邱書娟，孫秀菊，李香玲

(濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院,山東濰坊 261041)

Klotho是1997年日本學者在研究自發(fā)性高血壓小鼠模型時發(fā)現的一種具有抗衰老作用基因，Klotho基因缺陷小鼠衰老過程加快，過早出現皮膚萎縮、性腺功能減退、動脈粥樣硬化、骨質疏松等征象[1]，因此以希臘神話中掌握人類生命線的女神Klotho命名。后續(xù)研究發(fā)現，Klotho基因過表達小鼠在體內Klotho濃度2倍于野生小鼠的同時平均壽命也延長20%～30%。除抗衰老作用外，Klotho還具有抗氧化、抗凋亡、保護血管及參與機體磷代謝等多種作用，且與腎臟疾病關系密切，在多種急、慢性腎臟疾病中都檢測到其表達顯著降低，與腎功能存在相關性，本文就近年來Klotho在急性腎損傷診斷及治療中作用的研究進展進行如下綜述。

1 Klotho的生物學活性

Klotho在體內可由腎臟、腦、甲狀旁腺等多個器官分泌，以腎臟中濃度最高，主要由腎小管上皮細胞分泌[2]。除傳統的Klotho外，還有兩種同源異構體：β-Klotho和γ-Klotho，其中前者主要在膽汁酸和能量代謝中起作用，而后者的作用至今未明，基于此，最先發(fā)現的Klotho又被稱為α-Klotho，本文中仍沿用傳統名字Klotho。Klotho基因定位在人類13號染色體，其編碼的蛋白產物被不同的蛋白酶剪切后分別產生膜型和分泌型兩種形式。目前研究發(fā)現，膜型Klotho是骨源性激素成纖維生長因子23(FGF-23)的共受體，其與FGF-23及其受體結合形成復雜的共同體而發(fā)揮下游效應[3]，在機體的鈣磷代謝及凋亡中發(fā)揮作用。而分泌型Klotho被選擇性剪切后直接釋放到胞外，或由膜型Klotho蛋白的胞外部分被膜錨定蛋白酶ADAM10/17剪切后釋放出來，以內分泌激素的形式分布于血液、尿液及腦脊液中,其具有糖苷酶活性，能調節(jié)離子通道和轉運體、抑制氧化應激、抗衰老等，又稱為可溶性Klotho。

1.1 膜型Klotho 膜型Klotho作為FGF-23的共受體能增加其與受體結合物的穩(wěn)定性，從而加強其生物學作用。FGF-23是調節(jié)機體磷代謝的重要物質，能抑制腎臟分泌1-α羥化酶，降低1,25-(OH)2 VitD3的產生并加速其分解，從而減少磷在腸道的吸收，在血磷的長期調節(jié)方面起重要作用。Klotho基因缺失的純合子小鼠體內1,25-(OH)2 VitD3水平顯著升高，同時1-α羥化酶表達增加[4]，而Klotho基因的正常表達能降低1-α羥化酶活性，降低1,25-(OH)2 VitD3水平的同時減少其受體的表達，表明正常的Klotho蛋白表達對維生素D的代謝平衡非常重要。FGF-23能夠通過減少腎小管對磷的重吸收而增加尿磷，主要作用機制為抑制近端腎小管上皮細胞頂端膜的鈉-磷協同轉運蛋白Ⅱ。Klotho基因缺陷小鼠存在顯著的高磷血癥，而通過增強基因表達或補充外源性重組Koltho均能使小鼠的血磷恢復正常。有研究表明，Klotho基因過表達小鼠較正常鼠有較低的血磷水平，同時尿磷明顯增加，提示Klotho能通過減少腎臟對磷的重吸收而降低血磷[5]。

1.2 分泌型Klotho

1.2.1 抗衰老 抗衰老作用是Klotho首先被發(fā)現的作用。Klotho在體外和體內均能明顯抑制尿毒癥誘導的內皮細胞衰老進程，且其水平與內皮細胞衰老程度呈負相關，對NF-κB激活的抑制被認為在其中起重要作用[6]。Klotho能降低過氧化氫和依托泊苷誘導的人臍靜脈血管內皮細胞caspase3和caspase9的活性，減少衰老相關β-半乳糖苷酶表達，延緩衰老進程，p53/p21信號通路與細胞發(fā)育、細胞周期調控及細胞凋亡密切相關。Klotho能抑制p53/p21的表達,而其水平降低能增加p53/p21的表達，促進衰老進程[7]。重組Klotho能夠抑制人臍靜脈血管內皮細胞的凋亡和衰老[8]，這種保護作用可以被絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)抑制劑減弱，推測Klotho可能通過引起MAPKs的磷酸化發(fā)揮抗凋亡和抗衰老作用。

1.2.2 抗氧化 機體內缺血、缺氧時會產生過量的活性氧，超過抗氧化系統的清除能力時會在體內大量蓄積造成細胞損傷，促進衰老過程，在糖尿病、腎病等疾病的病理發(fā)展過程中起重要作用。Klotho具有顯著的抗氧化活性，能增加體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞cAMP產物，增強超氧化物歧化酶活性從而減輕氧化應激損傷。Klotho高表達的轉基因小鼠較野生型小鼠有更高的抗氧化應激能力，壽命明顯延長，可能與抑制p53、p21等與衰老和凋亡有關的基因、激活cAMP途徑[6]等有關。同時，氧化應激也對Klotho蛋白的產生具有抑制作用，在急性腎損傷(AKI)、糖尿病腎病等存在明顯氧化應激的疾病中均可觀察到Klotho及其產物的表達降低[9]，而減少氧自由基的產生可抑制Klotho的下降，可見氧化應激與Klotho間存在著相互制約、相互影響的復雜關系。

1.2.3 抗炎癥 Klotho還能抑制炎癥細胞、減輕炎癥反應。Klotho與內皮細胞共同培育能明顯減輕其由TNF-α誘導的黏附分子增加及NF-κB系統的活化。Liu等[10]發(fā)現，細胞內Klotho無論在體內還是體外均能抑制與衰老相關的炎癥因子IL-6和IL-8，其作用機制可能與維甲酸誘導基因-Ⅰ的相互作用有關。另一方面，炎癥反應也能抑制Klotho的產生，炎癥因子TNF-α能減少小鼠腎臟Klotho的產生，其作用機制與活化NF-κB信號通路有關，應用NF-κB抑制劑能增加Klotho的表達。Thurston等[11]在三種不同的小鼠炎癥性腸病模型中均檢測到Klotho基因轉錄及表達降低，且降低程度與腸炎的嚴重程度正相關，而應用抗TNF抗體可明顯緩解Klotho的缺乏狀態(tài)，提示炎癥對Klotho存在抑制作用。

1.2.4 調節(jié)離子通道 Klotho不但能通過影響鈉磷協同轉運蛋白調節(jié)血磷，還對其他多種離子通道具有調節(jié)作用，如能通過調節(jié)腎臟鈣離子通道瞬時感受器電位陽離子通道V5增加腎小管對鈣離子的重吸收，參與調節(jié)鈣平衡；通過對腎臟外髓質鉀通道1的干預參與鉀平衡等。Klotho在發(fā)揮調節(jié)離子通道作用時類似于酶，其胞外結構中有20%～40%的氨基酸序列與糖苷酶相同；在參與腎臟離子通道和轉運體的調控時具有β-糖苷酶和唾液酸酶的活性，因此被認為是一種新的鈣磷調節(jié)激素。

1.2.5 抗血管及軟組織鈣化 高磷血癥是血管及軟組織鈣化的重要促進因素，Klotho的降低血磷作用使其能有效減少血管及軟組織鈣化水平。慢性腎臟病動物模型中Klotho高表達小鼠的異位鈣化水平較野生型及Klotho基因缺陷小鼠明顯降低[12]。Klotho對甲狀旁腺激素(PTH)的抑制也是其減輕異位鈣化的重要機制，其除了能通過對血磷、活性維生素D及FGF-23的影響對PTH進行調節(jié)外，還能直接影響PTH的產生和分泌。Ben-Dov等在甲狀旁腺組織中發(fā)現了FGFR1、FGFR3，認為FGF-23在甲狀旁腺中與Klotho/FGFR結合后激活MAPK級聯信號通路直接調節(jié)PTH的分泌。正常表達的Klotho和FGF-23能增加甲狀旁腺的鈣敏感受體和維生素D受體的表達，且抑制甲狀旁腺細胞增生，從而減少PTH的分泌。

2 Klotho在AKI診治中的作用

2.1 Klotho在AKI中的水平變化 AKI是臨床常見綜合征，指腎功能在短期內下降，表現為血肌酐升高、尿量減少、水電解質紊亂等，常見于膿毒癥、大手術、心源性休克、藥物損傷等情況，在醫(yī)院內尤其是ICU發(fā)生率逐漸升高，影響患者預后，部分可引起慢性腎臟損害，甚至導致死亡[13，14]。多種原因導致的AKI模型包括缺血再灌注(IR)損傷、膿毒癥、輸尿管梗阻、低血容量及腎毒性藥物等均可檢測到腎臟Klotho產生減少，提示Klotho的表達降低在腎前性、腎實質性及腎后性AKI中普遍存在。一項大鼠腎臟IR損傷模型試驗檢測了腎臟灌注不同時間點的Klotho水平，發(fā)現在腎臟灌注的第1天Klotho明顯降低，在灌注的第3天和第4天腎臟Klotho的基因和蛋白表達水平恢復到基線水平。一項回顧性研究檢測了21例AKI患者的腎臟Klotho表達，發(fā)現其水平顯著下降,且與血肌酐基線水平和峰值均呈負相關[15]。葉酸誘導的腎毒性AKI小鼠模型中腎臟Klotho mRNA的表達降低維持到第7天尚未恢復，而此時血肌酐水平已經基本恢復到基線水平，表明Klotho轉錄表達水平的恢復比腎功能的恢復晚，但其是否能夠預測AKI進展至慢性腎臟病尚不明確。除了腎臟中Klotho的表達降低，血漿和尿液中也有相似的變化，多項嚙齒類動物試驗檢測到在缺血性AKI中，血漿和尿液可溶性Klotho在腎臟再灌注3 h開始下降，2 d后逐漸升高，7 d基本恢復到基線水平，這與腎臟中的表達改變基本一致。腎毒性藥物導致的AKI中也觀察到血漿Klotho水平的降低。腎移植患者中腎功能延遲恢復者的血漿Klotho水平較早期恢復者明顯降低，這種差別在移植術后2年仍可檢測到。

AKI中Klotho快速下降的機制尚不完全明確。IR損傷導致的AKI中腎臟Klotho蛋白水平的下降幅度明顯大于mRNA的下降，表明除轉錄水平降低外尚存在其他的原因導致Klotho水平降低。氧化應激和炎癥因子活化是AKI病理過程中的重要特點，二者均可在一定程度上抑制Klotho的產生[10]。

2.2 Klotho對AKI的診斷價值 AKI的早期診斷非常重要，目前較靈敏的指標包括尿液或(和)血漿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)和尿腎臟損傷分子-1，這些標志物在AKI中均表現為水平升高，其中NGAL在再灌注后5 h即可檢測到明顯升高，大大縮短了AKI的診斷時限。血漿和腎臟中Klotho水平在小鼠腎臟再灌注后3 h明顯下降，較NGAL的升高更加提前，表明其具有良好的早期診斷價值，與上述生物標記物聯合檢測能提高AKI診斷的靈敏性和特異性。研究發(fā)現AKI患者腎臟Klotho表達降低與腎損害嚴重程度相關，且能預測腎功能的短期恢復情況[15]。在AKI的鑒別診斷方面Klotho也有一定價值。有研究[16]比較了腎前性和腎實質性AKI的SD大鼠尿Klotho水平，發(fā)現腎前性AKI大鼠的尿Klotho水平較腎實質性AKI明顯下降，而血、尿NGAL水平差異無統計學意義。Liu等[17]研究發(fā)現，心臟瓣膜置換術后AKI患者較未發(fā)生AKI患者的即時血液Klotho水平明顯降低，而這種差別在術后24 h逐漸消失，表明血液Klotho水平可作為AKI超早期(1 d)的生物學標志物,而在術后較長時間(2～3 d)可檢測血肌酐與Klotho比值提高AKI診斷的敏感性。目前Klotho作為AKI診斷的標志物仍有許多不足，如大部分為動物試驗，以人類為對象的研究較少；尚沒有理想的檢測時機及正常范圍等。

2.3 Klotho在AKI中的治療作用 Klotho在AKI中表達降低，不僅是疾病的一種表現，也很可能參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。多項動物試驗表明，Klotho在AKI中起到保護作用。在缺血性腎損傷模型中，Klotho基因高表達的Tg-Kl小鼠較野生型小鼠腎損傷明顯減輕，而低表達小鼠損傷更重，在缺血性腎損傷早期給予外源性重組Klotho同樣能改善腎功能，降低NGAL水平。在大鼠的IR損傷模型中，應用腺病毒轉導Klotho基因表達增加也能使血清肌酐顯著降低，腎臟病理改變減輕及凋亡細胞減少。在抗腫瘤藥順鉑誘導的腎實質性腎損傷模型中，Klotho基因缺陷的雜合子小鼠腎損傷較Klotho高表達的Tg-Kl小鼠明顯加重，NGAL升高更顯著，凋亡細胞更多，表明Klotho對缺血性及藥物性AKI均有良好的腎保護作用。除預防性提高Klotho的水平可以顯著減輕腎損傷外，在腎臟IR損傷30～60 min給予重組Klotho仍能有效地保護腎臟。但是Klotho的這種腎保護作用仍具有很強的時效性，在腎損傷前或腎損傷超早期給予效果最好，對于可以預知的AKI如心臟手術、冠脈造影、腎毒性藥物的使用等情況可能會有較大的應用價值。

AKI不但能在短期內損傷腎功能，增加病死率，還可能引起慢性腎功能損害，導致腎纖維化。Klotho在改善AKI的早期預后、降低患病率和病死率的同時還對其晚期預后有明顯的改善作用，在單側輸尿管梗阻誘導的腎損傷小鼠模型中，腎臟及血漿Klotho水平均明顯降低的雜合子小鼠腎臟纖維化明顯較野生型小鼠加重，表明Klotho能夠抑制AKI后的腎臟纖維化，改善遠期預后。Klotho保護急性腎臟損傷的機制可能與其抗氧化、抗凋亡、抗炎癥[9]、抗衰老[7，8]和促進血管生成等作用有關。

綜上所述，Klotho具有抗衰老、抗凋亡、抗氧化應激、保護血管等廣泛生物學作用，與AKI關系密切，不但是其早期生物學標志物，且可能參與病理過程，并可作為治療靶點發(fā)揮作用。

參考文獻：

[1] Kuro-o M, Matsumura Y, Aizawa H, et al. Mutation of the mouse Klotho gene leads to a syndrome resembling ageing[J]. Nature, 1997,390(6655):45-51.

[2] Manolis AS. Klotho, Spinning the thread of life: an anti-ageing gene[J]. Hospital chronicles, 2012,7(3):129-132.

[3] Scholze A, Liu Y, Pedersen L, et al. Soluble α-Klotho and its relation to kidney function and fibroblast growth factor-23[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2014,99(5):E855-E861.

[4] Ranch D, Zhang MY, Portale AA, et al. Fibroblast growth factor 23 regulates renal 1,25-dihydroxyvitamin D and phosphate metabolism via the MAP kinase signaling pathway in Hyp mice[J]. J Bone Miner Res, 2011,26(8):1883-1890.

[5] Hu MC, Shi M, Zhang J, et al. Klotho: a novel phosphaturic substance acting as an autocrine enzyme in the renal proximal tubule[J]. FASEB J, 2010, 24(9):3438-3450.

[6] Buendía P, Carracedo J, Soriano S, et al. Klotho prevents NFκB translocation and protects endothelial cell from senescence induced by uremia[J]. J Gerontol, 2014,70 (10) :1198-1209.

[7] Niwa T, Shimizu H. Indoxyl sulfate induces nephrovascular senescence[J]. J Ren Nutr, 2012, 22 (1) :102-106.

[8] Maekawa Y, Ohishi M, Ikushima M, et al. Klotho protein diminishes endothelial apoptosis and senescence via a mitogen-activated kinase pathway[J]. Geriatr Gerontol Int, 2011,11:510-516.

[9] Lee EY, Kim SS, Lee JS, et al. Soluble α-Klotho as a novel biomarker in the early stage of nephropathy in patients with type 2 diabetes[J]. PLoS One, 2014,9(8):e102984.

[10] Liu F, Wu S, Ren H, et al. Klotho supresses RIG-I-mediated senescence-associated inflammation[J]. Nat Cell Biol, 2011,13(3):254-262.

[11] Thurston RD, Larmonier CB, Majewski PM, et al. Tumor necrosis factor and interferon-gamma down-regulate Klotho in mice with colitis[J]. Gastroenterology, 2010,138:1384-1394.

[12] Hu MC, Shi M, Zhang J, et al. Klotho deficiency causes vascular calcification in chronic kidney disease[J]. J Am Soc Nephrol, 2011,22(1):124-136.

[13] Rewa O, Bagshaw SM. Acute kidney injury-epidemiology, outcomes and economics[J]. Nat Rev Nephrol, 2014,10(4):193-207.

[14] Di Somma A, Andaluz N, Cavallo LM， et al. Salvatore. Endoscopic transorbital route to the petrous apex: a feasibility anatomic study[J]. Acta Neurochir (Wien), 2018,160(4):707-720.

[15] Seo MY, Yang J, Lee JY, et al. Renal Klotho expression in patients with acute kidney injury is associated with the severity of the injury[J]. Korean J Intern Med, 2015,30(4):489-495.

[16] Kim AJ, Ro H, Kim H, et al. Klotho and S100A8/A9 as discriminative markers between pre-renal and intrinsic acute kidney injury[J]. PLoS One, 2016,11(1):e0147255.

[17] Liu YJ, Sun HD, Chen J, et al. Klotho: a novel and early biomarker of acute kidney injury after cardiac valve replacement surgery in adults[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(5):7351-7358.