孫小寶，萬嘉欣，曹佳雯，斯越秀，王謙

浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100

碳水化合物是自然界中重要的化學(xué)物質(zhì)，是地球上生命存在的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。木質(zhì)纖維素是植物細胞壁的主要組成部分 (占90%以上)，主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，是自然界中分布廣泛且數(shù)量極多的生物質(zhì)資源。由于缺乏有效的利用方式，植物莖桿等廢棄物絕大部分被焚燒，不僅造成資源浪費，而且加劇環(huán)境污染，亟需尋找對其進行綜合利用的途徑。然而，纖維素等多聚糖需要被降解成寡糖或單糖后才能被有效利用。目前，木質(zhì)纖維素的降解方法主要有化學(xué)水解法和酶水解法。與化學(xué)法相比，酶水解法具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、環(huán)境友好等優(yōu)點，因而受到廣泛關(guān)注。利用微生物產(chǎn)生的糖苷水解酶(Glycosyl hydrolase, GH) 分解和轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素，是生物質(zhì)利用的有效途徑，近年來對于糖苷水解酶的研究取得了很大進展[1]。從化學(xué)反應(yīng)過程來看，GH水解纖維素生成葡萄糖的過程主要涉及α/β-1,4-糖苷鍵的斷裂，很難對結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜的木質(zhì)纖維素進行有效降解。一方面，由于木質(zhì)纖維素物理結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相鄰的多糖鏈之間可通過氫鍵形成高度有序的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，許多天然的纖維素還包埋在木質(zhì)素和半纖維素中，這些復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使木質(zhì)纖維素的降解難度增加；另一方面，由于GH酶活性低下、不耐高溫、不耐酸堿或反應(yīng)過程中存在抑制劑等因素，極大制約了其規(guī)?；膽?yīng)用。此外，植物細胞壁中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等組分呈復(fù)雜的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，單一水解酶很難有效分解。

最新研究表明，最初被碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫 (Carbonhydrate-activity enzymes database，CAZy) 劃分為糖苷水解酶61家族 (GH61) 和碳水化合物結(jié)合域 33家族 (Carbohydrate-binding module family 33，CBM33) 的一些成員具有多糖單加氧酶的活性[2-3]。這一重大發(fā)現(xiàn)改變了傳統(tǒng)酶法降解結(jié)晶多糖的模式，也使得GH61成為了木質(zhì)纖維素資源開發(fā)研究的新熱點，這些基因被稱為溶解性多糖單加氧酶 (Lytic polysaccharide monooxygenase, LPMO/PMO)。

傳統(tǒng)的木質(zhì)纖維素降解過程主要是在外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖酶等一系列水解酶的作用下，通過打斷糖苷鍵的方式來降解木質(zhì)纖維素。與傳統(tǒng)GH水解多聚糖鏈的方式不同，LPMO能夠通過氧化作用斷裂糖苷鍵產(chǎn)生寡糖鏈，暴露更多糖苷水解酶結(jié)合的位點，從而加快反應(yīng)進程，提高寡糖或單糖的生成量 (圖 1)[4]。因此，LPMO是一種全新的生物質(zhì)降解酶，改變并進一步豐富了生物質(zhì)的降解模式。

1 LPMO的發(fā)現(xiàn)

LPMO廣泛存在于細菌與真菌中。早在20世紀 80年代，研究人員在粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens中發(fā)現(xiàn)了一種分子量較小 (約21 kDa)的CBM33家族蛋白[5]。到了90年代，Suzuki等[6]發(fā)現(xiàn)它對β-幾丁質(zhì)有很強的結(jié)合力，因此命名為幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白 (Chitin binding protein，CBP21)。2010年，Vaaje-Kolstad等[7-8]進一步通過對粘質(zhì)沙雷氏菌來源的CBP21研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白是一種氧化酶，在氧和電子供體的存在下，能夠隨機氧化裂解幾丁質(zhì)的多糖鏈。并且，CBP21是一種金屬依賴性酶，通過添加金屬螯合劑EDTA和突變金屬結(jié)合位點，會引起蛋白失活。進一步研究顯示，CBP21活性可能與銅離子等二價金屬離子密切相關(guān)[9]。由于其具有一定的內(nèi)切葡聚糖酶活性，CBP21最初被劃分為GH61家族。

圖1 LPMO參與纖維素降解的工作模型Fig.1 LPMO participates in a working model of the degradation of cellulose.

2011年，研究人員發(fā)現(xiàn)來自太瑞斯梭殼孢霉Thielavia terrestris的 GH61E和嗜熱子囊菌Thermoascus aurantiacus的GH61A對木質(zhì)纖維素和傳統(tǒng)的糖苷酶底物均無水解作用。但將太瑞斯梭殼孢霉的發(fā)酵液與等量的瑞氏木霉Trichoderma reesei復(fù)合纖維素酶混合后，纖維素降解效果較好，糖轉(zhuǎn)化的效率明顯提高。即使復(fù)合纖維素酶的總量減少一半，仍能保證相同的水解效果。進一步通過比較太瑞斯梭殼孢霉和瑞氏木霉胞外纖維素酶系的差別，發(fā)現(xiàn)3個可能與糖轉(zhuǎn)化相關(guān)的胞外酶GH61B、GH61E和GH61G。它們并不屬于GH61家族，但可以顯著提高纖維素酶對經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸稈的水解作用[10]。直到2011年底，這些酶才被正式命名為LPMO/PMO。此后，更多的研究證明這些酶并不是真正的糖苷水解酶，而屬于氧化酶類[11]。

2 LPMO的結(jié)構(gòu)與催化機制

研究人員利用多重同晶置換 (Multiple isomorphous replacement，MIR) 獲得太瑞斯梭殼孢霉的 GH61E的三維結(jié)構(gòu) (圖 2)。GH61E是一個結(jié)構(gòu)致密、含有兩個β折疊所組成的三明治結(jié)構(gòu)，同時具有金屬離子的結(jié)合位點。在金屬離子存在的情況下，LPMO才能發(fā)揮它的氧化功能。GH61E和TrGH61B蛋白結(jié)構(gòu)在靠近蛋白N末端都有3個高度保守的組氨酸，這些氨基酸可能與金屬離子結(jié)合、傳遞電子過程有著重要聯(lián)系[10]。

圖2 LPMO的三維結(jié)構(gòu)[10]Fig.2 The three-dimensional structures of LPMOs[10].(A) GH61E.(B) TrGH61B (PDB ID 2VTC).(C) Cellulosebinding modulefamily 1 (PDB ID 1CBH).

目前，對于LPMO確切的作用機制仍不清楚。通常認為，在氧分子和電子供體存在時，LPMO可氧化斷裂多聚糖主鏈的β-1,4糖苷鍵，釋放出寡糖，用于后續(xù)的進一步降解。電子供體通常為小分子還原劑，如抗壞血酸和沒食子酸或纖維二糖脫氫酶 (Cellobiose dehydrogenase，CDH) 等酶類還原劑[12]。研究人員利用電子順磁共振 (Electron paramagnetic resonance，EPR) 對LPMO的功能位點構(gòu)象和動力學(xué)特性進行分析，發(fā)現(xiàn)LPMO的催化過程需要二價金屬離子 (如 Cu2+、Co2+、Fe2+等) 才能發(fā)揮作用釋放出寡糖[7,13-15]。進一步研究顯示，LPMO是通過銅離子在Cu+與Cu2+之間的轉(zhuǎn)變來催化底物 (圖3)[16-18]。CDH蛋白含有兩個結(jié)構(gòu)域，分別是結(jié)合黃素腺嘌呤二核苷酸 (Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD) 的脫氫酶結(jié)構(gòu)域(Dehydrogenase domain，DH) 和結(jié)合細胞色素結(jié)構(gòu)域 (Cytochrome domain，CYT)。催化過程中，F(xiàn)AD被還原成FADH2產(chǎn)生電子，與此同時，在有氧環(huán)境中LPMO與Cu離子結(jié)合，形成LPMO-Cu(II)復(fù)合物。CDH產(chǎn)生的電子可將 LPMO-Cu(II)復(fù)合物轉(zhuǎn)化成LPMO-Cu(I)復(fù)合物 (圖3A)，該復(fù)合物隨后與氧分子結(jié)合，氧分子的電子轉(zhuǎn)移給 Cu從而形成 Cu的過氧化物中間體。該中間體能夠從多糖鏈內(nèi)部的葡萄糖單體C1或C4位置奪取1個氫原子，形成碳水化合物多糖的自由基和過氧化氫銅的中間體。CDH的電子會使中間體的O-O鍵發(fā)生斷裂，釋放出水分子并形成銅氧自由基，與之前形成的自由基發(fā)生偶合，在C1或C4位置生成羥基化的多糖，最終生成醛酮糖或者糖內(nèi)酯(圖 3B)[12-13,19]。

LPMO的氧化作用可發(fā)生在多聚糖糖環(huán)上C1、C4和C6位，其中以C1和 (或) C4較為常見。2014年，F(xiàn)orsberg等[20]發(fā)現(xiàn)來自天藍色鏈霉菌Streptomyces coelicolor的ScLPMO10B的氧化作用發(fā)生在C1和C4位。因此，根據(jù)LPMO催化機制的不同，可以將其大致分為 PMO-1型、PMO-2型和PMO-3型3類。其中PMO-1型作用于C1，從多糖鏈葡萄糖單體的 C1奪取氧原子產(chǎn)生內(nèi)酯型糖，接著內(nèi)酯型的糖被轉(zhuǎn)化為醛糖酸，該醛酮糖被磷酸化之后，通過磷酸戊糖途徑被代謝；PMO-2型作用于C4，從多糖鏈葡萄糖單體的C4奪取氫原子生產(chǎn)非還原端被氧化的醛酮糖；PMO-3型作用于 C1或 C4位[21]，但由于 C4和C6催化產(chǎn)物具有相同的分子量，多數(shù)研究者對于是否發(fā)生 C6氧化仍存在爭議，需要進一步實驗驗證。

圖3 LPMO反應(yīng)過程中經(jīng)電子供體介導(dǎo)Cu+與Cu2+互相轉(zhuǎn)化的催化機制Fig.3 Bioconversion between Cu+ and Cu2+ during LPMO catalysis via electron donor.

基于LPMO的氧化作用和糖苷水解酶的水解作用，LPMO與不同糖苷水解酶 (如葡聚糖酶、木聚糖酶、纖維二糖脫氫酶等) 協(xié)同作用時，可顯著提高木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化效果。前期工作中，我們將來自枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的LPMO與甘露聚糖酶協(xié)同催化底物，發(fā)現(xiàn)可提高甘露聚糖底物的轉(zhuǎn)化效率 (數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。反應(yīng)過程中，LPMO以氧化方式打斷多糖長鏈，釋放出更多還原端，與糖苷水解酶協(xié)同、發(fā)揮加成作用，大幅度提高酶解效率[22]。如圖1所示，內(nèi)切葡聚糖和外切葡聚糖酶單獨作用時，很難水解纖維素的結(jié)晶區(qū)；當(dāng)與LPMO協(xié)同作用時，LPMO在電子供體CDH及金屬離子存在下，隨機斷裂纖維素結(jié)晶區(qū)間的糖苷鍵，暴露出更多還原端，有助于內(nèi)切葡聚糖和外切葡聚糖酶結(jié)合在纖維素鏈的結(jié)晶區(qū)上，從而加快纖維素的降解速率 (圖1)。

3 LPMO的分類

根據(jù)LPMO催化糖環(huán)上的位點不同，可大致將其分為 3類：PMO-1、PMO-2和 PMO-3型。但這種方式不能對LPMO進行合理分類，甚至有些酶可同時歸為PMO-1型和PMO-3型，從而產(chǎn)生混淆。隨著更多深入研究的開展，研究人員發(fā)現(xiàn)不同家族的LPMO不僅來源不同，其對底物的選擇性也不相同。部分LPMO同時還具有纖維素的降解能力[23]、幾丁質(zhì)的降解能力[24]或淀粉的降解能力[22]。

2013年，Levasseur等[3]通過系統(tǒng)分析 CAZy數(shù)據(jù)庫中的LPMO蛋白來源和底物類型等信息，將LPMO重新劃分為輔助酶類家族 (Auxiliary activity，AA)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析也表明，總體聚類形成 4個基因簇，分別為 AA9、AA10、AA11和AA13家族 (圖4)。其中，AA9、AA11和AA13家族LPMO主要在真菌中發(fā)現(xiàn)。AA10家族則是以細菌為主，但也含有少量真核生物和病毒。Meera等[25]從煙曲霉MKU1克隆得到的AA9家族蛋白對羧甲基纖維素鈉底物催化活性最高，達到0.549 IU/mg。而來自奇跡束絲放線菌Actinosynnema mirumDSM 43827的Am5屬于AA10家族，對幾丁質(zhì)有氧化活性且吸附作用較強，但對纖維素?zé)o催化能力且吸附能力較弱[26]。研究顯示，AA10家族的 LPMO對不同形態(tài)的同一底物，結(jié)合能力也不相同。如來自蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis的BtLPMO10A[27]、灰色鏈霉菌Streptomyces griseus的SgLPMO10F[28]以及李斯特氏菌Listeria monocytogenes的LmLPMO10[29]對α和β-幾丁質(zhì)均具有很強的吸附能力，對微晶纖維素、膠體幾丁質(zhì)(Colloidal chitin) 和幾丁質(zhì)珠 (Chitin beads) 吸附能力較弱。值得注意的是，LmLPMO10對纖維素的吸附能力也很強。

圖4 LPMOs系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of LPMOs.

綜上所述，AA9家族LPMO作用的底物主要為纖維素。AA10和AA11家族LPMO作用的底物主要為幾丁質(zhì)，也有少數(shù)成員可催化纖維素[30]。AA13家族LPMO可催化淀粉降解 (表1)。此外，原來的GH61家族和CBM33家族蛋白分別被劃為AA9和AA10家族。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，所有LPMO成熟肽序列第一個氨基酸都含有一個完全保守的組氨酸。同時，第二個組氨酸結(jié)合中心附近存在相對保守的序列排布規(guī)律。其中，AA9家族為 H-X8-Q/E-X-Y，AA10家族為 R-X4-E-X-F或H-X2-Q-X-Y，AA11家族為N-X-E-X-Y，AA13家族為 Q-X2-Q-X-Y (圖 5)[19]。

4 LPMO活性測定方法

糖苷水解酶活性測定的方法主要通過測定產(chǎn)物的生量成以及底物的消耗量來實現(xiàn)的。然而，LPMO是具有氧化活性的酶，直接催化底物降解的效率并不高，因此很難實現(xiàn)直接測定寡糖生成量來實現(xiàn)酶活測定。目前，測定LPMO活性的方法主要包括以下幾種。

表1 LPMO的分類、來源及特征Table 1 Subfamily, organism and characteristics of LPMOs

圖5 LPMOs氨基酸序列比對Fig.5 Amino acid sequence alignment of LPMOs.

4.1 DNS法

將 LPMO與糖苷水解酶協(xié)同作用纖維素底物，與DNS試劑混合后加熱顯色，測定還原糖的OD540吸光值，通過對比單獨測活以及協(xié)同測活以產(chǎn)物的提高量來判定LPMO活性。該方法操作簡便，成本低，但靈敏度較低，只能檢測到還原性糖，對于部分產(chǎn)物如一些非還原性的寡糖則無法檢測。此外，LPMO微弱的活性容易被背景干擾。

4.2 色譜/質(zhì)譜法

采用電噴霧-飛行時間/質(zhì)譜 (Electrospray ionization-time-of-flight-mass spectrometry，ESITOF/MS) 正離子模式對產(chǎn)物進行分析鑒定，可與糖苷水解酶協(xié)同反應(yīng)后檢測寡糖生成量。如LPMO(Am5)、4 μmol/L抗壞血酸與幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解幾丁質(zhì)，在37 ℃下反應(yīng)24 h，產(chǎn)物為幾丁四糖酸、幾丁五糖酸和幾丁六糖酸，可提高幾丁質(zhì)酶 60%的水解效率[26]。Forsberg等[43]將ScLPMO10B 在2 mmol/L抗壞血酸、20 mmol/L醋酸銨 (pH 6) 緩沖液中單獨反應(yīng)以及與纖維素酶 CelS2協(xié)同作用水解纖維素底物，反應(yīng)8-16 h，與單獨反應(yīng)相比，協(xié)同作用的水解效率明顯提高6倍左右，并通過高效離子色譜 (High performance anion exchange chromatography，HPAEC) 對產(chǎn)物進行分析，產(chǎn)物中成功分離出聚合度為 2-8的纖維寡糖，并通過質(zhì)譜成功鑒定其氧化位點是C4位。Westereng等[24]通過超高效液相色譜 (Ultra-high-performance liquid chromatography，UHPLC)，在紫外檢測器下測得產(chǎn)物聚合度為4-10的纖維寡糖。該方法可以高效且快速地對產(chǎn)物含量、結(jié)構(gòu)進行分析，適用于對極微量寡糖的檢測，分辨率與靈敏度高。雖然色譜/質(zhì)譜法操作較為復(fù)雜，且需要專門的工作站，但目前仍是最為有效、廣泛采用的方法。

4.3 熒光分析法

針對LPMO測活較為困難的現(xiàn)狀，Kittl等[44]提出了一種基于Amplex Red試劑的熒光分析法。Amplex Red是一種良好的過氧化物酶熒光底物，是高度靈敏和穩(wěn)定的H2O2探針。LPMO與O2在CDH、抗壞血酸或纖維二糖提供電子的情況下形成 H2O2，當(dāng)反應(yīng)體系中存在辣根過氧化物酶(Horse radish peroxidase，HRP) 時，Amplex Red試劑與H2O2以1∶1定量比反應(yīng)，形成高熒光的試鹵靈 (Resorufin)，可用于定量分析。該方法靈敏度很高，但穩(wěn)定性較差，所以在測定LPMO活性上并沒有被廣泛應(yīng)用。

5 LPMO的應(yīng)用

5.1 飼料添加劑

谷實類籽粒細胞壁主要由非淀粉多糖(Non-starch polysaccharide, NSP) 組成。NSP是除淀粉以外的多糖類物質(zhì)，是谷物類飼料中一種主要的抗營養(yǎng)因子，其抗營養(yǎng)作用主要體現(xiàn)在溶于水后具有高度粘性。在牛、羊等反芻動物的瘤胃中存在大量能催化木質(zhì)纖維素降解的瘤胃細菌、原蟲和真菌，通過酶的催化使纖維素和半纖維素分解為瘤胃能夠吸收的小分子物質(zhì)[45]。然而，家禽等單胃動物體內(nèi)不能產(chǎn)生降解NSP的酶類，動物采食后，會增加腸道食糜的粘度，降低胃腸道運動對食糜的混合效率，從而影響消化酶與底物接觸和消化產(chǎn)物向小腸上皮絨毛滲透擴散，阻礙飼料消化和養(yǎng)分吸收[46]。此外，NSP還會引起腸粘膜形態(tài)和功能的變化，導(dǎo)致雛禽胰腺腫大[47]。因此，在飼料中添加LPMO與糖苷水解酶可有效降解NSP，消除其抗營養(yǎng)作用。同時，生成功能性低聚寡糖等益生元，減少家畜胃腸道病害，促進動物健康生長。

5.2 功能性食品

低聚寡糖是指含有 2-10個單糖通過糖苷鍵聚合而成的化合物，廣泛參與生命體的生理生化反應(yīng)，如促進機體的健康發(fā)育、降低齲齒，能部分或全部替代口香糖、糕點和糖果中的糖類[48]。大多數(shù)功能性寡糖不被人體消化吸收，因此糖尿病和高血壓等慢性疾病患者均可以食用。

寡糖可作為底物被腸道內(nèi)的微生物發(fā)酵利用從而降低了腸道內(nèi) pH值，促進腸道屏障功能、營養(yǎng)吸收和免疫能力，減少腸道病原微生物。在飼糧中添加 0.2%纖維寡糖可使生長豬平均日重提高7.51% (P<0.05)，料重降低5.93% (P<0.05)[49]。研究表明，殼寡糖能顯著促進生長期大鼠胰島β細胞的生長和胰島素的釋放，為糖尿病患者的治療提供新的途徑[50]。糖苷水解酶可通過水解多聚糖生成低聚寡糖，額外加入LPMO與糖苷水解酶協(xié)同作用，可進一步提升寡糖的生產(chǎn)效率，在功能性食品領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

5.3 生物能源

木質(zhì)纖維素乙醇是指以林業(yè)如灌木、喬木枝葉干等森林廢棄物或農(nóng)副產(chǎn)品秸稈、玉米芯、中藥渣等為原料，通過木質(zhì)纖維素的降解發(fā)酵等工藝生產(chǎn)生物乙醇[51-52]。生物乙醇的轉(zhuǎn)化主要包括纖維素降解成單糖和單糖生物發(fā)酵兩個階段。其中，催化多聚糖生成可發(fā)酵單糖是生物乙醇制備的關(guān)鍵步驟，利用高效的纖維素降解菌或添加高效纖維素酶是提高木質(zhì)纖維素水解效率的常用手段[53]。將 LPMO應(yīng)用于單糖的生物轉(zhuǎn)化，發(fā)揮LPMO的氧化作用，協(xié)同糖苷水解酶的水解作用，是高效降解木質(zhì)纖維素生成單糖、進一步糖酵解途徑生產(chǎn)生物乙醇的有效途徑。

6 結(jié)語

木質(zhì)纖維素因其組分的異質(zhì)性和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，只有將其降解成寡糖或單糖才能更好地發(fā)揮作用。LPMO以氧化方式作用于多聚糖長鏈，豐富了木質(zhì)纖維素的降解模式。當(dāng)與糖苷水解酶協(xié)同作用時，可加速降解底物的降解效率，如何最大程度地開發(fā)其商業(yè)應(yīng)用潛力成為新的挑戰(zhàn)。目前，丹麥諾維信公司嘗試將LPMO加入到復(fù)合纖維素酶 Ce11icCTec3中，使纖維素乙醇生產(chǎn)成本降到約2美元/加侖，接近淀粉酒精和汽油的生產(chǎn)成本。這為利用LPMO高效降解木質(zhì)纖維素、進一步開發(fā)生物乙醇提供了良好示范。

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