帥常娟 劉淑云 姚宇 楊燁 殷澤登

氧化應激是細胞氧化-抗氧化失衡而導致的應激損傷狀態(tài)，研究證實氧化應激是導致老化的重要原因之一[1～3]。沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator1, SIRT1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷依賴的蛋白脫乙?；?，可通過脫乙酰化激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1α (peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator 1α, PGC-1α)等底物調節(jié)細胞內氧化應激狀態(tài)，從而保護細胞免受氧化應激損傷[4～7]。PGC-1α是近年來發(fā)現(xiàn)的在抗氧化應激系統(tǒng)中起關鍵作用的轉錄調節(jié)因子，能夠誘導細胞抗氧化酶的表達，提高組織抗氧化能力[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)聽覺中樞老化可能與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性降低所導致的抗氧化功能下降有關，電針“聽宮”和“翳風”兩個穴位可提高SOD活性，能在一定程度上抑制D-半乳糖所致的豚鼠聽覺中樞的老化過程[9]，但有關通過電針耳穴提高聽覺中樞抗氧化能力的分子信號轉導途徑尚不清楚。研究表明，SIRT1/PGC-1α途徑參與年齡相關性骨骼肌老化萎縮和聽力損失過程[10～12]。本研究擬從mRNA水平和蛋白水平檢測D-半乳糖致年齡相關性聾豚鼠聽皮層SIRT1、PGC-1α表達，并觀察電針“聽宮”穴和“翳風”穴對其表達的影響，探討SIRT1/PGC-1α 途徑在年齡相關性聾豚鼠聽皮層老化過程中的作用以及電針耳穴是否通過SIRT1/PGC-1α途徑調節(jié)聽皮層的老化過程。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取耳廓反射靈敏、無噪聲暴露及耳毒性藥物使用史的4月齡豚鼠30只(體重230～400 g)，隨機分為對照組、D-半乳糖模型組(簡稱模型組)、D-半乳糖模型+電針組(簡稱電針組)，每組10只；以18月齡豚鼠10只(體重500～700 g)為老年組。豚鼠均由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2實驗方法

1.2.1D-半乳糖致年齡相關性聾豚鼠造模 參照李君梅等建立的方法[9]，模型組及電針組豚鼠頸背部皮下注射D-半乳糖300 mg·kg-1·d-1，對照組予以注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)6周。老年組豚鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不作任何處理。在飼養(yǎng)過程中，仔細觀察各組動物的外觀及表現(xiàn)。

1.2.2電針方法 清醒狀態(tài)下，電針組豚鼠固定后取雙側“聽宮”穴和“翳風”穴[13, 14]，用HM6805-I型經穴治療儀(HM6805-I型，1100801072，四川恒明科技開發(fā)有限公司)刺激，疏密波，頻率14 Hz，強度0.4～0.6 mA，連續(xù)輸出，9次/秒，持續(xù)刺激15 min，每天一次，連續(xù)6周。刺激強度以針刺附近豚鼠耳廓顫動，四肢輕抖動但不掙扎嘶叫為度[15]。

1.2.3ABR檢測 采用Kong等[16]建立的方法進行ABR檢測。豚鼠造模及電針結束后，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉滿意后置于隔聲屏蔽室內，環(huán)境溫度(25±3) ℃，應用聽覺腦干誘發(fā)電位儀(Intelligent Hearing Systems, 美國)測試。記錄電極置于顱頂，參考電極置于雙側耳廓背面，接地電極置于鼻尖。刺激聲為短聲，雙耳同時刺激、記錄，聲刺激強度從100 dB SPL 開始，掃描時間25 μs，疊加次數(shù)為1 024次，刺激間隔19.30次/秒，最大刺激強度為132 dB SPL，刺激強度按10 dB遞減，接近閾值時，按5 dB遞減,記錄各組ABR反應閾。

1.2.4動物聽皮層取材 ABR測試完成后，動物麻醉未醒前，迅速斷頭，暴露顱腔，參照Schofield等[17]的方法對雙側聽皮層解剖定位后于無菌臺上取出，立即用4 ℃生理鹽水洗凈血跡后凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測聽皮層SIRT1、PGC-1α mRNA的表達 聽皮層于液氮中研磨后，按照離心柱型RNA提取分離試劑盒(DP419, 北京天根生化科技有限公司，中國)的步驟提取總RNA。用分光光度計(ND-100, NanoDrop公司, 美國)測定總RNA的濃度和純度，并通過電泳鑒定其完整性。按逆轉錄試劑盒(FSQ-201, TOYOBO, 日本)說明，以所提取的RNA為模版逆轉錄得到cDNA，PCR擴增。參考Khan-Malek等[18]的方法對PCR結果進行統(tǒng)計分析。PCR引物相關信息見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物相關信息

1.2.6Western Blot法檢測豚鼠聽皮層組織SIRT1、PGC-1α蛋白表達 蛋白提取后，采用BCA法測定蛋白含量。4%濃縮膠和10%分離膠分離蛋白質樣品，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V；采用濕轉法轉膜，脫脂牛奶進行封閉，SIRT1蛋白一抗(9475s, 上海優(yōu)寧維科技股份有限公司, 中國)、PGC-1α蛋白一抗(ab54481, 上海復申生物科技有限公司, 中國)和內參一抗(β-actin)4 ℃冰箱中孵育過夜，二抗(bs-0295G-HRP, 北京博奧森生物技術有限公司, 中國)置于脫色搖床上低速震蕩室溫孵育1 h。底物發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照。使用Quantity one凝膠成像系統(tǒng)分析條帶的灰度值，為避免人為因素的誤差，采用目的蛋白與相應內參灰度的比值作為蛋白的相對表達量，進行半定量檢測，并進行統(tǒng)計分析。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據分析，結果以均數(shù)±標準差表示，應用單因素方差分析，方差齊時，組間比較采用LSD檢驗。

2 結果

2.1各組豚鼠ABR閾值 對照組、模型組、電針組和老年組的ABR閾值分別為：35.75±4.66、74.5±5.59、44.4±7.92和76.5±7.8 dB SPL。與對照組比較，模型組和老年組ABR閾值升高(P模型組<0.00 1；P老年組<0.00 1)；與模型組和老年組相比，電針組ABR閾值降低(P<0.00 1)；模型組與老年組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.344)。

2.2豚鼠聽皮層STR1/PGC-1α mRNA表達 各組豚鼠聽皮層SIRT1/PGC-1α mRNA相對表達量見表2。與對照組比較，老年組和模型組SIRT1、PGC-1α mRNA表達降低(P老年組SIRT1=0.02;P老年組PGC-1α<0.00 1;P模型組SIRT1=0.01;P模型組PGC-1α<0.00 1)；與模型組比較，電針組SIRT1、PGC-1α mRNA表達增加(P電針組SIRT1=0.011,P電針組PGC-1α<0.00 1)；與老年組相比較，電針組SIRT1、PGC-1α mRNA表達增加(P電針組SIRT1=0.016；P電針組PGC-1α<0.001)；模型組和老年組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(PPGC-1α=0.536;PSIRT1=0.814)。

表2 各組豚鼠聽皮層SIRT1、PGC-1α mRNA相對表達量

注：★與對照組比較；◆與模型組比較；△與老年組比較，P<0.01

2.3豚鼠聽皮層SIRT1/PGC-1α蛋白表達

各組豚鼠聽皮層SIRT1、PGC-1α蛋白表達變化見表3、圖1、2。與對照組比較，老年組和模型組SIRT1、PGC-1α蛋白水平降低(P老年組SIRT1<0.001;P老年組PGC-1α<0.001;P模型組SIRT1<0.001;P模型組PGC-1α<0.001)；與模型組比較，電針組SIRT1、PGC-1α蛋白表達增加(P電針組SIRT1<0.001,P電針組PGC-1α<0.001)；與老年組相比較，電針組SIRT1、PGC-1α 蛋白表達增加(P電針組SIRT1<0.001；P電針組PGC-1α<0.001)；模型組和老年組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(PPGC-1α=0.753;PSIRT1=0.282)。

表3 聽皮層SIRT1、PGC-1α蛋白表達相對灰度值

注：▲與對照組比較；●與模型組比較；*與老年組比較，P<0.01

圖1 各組豚鼠聽皮層SIRT1蛋白表達

圖2 各組豚鼠聽皮層PGC-1α蛋白表達

3 討論

3.1SIRT1/PGC-1α途徑在年齡相關性聾豚鼠聽皮層老化中的作用

應用D-半乳糖用于年齡相關性聾動物造模具有造模簡單、周期相對較短的優(yōu)勢，現(xiàn)已廣泛用于衰老相關的實驗研究[19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，應用D-半乳糖造模的年齡相關性聾豚鼠可表現(xiàn)出與自然衰老豚鼠相一致的聽力下降，機體氧化損傷加重，抗氧化酶活性降低，聽覺中樞老化[9,15,20]。本研究顯示，模型組豚鼠與對照組相比ABR反應閾增高，但與老年組相比，無明顯差異，提示D-半乳糖致年齡相關性聾豚鼠模型構建成功。

前期研究發(fā)現(xiàn)，聽皮層的老化可能與SOD活性降低所導致的抗氧化功能下降有關[9]，但其具體機制目前尚不清楚。近年來有研究表明，SIRT1/ PGC-1α信號途徑在氧化應激時，可促進抗氧化酶類表達增加，發(fā)揮抗氧化應激作用[21,22]。Di Emidio等[23]研究發(fā)現(xiàn)SIRT1的下游因子錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)是位于線粒體中的關鍵抗氧化酶，過表達SIRT1可通過上調Mn-SOD保護小鼠卵母細胞免受氧化應激損傷。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組和老年組豚鼠聽皮層SIRT1和PGC-1α在mRNA水平及蛋白水平的表達均顯著下調，說明SIRT1下調可能參與D-半乳糖致年齡相關性聾豚鼠的聽皮層老化。Xue等[24]研究發(fā)現(xiàn)，老年C57BL/6小鼠耳蝸毛細胞的凋亡與SIRT1和PGC-1α的表達降低有關，過表達SIRT1顯著增加了耳蝸毛細胞中PGC-1α的表達，減少氧化應激誘導的線粒體功能障礙，從而抑制細胞凋亡。本研究結果顯示與對照組相比較，模型組和老年組豚鼠聽皮層SIRT1和PGC-1α表達下調，這可能與氧化應激誘導線粒體功能障礙，從而促進細胞凋亡相關。由此推測，豚鼠聽皮層的老化可能是由于SIRT1/PGC-1α表達下調，導致SOD活性下降所致。

3.2電針耳穴通過SIRT1/PGC-1α 途徑延緩年齡相關性聾豚鼠聽皮層老化

年齡相關性聾目前尚無有效的治療藥物[25]。電針耳穴不僅能提高毛細胞及耳蝸血管紋細胞線粒體酶的活性，保障細胞能量供應[26]，而且還能促進聽神經纖維的再生[27]。前期研究表明，電針可以促進聽皮層 β-catenin蛋白表達[20]、改善聽皮層糖代謝和促進聽皮層 IGF-1表達，從而改善聽力[28]。本研究結果顯示，電針組豚鼠ABR閾值較老年組和模型組明顯降低，表明電針在一定程度上能改善年齡相關性聾豚鼠的聽功能。Dong等[29]研究發(fā)現(xiàn)，電針可通過上調SIRT1依賴的PGC-1α的表達，從而改善SAMP8小鼠腦的能量代謝。Jung等[30]研究發(fā)現(xiàn)電針可通過減少活性氧及其相關酶的產生，從而改善缺血性腦卒中患者血腦屏障功能，減輕腦水腫。這些研究說明電針能調節(jié)機體氧化應激功能。本研究結果顯示，電針組豚鼠聽皮層SIRT1和PGC-1α的mRNA和蛋白表達高于模型組和老年組，說明電針耳穴能提高SIRT1和PGC-1α的表達，本課題組前期研究也證實了電針可提高SOD的活性；說明電針能在一定程度上通過調節(jié)氧化應激抑制D-半乳糖所致的豚鼠聽皮層的老化過程[9]。

綜上所述，電針可能通過上調SIRT1/PGC-1α的表達，提高SOD的活性，提高機體抗氧化應激能力，從而延緩年齡相關性聾豚鼠聽皮層的老化過程，但其具體機制有待繼續(xù)研究。

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