用戊二醛對三種酶進(jìn)行交聯(lián)，在減少包埋蛋白損失的同時提高交聯(lián)酶的機(jī)械性能。

2 新型固定化酶技術(shù)

在新型固定化技術(shù)的探索研究中，固定化載體的選擇與研發(fā)十分重要，其一般具有優(yōu)異物化特性，例如多孔性、疏水/親水性、物化穩(wěn)定、表面活性等。合適的固定化載體能有效提高固定化率和催化效率，因而許多新型固定化技術(shù)的研究都圍繞著載體材料展開。另一方面，為了讓新型載體的優(yōu)勢得到最大發(fā)揮，同時彌補(bǔ)其存在的缺陷，研究者們對固定化技術(shù)的方法策略也進(jìn)行了大量的創(chuàng)新研究[13-15]。

2.1 基于新型固定化載體的固定化酶技術(shù)

2.1.1 基于材料創(chuàng)新的固定化技術(shù)

隨著生物技術(shù)與材料、化學(xué)等學(xué)科的不斷交叉發(fā)展，新的載體修飾方法和新型材料不斷涌現(xiàn)，豐富了固定化技術(shù)研究的載體來源，涌現(xiàn)一批圍繞新型載體展開的固定化策略研究[16-18]。這一類載體通常有表面積大、具有多孔性空間結(jié)構(gòu)、底物/產(chǎn)物親和性等特征，可主要分為新型納米材料載體、磁性材料載體、傳統(tǒng)材料經(jīng)改造修飾而成的復(fù)合新型載體3大類。

新型納米載體是指具有納米級結(jié)構(gòu)的材料，這類材料擁有極大的表面積和良好的分散性，能極大地提高固定化率和反應(yīng)催化效率，主要包含有多孔納米金顆粒[19]、納米管[20]、石墨烯[21]等。使用納米材料載體制備的固定化酶多應(yīng)用于電極和生物傳感器領(lǐng)域，研究結(jié)果顯示這類生物傳感器能產(chǎn)生更強(qiáng)的信號，擁有更大的檢測范圍和更高的敏感度。其中，碳納米管是最具代表性的新型納米材料之一，1991年被日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)以來，極大地推動了材料制備領(lǐng)域的發(fā)展，2010年以來碳納米管在固定化酶技術(shù)中的應(yīng)用不斷涌現(xiàn)，目前在脂肪酶、水解酶、漆酶和多種氧化還原酶的固定化研究中均有大量應(yīng)用。本團(tuán)隊(duì)利用多壁碳納米管吸附固定化洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶[22]，并將其應(yīng)用于手性拆分1-苯乙醇反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該固定化酶的催化效率得到了極大的提升，是游離酶的54倍，拆分反應(yīng)平衡所需的時間從幾天縮短至10 min，表明納米材料制備的固定化酶在生物催化應(yīng)用中具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

磁性材料是利用鐵、錳、鈷及其氧化物等化合物制備的一類具有磁性的材料，其最大優(yōu)點(diǎn)在于可通過磁力吸引而迅速分離固定化酶，且固定化方法簡單，能有效減少資本和工程投入[23]。單一的磁性顆粒一般不直接用于酶的固定化，通常與其他有機(jī)高分子聚合物或多孔性無機(jī)材料聯(lián)合使用，以獲得較高的固定化率，同時使固定化酶具有磁性，便于分離回收。在我國固定化酶研究領(lǐng)域內(nèi)，磁性顆粒早在20世紀(jì)80年代就被應(yīng)用于固定化酶的研究工作中，21世紀(jì)以來得到了大量應(yīng)用，至今仍是固定化酶制備的常用材料之一，如 Hou、Song、Fortes等的工作[24-26]，利用磁性顆粒結(jié)合其他固定化材料制備固定化酶，大大簡化了回收利用操作過程。本團(tuán)隊(duì)利用樹狀分子修飾的磁化多壁碳納米管作為載體固定化米赫根毛霉脂肪酶 (Rhizomucor mieheilipase)，獲得了催化活性高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、操作簡便的固定化酶，并將其成功應(yīng)用于生物柴油的制備反應(yīng)[27]。

基于傳統(tǒng)材料進(jìn)一步改造修飾的固定化載體通常有較為繁雜的化學(xué)修飾，但這種方法具有較強(qiáng)的目的性和方向性，常應(yīng)用于定向固定化和共固定復(fù)合酶的研究中[28-29]。一些性能優(yōu)良的傳統(tǒng)載體，如多孔硅材料、大孔樹脂、分子篩、天然多糖等，經(jīng)過長期的實(shí)驗(yàn)研究已被證明具有較大的固定化潛力，但仍具有部分缺陷，如穩(wěn)定性差、不易回收利用等，通過針對性的改造與修飾克服其應(yīng)用阻礙，制備出新型的二代載體以促進(jìn)固定化酶走向工業(yè)化應(yīng)用，是當(dāng)前固定化領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)之一。以瓊脂糖材料為例，早在1975年便有研究使用瓊脂糖珠固定化胰蛋白酶[30]，而在 Rueda等[31]2016年的工作當(dāng)中，利用辛基谷氨酸對瓊脂糖珠進(jìn)行修飾并固定化了5種不同的脂肪酶，不僅大幅提高了脂肪酶催化活力，還能利用離子交換將固定化酶洗脫而回收利用載體，提出了一種可逆固定化技術(shù)。

由以上3類基于材料創(chuàng)新組成的固定化酶技術(shù)具有催化效果好、固定化率高等特點(diǎn)，其主要優(yōu)勢在于對新興載體的應(yīng)用，使該技術(shù)具有極大的發(fā)展?jié)摿εc可塑性。另一方面，由于載體的選擇和預(yù)處理等過程是必要的，該技術(shù)的操作過程一般比較復(fù)雜，固定化酶的物理形態(tài)和適用環(huán)境受載體材料的影響極大。

2.1.2 金屬有機(jī)骨架化合物介導(dǎo)的固定化

金屬有機(jī)骨架 (MOF) 也稱多孔配位聚合物(PCPs)，是一類有多孔結(jié)構(gòu)雜化晶體，由無機(jī)分子和有機(jī)絡(luò)合基團(tuán) (羧酸鹽、偶氮、膦酸鹽等) 連接構(gòu)成[32]。MOF含有大量孔隙結(jié)構(gòu)，在氣體儲存、催化、檢測、生物醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域中均有較大應(yīng)用潛力。2006年，Psklak最早將MOF應(yīng)用于固定化酶技術(shù)，直至2011年，Ma等的工作發(fā)表，該固定化技術(shù)開始得到廣泛的應(yīng)用。MOF或PCPs固定化酶技術(shù)可分為3類，即物理吸附、化學(xué)連接和牢籠包埋[33]；其中牢籠包埋法固定化酶利用載體的牢籠結(jié)構(gòu)，通過簡單混合孵育即可使酶分子束縛于其牢籠結(jié)構(gòu)內(nèi)，并發(fā)生一定的結(jié)構(gòu)變化，此時酶的結(jié)構(gòu)與游離狀態(tài)下不同，但也并未損傷活性。Lykourinou等[34]合成了多孔MOF (Tb-TATB，鋱-三氨基三硝基苯，如圖2) 并固定化微過氧化物酶-11 (MP-11)，將其氧化 3,5-二叔丁基兒茶酚(DTBC) 的底物轉(zhuǎn)化率提高至 48.7%，而之前大孔樹脂固定化的MP-11轉(zhuǎn)化率只有17.0%。

圖2 MP-11的結(jié)構(gòu)示意圖 (A)、3.9 nm直徑時的多孔MOF (B)、4.7 nm直徑時的多孔MOF (C) [34]Fig.2 Structure of MP-11 (A), Tb-TATB in 3.9 nm diameter cage (B), Tb-TATB in 4.7 nm-diameter cage (C)[34].

MOF介導(dǎo)的固定化技術(shù)能顯著提高固定化酶的穩(wěn)定性，甚至能在一定程度上適應(yīng)一些非自然的惡劣環(huán)境，在固定化率最大化的同時最小化酶蛋白的流失。清華大學(xué)戈鈞團(tuán)隊(duì)制備了酶-金屬有機(jī)骨架復(fù)合物[35]，將皺褶假絲酵母脂肪酶固定其中，將所得固定化酶和天然酶分別暴露于二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、甲醇、乙醇等對蛋白結(jié)構(gòu)具有一定破壞性的有機(jī)溶劑中，金屬有機(jī)骨架固定化酶具有極好的有機(jī)溶劑耐受性，幾乎完全保留了其初始酶活。

2.1.3 納米花型雜交晶體固定化

納米花型固定化酶指的是酶分子直接與無機(jī)鹽晶體雜交形成具有類似天然花卉形態(tài)結(jié)構(gòu)的復(fù)合體。這一概念由Ge等[36]2012年在Nature Nanotechnology發(fā)表的一篇文章中首次報道，并通過改變緩沖液濃度而模擬了固定化酶“開花”的過程 (圖3)，酶蛋白與無機(jī)鹽在反應(yīng)初始階段發(fā)生聚合，隨后逐漸形成花瓣、花朵的形態(tài)。

該固定化的發(fā)生伴隨了無機(jī)鹽沉淀形成的過程，利用低濃度的緩沖液減緩無機(jī)鹽形成速率，在反應(yīng)中引入酶分子，使沉淀依附其上而緩慢形成，一定程度上對其進(jìn)行了包埋，以實(shí)現(xiàn)酶的固定化。近年來，Altinkaynak等[37]也進(jìn)行了相關(guān)研究工作，本團(tuán)隊(duì)利用無機(jī)磷酸鈣緩慢形成的過程，制備了一種具有納米花型態(tài)的固定化脂肪酶，如圖4所示[38]，在含有酶的反應(yīng)溶液中，磷酸鈣沉淀由原來的片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為納米花結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然這種制備方法合成的固定化酶在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性上有一定的缺陷，但其能有效提高脂肪酶的催化效率，并且操作簡單，制備環(huán)節(jié)較少，相比其他固定化技術(shù)，納米花型固定化酶技術(shù)只需要一步反應(yīng)便能完成載體合成和酶的固定化，具有極大的發(fā)展和應(yīng)用潛力。

圖3 納米花型雜交晶體.(A) 納米花形成過程機(jī)制的推斷示意圖.(B–D) 分別為納米花合成反應(yīng)2 h、12 h和3 d后的SEM圖像[36]Fig.3 Nanoflower hybrid crystal.(A) Proposed mechanism of nanoflowers formation.SEM images of nanoflowers after 2 h (B), 12 h (C) and 3 d (D) reaction[36].

圖4 空白對照磷酸鈣沉淀 (A) 與固定化酶 BCL-磷酸鈣沉淀 (B) 的SEM圖像[38]Fig.4 SEM images of the synthetic products without lipase (A) and with lipase (B)[38].

2.2 新型固定化酶制備技術(shù)

2.2.1 單酶納米顆粒的制備

單酶納米顆粒 (Single enzyme nanoparticles，SENs) 是指每個酶分子均被一種納米級的有機(jī)或無機(jī)多孔網(wǎng)狀聚合物所包圍而形成的納米固定化酶顆粒。該技術(shù)于2003年被首次提出，Kim等[39]將兩種胰蛋白酶固定于一種多孔有機(jī)-無機(jī)材料之中，每個酶分子如同被單獨(dú)封鎖于一個納米級“集裝箱”中。由于包埋層非常薄，具有多孔性結(jié)構(gòu)，且有納米級尺寸的特性，可以很好地分散在溶劑中，因而形成的單酶納米顆粒與反應(yīng)底物之間的傳質(zhì)阻力十分小，有效提升了固定化酶的催化活性。單酶納米顆粒具有良好的催化穩(wěn)定性和環(huán)境抗逆性，且有多種反應(yīng)形式，可以單獨(dú)或混合具有協(xié)同效應(yīng)的多種酶進(jìn)行催化反應(yīng)。由于其單體尺寸較小而不易進(jìn)行回收分離，在應(yīng)用中可以與其他多孔性材料聯(lián)合使用，如用磁性顆粒吸附SENs[40]，使其帶有磁性以簡化其回收利用操作。而隨著單酶納米顆粒技術(shù)的發(fā)展，Cai等[41]制備了一種新型納米人工酶，如圖5所示，通過兩步法合成了氫氧化銅3D牢籠結(jié)構(gòu)納米顆粒，其本身便具有高于天然辣根過氧化物酶的催化活性。

2.2.2 微波輻射輔助的固定化技術(shù)

圖5 氫氧化鈉銅3D牢籠結(jié)構(gòu)人工單酶納米顆粒[41]Fig.5 Cu(OH)2 3D supercage as an single artificial enzyme nanoparticle[41].

由于不同載體和酶自身的親水性、溶解性等物化性質(zhì)不同，固定化過程中存在一定的分散與接觸性障礙，微波輻射輔助固定化技術(shù)指的是在固定化反應(yīng)原液準(zhǔn)備和固定化反應(yīng)過程中，對溶液進(jìn)行微波輻射處理以輔助固定化過程的發(fā)生。1997年，Penafiel等[42]發(fā)現(xiàn)微波輻射能影響酶的結(jié)構(gòu)與活力，在之后的研究中微波輻射常用于反應(yīng)溶液的均勻分散過程，2005年，Vukova等[43]通過研究發(fā)現(xiàn)輻射強(qiáng)度對處理效果有很大的影響，說明了微波輻射各參數(shù)優(yōu)化的必要性。在固定化研究中，許多多孔性材料都有著由于親/疏水性而造成的擴(kuò)散限制，使得酶分子很難與其發(fā)生吸附或共價結(jié)合，阻礙了其在固定化領(lǐng)域中的應(yīng)用，而在某些固定化酶制備的過程中，使用微波輻射對固定化過程輔助可以很好地解決這一擴(kuò)散限制[44]。例如木瓜蛋白酶和青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶[45]，兩者的蛋白結(jié)構(gòu)尺寸均較大而難以被固定化，通過微波輻射輔助，這兩種大分子蛋白酶均能成功且迅速地固定于中細(xì)胞硅質(zhì)泡沫上，并且其蛋白活性也得到了較好的保留。研究表明，對于一些具有固定化需求、在常規(guī)固定化過程中又存在較大傳質(zhì)阻力的反應(yīng)，微波輻射是一種有效的輔助技術(shù)，且在多類固定化或催化反應(yīng)中表現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力[46-49]。另一方面，微波輻射在一定程度上會影響酶與載體的結(jié)合，導(dǎo)致某些吸附固定化酶發(fā)生蛋白脫落，因此在固定化酶的制備過程中應(yīng)有選擇性地應(yīng)用此技術(shù)。

2.2.3 無載體固定化技術(shù)

無載體固定化是指在沒有載體材料存在的情況下，酶分子通過交聯(lián)或聚集而形成不溶于水的聚合物，使其能夠從水溶液中分離實(shí)現(xiàn)固定化(圖 6)[50]。在傳統(tǒng)固定化技術(shù)中，一般使用交聯(lián)法來制備含單一酶的交聯(lián)酶晶體 (Cross-linked enzyme crystal，CLEC) 或包含多種酶的交聯(lián)酶聚集體 (Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)。2001年以后，在傳統(tǒng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，Cao等[51]對此技術(shù)進(jìn)行了擴(kuò)展研究，形成了一種新型無載體交聯(lián)固定化技術(shù)，該技術(shù)被 Sheldon團(tuán)隊(duì)[52]不斷研究發(fā)展，最后被 CLEA Technologies(Netherlands) 公司商業(yè)化。在此基礎(chǔ)上，關(guān)于酶的自固定化概念被提出，即利用含有酶的水溶液與含有表面活性劑的非水相溶液混合，并加入雙功能交聯(lián)劑，通過超聲或物理乳化的方法形成微乳化體系。在自固定化的過程中，酶傾向于分布在油水界面上，通過交聯(lián)劑能使分布在微乳球表面的酶發(fā)生聚集而獲得疏水性，然后除去有機(jī)試劑即可獲得自固定化的酶顆粒，且由于界面激活效應(yīng)，得到的固定化酶通常處于激活態(tài)而擁有較高的催化活力。該方法在脂肪酶、漆酶以及多種復(fù)合酶蛋白等固定化應(yīng)用中均取得了成功，Molawa等[53]利用聚乙烯亞胺和戊二醛結(jié)合的交聯(lián)法，成功制備了堿性蛋白酶球形顆粒，并結(jié)合PVA包埋法大幅提高了固定化酶的催化穩(wěn)定性。對比于傳統(tǒng)交聯(lián)固定化技術(shù)，新型無載體固定化技術(shù)一定程度上克服了固定化酶活性低、易變性、穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，但相比其他新型固定化酶技術(shù)，該方法的性價比仍然無法接近實(shí)際工業(yè)應(yīng)用的需求。

圖6 脂肪酶無載體固定示意圖[50]Fig.6 Lipase immobilization without carriers[50].

2.3 酶的定向固定化技術(shù)

2.3.1 生物酶介導(dǎo)的定向固定化技術(shù)

在當(dāng)今人們環(huán)保意識不斷增強(qiáng)的時代背景下，使用綠色化學(xué)、環(huán)境友好型生物技術(shù)取代對環(huán)境造成巨大污染的傳統(tǒng)化學(xué)手段是現(xiàn)代工業(yè)面臨的一個重點(diǎn)難題。在固定化技術(shù)中，研究者們提出一種新型的固體蛋白制劑，通過酶促反應(yīng)使標(biāo)記蛋白與目的蛋白結(jié)合，在不使用其他化學(xué)交聯(lián)劑的情況下，實(shí)現(xiàn)酶的共價固定化[54]。2007年，一種轉(zhuǎn)肽酶 Sortase A介導(dǎo)的蛋白修飾技術(shù)被提出[55]，很快便在固定化酶技術(shù)中得到應(yīng)用[56]，利用 Sortase A可將目的蛋白連接到氨基修飾的載體上，實(shí)現(xiàn)酶的定向固定化。由此，生物酶介導(dǎo)的定向固定化技術(shù)的研究不斷發(fā)展。其中，增強(qiáng)的綠色熒光蛋白 (EGFP) 和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 (GST)是一類模型蛋白，在其C末端用中性Gln供體底物肽作為標(biāo)簽標(biāo)記，可通過酶促反應(yīng)固定在含有酪蛋白涂層的聚苯乙烯表面[57]。另一類則是以SNAP自聚標(biāo)簽為代表的融合標(biāo)簽酶固定化策略，如圖7所示[58-59]，將目標(biāo)酶與SNAP標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)，可利用標(biāo)簽與載體表面的特定殘基形成穩(wěn)定的共價結(jié)合以實(shí)現(xiàn)固定化。

圖7 SNAP自聚標(biāo)簽融合酶蛋白與O6-芐基鳥嘌呤定向共價固定化策略[58-59]Fig.7 Immobilization by an enzyme self-labeling tag: the SNAP-tag reacts with O6-benzylguanine[58-59].

這一類新型固定化技術(shù)也被稱為酶促固定化酶技術(shù) (Enzymatic immobilization of enzyme)[60]，其本質(zhì)是通過蛋白融合而實(shí)現(xiàn)酶蛋白的定向共價固定化，具有設(shè)計(jì)性強(qiáng)、選擇性高等特點(diǎn)，但技術(shù)操作相對復(fù)雜，目前主要被應(yīng)用于生物傳感器、生物電極的制備領(lǐng)域，該方法在各類生物酶中的普適性和催化應(yīng)用性還有待進(jìn)一步研究。

2.3.2 化學(xué)修飾介導(dǎo)的定向固定化技術(shù)

定向固定化的實(shí)現(xiàn)主要依靠對酶與載體表面的分析修飾，與上文提及的蛋白融合標(biāo)簽法相比，化學(xué)修飾介導(dǎo)的固定化是指在酶分子表面氨基酸殘基上引入特定基團(tuán)，使修飾后的酶能與載體表面的功能團(tuán)發(fā)生特定的化學(xué)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)酶的定向固定化。在過去幾十年中，生物正交反應(yīng)研究不斷發(fā)展[61]，促進(jìn)了一些固定化酶策略的形成，Je等[62]利用該策略將糜蛋白酶固定化于纖維素納米纖維上，得到了一種環(huán)境友好且活性較高的固定化酶。目前比較常用的修飾功能團(tuán)有醛基、疊氮、炔烴等，圖8顯示的是一種常見的點(diǎn)擊反應(yīng)，經(jīng)炔烴修飾的酶分子能與含有疊氮化物功能團(tuán)的載體發(fā)生1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)，形成穩(wěn)定的化學(xué)共價鍵，Cu(I) 是這類化學(xué)修飾介導(dǎo)的固定化酶反應(yīng)中常用的催化劑[63]?；瘜W(xué)修飾策略的優(yōu)勢在于，可應(yīng)用于固定化表面缺乏相應(yīng)共價結(jié)合功能團(tuán)的酶，但這一方法易造成酶蛋白結(jié)構(gòu)改變而影響其催化活性，通過預(yù)測修飾位點(diǎn)以及選取條件較溫和的反應(yīng)方式能有效減少固定化酶催化活性的損失。

2.3.3 基于表面展示技術(shù)的酶固定化

表面展示技術(shù)指的是利用蛋白融合技術(shù)，使目的蛋白與微生物表面的錨定蛋白結(jié)合而展示在微生物體表面，并保持一定的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能活性，利用這一技術(shù)將酶融合展示于細(xì)胞表面的固定化技術(shù)也屬于一種全細(xì)胞催化劑制備策略。1985年，Smith等提出了一種噬菌體表面展示技術(shù)，由此開始了表面展示技術(shù)的研究與發(fā)展[64-65]。根據(jù)展示主體材料的不同，目前表面展示技術(shù)主要可分為3類，即噬菌體、細(xì)菌、酵母表面展示系統(tǒng)。Shibasaki等于1997年首次公開了一種工程酵母蛋白展示技術(shù)[66]，體現(xiàn)了酵母系統(tǒng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、遺傳操作簡單、容錯性強(qiáng)以及可進(jìn)行復(fù)雜大分子蛋白融合展示的優(yōu)良特性。此后，通過多種酵母 (如釀酒酵母、畢赤酵母、解脂耶氏酵母等) 開展的表面展示技術(shù)研究成為了該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。多數(shù)酵母表面展示技術(shù)是通過GPI錨定殘基來實(shí)現(xiàn)的，GPI能同時與酵母細(xì)胞壁蛋白和外源蛋白結(jié)合；如圖9所示[67]，GPI殘基主要有4種融合的模式，即通過凝集素蛋白的C末端、N末端或Flo1的C末端、N末端以融合目的蛋白。

圖8 Cu(I) 催化疊氮炔環(huán)加成反應(yīng)[63]Fig.8 Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition(CuAAC) reaction[63].

表面展示固定化酶技術(shù)從化學(xué)本質(zhì)上看是一種共價結(jié)合固定化，當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)離催化活性中心較近時，易造成酶的結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致失活或活性降低。因此，利用表面展示技術(shù)固定化酶時，通常需要預(yù)先分析酶的氨基酸序列與三維空間結(jié)構(gòu)，選擇距離活性中心較遠(yuǎn)的氨基酸殘基進(jìn)行修飾，盡量降低酶與錨定蛋白的結(jié)合對酶分子構(gòu)象和催化活性造成的影響。這一預(yù)先分析選擇重要性在本團(tuán)隊(duì)2010年發(fā)表的工作中得到了有力的證明與強(qiáng)調(diào)[68]，通過對Cwp2、Flo1和凝集素蛋白3種不同錨定蛋白直接融合Lip2，將其展示于酵母細(xì)胞表面，圖10以Flos錨定蛋白融合 Lip2表面展示為例，簡述了該技術(shù)原理。對成功展示的工程菌 (即固定化酶) 進(jìn)行催化活性檢測分析，對比發(fā)現(xiàn)3種展示途徑對催化活力均發(fā)生了較大程度的抑制；而通過結(jié)構(gòu)預(yù)測選擇遠(yuǎn)離活性中心的錨定位點(diǎn)以展示 Lip7、Lip8和黑曲霉脂肪酶均得到了較高的酶活回收率，其溫度穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性也得到了改善。

表面展示技術(shù)的主要優(yōu)勢在于定向結(jié)合性強(qiáng)、固定化酶結(jié)合穩(wěn)定、獲得的工程菌即為全細(xì)胞催化劑，因而具有較高的工業(yè)應(yīng)用潛力。但其操作較復(fù)雜，從蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測到基因的編輯和表達(dá)、最后收集發(fā)酵產(chǎn)物等一系列流程的投入較高，在實(shí)際應(yīng)用之前，需對工程菌的穩(wěn)定性和催化活性進(jìn)行大量的測試與評估。

圖9 酵母表面展示系統(tǒng)：α-凝集素C末端系統(tǒng) (A)、α-凝集素N末端系統(tǒng) (B)、Flo1p C末端系統(tǒng) (C) 和Flo1p N末端系統(tǒng) (D)[67]Fig.9 Yeast surface display systems: α-agglutinin C terminal system (A), α-agglutinin N terminal system (B), Flo1p C terminal system (C) and Flo1p N terminal system (D)[67].

圖10 Flos錨定蛋白在酵母表面融合展示Lip2[68]Fig.10 Yeast surface display Lip2 via anchored protein Flos[68].

2.3.4 界面聚合微囊固定化技術(shù)

界面聚合指的是一種反應(yīng)發(fā)生在兩種互不相容的界面之間的縮聚反應(yīng)，該反應(yīng)具有不可逆性；將目的酶溶解在相應(yīng)的體系中，通過縮聚能形成微囊或微球顆粒將酶蛋白包裹而實(shí)現(xiàn)固定化[69]。界面聚合最初主要集中于化學(xué)合成研究，在2001–2002年間，大量乳液體系中的界面聚合微囊技術(shù)涌現(xiàn)[70-71]，由此開啟了界面聚合微囊制備的研究。2015年，Qu等[72]將脂肪酶固定于界面聚合獲得的三維膠質(zhì)體上，由于其油水界面的特性，固定化酶活力是游離酶的8倍。油/水 (O/W)乳液體系是界面聚合微囊固定化技術(shù)的經(jīng)典模型，可分為水包油、油包水和油包油三種類型，其中應(yīng)用最多的是油包水微囊技術(shù)，如圖 11所示，酶多數(shù)分布于油水界面上，其活性結(jié)構(gòu)被激活，從而具有更高的酶活[69]。因此，界面聚合微囊固定化技術(shù)最大的優(yōu)勢在于對固定化酶的激活，但微囊的儲存和重復(fù)利用穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步增強(qiáng)。

在蘇楓等[73]報道的固定化研究中，選用了聚乙烯亞胺 (Polyethyleneimine，PEI) 作為聚合單體，在交聯(lián)劑癸二酰氯的作用下通過界面聚合得到脂肪酶微囊，利用共聚焦顯微鏡觀察其顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)PEI聚合體與酶蛋白均分布于微囊表面(圖12)。此后，利用碳納米管進(jìn)行修飾，使得油水界面得到強(qiáng)化，降低了PEI攜帶的正電荷，大大提高了脂肪酶的催化活力。

圖11 油包水微囊示意圖[69] (黑點(diǎn)與白塊分別表示親水與疏水結(jié)構(gòu)，藍(lán)色與黃色分別表示水相與油相，位于油水界面的酶，其活性結(jié)構(gòu)被激活，如圖所示白色缺口打開變大)Fig.11 Water in oil emulsion[69].Black point: hydrophilic structure; white block: hydrophobic structure.

圖12 微囊內(nèi)部的蛋白質(zhì)分布[73]Fig.12 The distribution of protein in microcapsule[73].(A) PEI.(B) Protein.(C) Overlapped.

2.4 其他新型固定化技術(shù)

隨著固定化技術(shù)研究的發(fā)展創(chuàng)新，除了以上幾種公認(rèn)分類之外，還有一些新提出的固定化技術(shù)，策略獨(dú)特且具有極大的發(fā)展應(yīng)用潛力。以“智能固定化”技術(shù)為例，這種固定化技術(shù)利用智能高聚物材料為固定化載體，所制備得到的固定化酶繼承了載體所擁有的特性。智能高聚物材料也叫作高分子智能材料，在其所處環(huán)境條件 (溫度、pH、壓力、磁場等) 發(fā)生變化而產(chǎn)生刺激時，其物理性質(zhì)和/或化學(xué)性質(zhì)會發(fā)生一定的變化，例如一些聚合物在溫度較低時呈液態(tài)，而當(dāng)溫度升高則逐漸固化且具有極強(qiáng)的物理抗性。如圖 13所示，Cirillo等[74]將胃蛋白酶共價連接在其熱應(yīng)答水凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈上，所得固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在重復(fù)使用6次后，其酶活回收率仍在80%以上。

新型固定化技術(shù)的研究種類繁多，很難將其進(jìn)行精準(zhǔn)的分類，通常以固定化酶主要展現(xiàn)出的性質(zhì)或制備過程中的典型工藝為分類依據(jù)。目前新型固定化技術(shù)的研究目標(biāo)主要集中于進(jìn)一步提高酶活，增強(qiáng)固定化酶環(huán)境耐受性、操作穩(wěn)定性，以及實(shí)現(xiàn)酶的精準(zhǔn)定向固定化。但新型固定化技術(shù)的研究容易陷入制備過程繁瑣、生產(chǎn)投入較高的缺陷之中，需要大量基礎(chǔ)研究和優(yōu)化手段來完善，應(yīng)適當(dāng)選擇一些工業(yè)應(yīng)用潛力較大的固定化技術(shù)進(jìn)行小規(guī)模或中等規(guī)模的制備與應(yīng)用測試，逐步實(shí)現(xiàn)固定化酶的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

圖13 熱應(yīng)答水凝膠“按需”催化示意圖[74]Fig.13 Schematic representation of ‘‘on-demand’’catalysis by thermo-responsive hydrogels[74].

3 固定化酶的應(yīng)用

生物酶制劑具有催化效率高、反應(yīng)類型多樣、綠色、環(huán)境友好等優(yōu)良特性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于許多實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中。固定化酶最早被應(yīng)用于食品行業(yè)，最典型的應(yīng)用是固定化乳糖酶在乳制品生產(chǎn)中的應(yīng)用，鮮奶中一般都有較高含量的乳糖，一些乳糖不耐癥患者在攝入后可發(fā)生胃痙攣、腹瀉等癥狀，且乳糖在低溫環(huán)境中易結(jié)晶，影響一些低溫乳制品的口感和風(fēng)味，在乳制品的生產(chǎn)過程中，利用固定化的乳糖酶對乳制品進(jìn)行充分處理，能有效解決上述問題。除此之外，固定化酶在生物傳感器、醫(yī)療診斷、藥物制備、環(huán)境治理和生物能源等領(lǐng)域也有著大量的應(yīng)用[75-76]。生物傳感器由于其簡單、快速、靈敏、專一且成本較低的特點(diǎn)，使其成為了目前傳感器研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)[77]。新型固定化技術(shù)進(jìn)一步提高了生物酶制劑的催化活力和操作穩(wěn)定性，簡化了回收過程，能大大減少酶制劑的生產(chǎn)成本，對生物酶的實(shí)際工業(yè)應(yīng)用具有重大意義。

在生物能源應(yīng)用中，大量研究報道了固定化酶在生物柴油制備中的應(yīng)用，而反應(yīng)體系以油相為主，粘度較大，使得固定化酶易發(fā)生蛋白脫落，并且酶與底物分離困難而重復(fù)利用性差。相比于用天然沸石、殼聚糖等為載體的傳統(tǒng)固定化方法，范艷利等[27]利用磁化的樹狀分子定向固定化了米赫根毛霉脂肪酶，該固定化酶結(jié)合穩(wěn)定，且具有磁性，可利用磁場作用力實(shí)現(xiàn)固定化酶與反應(yīng)體系的快速分離，操作簡單且反應(yīng)穩(wěn)定，能有效解決傳統(tǒng)固定化技術(shù)的應(yīng)用障礙。

酶促手性拆分藥物中間體是酶制劑在藥物制備領(lǐng)域內(nèi)的重要應(yīng)用之一。Hara等[78]利用凝膠交聯(lián)法制備了固定化洋蔥伯克霍德菌脂肪酶(BCL)，其催化 1-苯乙醇到達(dá)反應(yīng)平衡所需時間在24 h以上，而本團(tuán)隊(duì)利用新型固定化載體碳納米管吸附固定化BCL，其催化拆分1-苯乙醇平衡反應(yīng)時間只需要10 min[22]，表明新型固定化材料對酶催化效率的提高具有極大探索價值和應(yīng)用潛力。

在環(huán)境治理應(yīng)用上，漆酶在廢水處理和有毒化合物降解中有著廣泛的應(yīng)用。20世紀(jì)80年代以來，漆酶的降解能力被逐步研究和發(fā)現(xiàn)，其早期固定化研究主要集中于海藻酸鈉包埋、殼聚糖吸附、凝膠雜化等方法，其操作穩(wěn)定性和重復(fù)利用性均較低。龐仕龍[79]合成了兩種帶有羧酸基團(tuán)的金屬有機(jī)骨架介孔材料Cu-MOF和Zr-MOF，并用其吸附固定化漆酶，所得固定化酶的重復(fù)性好，且在水相中儲存3周后，酶活回收率仍能保持在55%以上，表明其具有良好的操作穩(wěn)定性，體現(xiàn)了新型固定化技術(shù)的發(fā)展優(yōu)勢。

4 總結(jié)與展望

近年來，固定化技術(shù)的創(chuàng)新研究已經(jīng)受到了眾多領(lǐng)域內(nèi)研究人員的關(guān)注，大量的探索研究不斷涌現(xiàn)，取得了一定的進(jìn)步與創(chuàng)新。但固定化技術(shù)仍存在一個關(guān)鍵性的問題，即缺乏普適性，對于不同的酶、不同的載體、不同的反應(yīng)，其最佳固定化方法都不盡相同。另一方面，研究人員對固定化技術(shù)影響酶催化效率的深層機(jī)理仍缺乏足夠的理解，在固定化技術(shù)的研究中，缺乏細(xì)節(jié)性設(shè)計(jì)。結(jié)合本團(tuán)隊(duì)十余年對固定化技術(shù)研究的理解，對其未來的發(fā)展主要提出以下3點(diǎn)建議：

1) 建立一個包含固定化酶、載體和方法的數(shù)據(jù)庫；使研究人員在針對某種酶分子設(shè)計(jì)固定化方法時能夠有充分、可靠、便捷的技術(shù)平臺支持。

2) 增強(qiáng)技術(shù)創(chuàng)新與生物信息學(xué)、材料學(xué)和化學(xué)等相關(guān)學(xué)科的交叉合作；利用生物信息模擬和預(yù)測技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代物理化學(xué)的表征手段，對固定化影響酶分子的機(jī)理進(jìn)行深入探究，以期加強(qiáng)固定化技術(shù)的設(shè)計(jì)性和可預(yù)測性。

3) 學(xué)術(shù)型科研團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)與相關(guān)企業(yè)或工廠研發(fā)團(tuán)隊(duì)合作；使在實(shí)驗(yàn)室階段取得成功的固定化技術(shù)能夠及時受到實(shí)際應(yīng)用的檢驗(yàn)，通過企業(yè)或工廠研發(fā)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行中等規(guī)模、大規(guī)模制備與應(yīng)用的嘗試和優(yōu)化，加快固定化酶在實(shí)際生產(chǎn)生活中的應(yīng)用。同時，能及時對固定化技術(shù)的研究方向與重點(diǎn)給出有效的反饋與建議。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和材料、化工等相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，酶的固定化技術(shù)的發(fā)展正逐步由粗放轉(zhuǎn)向精細(xì)，由定性轉(zhuǎn)向定量，由無序轉(zhuǎn)向定向，在未來的固定化技術(shù)研究中，研究策略的目的性、設(shè)計(jì)性以及預(yù)測性將是新興技術(shù)的特點(diǎn)與亮點(diǎn)所在，而高品質(zhì)固定化酶的獲取與有效應(yīng)用仍是該領(lǐng)域內(nèi)研究人員追求的最終目標(biāo)。

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