章凱，王建洪，羅小鄒

(宜賓市第一人民醫(yī)院，四川宜賓644000)

鼻咽癌是發(fā)生在鼻咽腔頂部以及側(cè)壁的惡性腫瘤，在我國(guó)廣東、廣西、福建和湖南等省份發(fā)病率較高。鼻咽癌的發(fā)病年齡大多為40～60歲，男性多于女性。目前認(rèn)為，鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展是多重基因事件參與的復(fù)雜過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制與EB病毒感染、環(huán)境、飲食和遺傳因素、多種癌基因與抑癌基因的相互作用密切相關(guān)[1]。鼻咽癌的治療以放療為主，但由于鼻咽癌易局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療效果不佳。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)部分生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)惡性腫瘤診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要作用。因此，在分子層面探尋鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和治療策略制訂具有重要意義[2]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼單鏈小分子RNA，通過(guò)多種信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、黏附和血管生成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促癌或抑癌作用[3]。Chen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155、miR-138、miR-25等11種miRNA在鼻咽癌組織中表達(dá)升高，miR-200a、miR-143、miR-204等24種miRNA表達(dá)降低。近年研究顯示，miR-1亦參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，可作為抑癌基因發(fā)揮作用[5,6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在鼻咽癌患者血清中表達(dá)降低，但其作用機(jī)制尚不明確。2015年5～12月，本研究觀察了miR-1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，并分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌CNE2細(xì)胞系來(lái)自宜賓市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，TRIzol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)于杭州艾森生物有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本TOYOBO公司，恒溫水浴箱購(gòu)自巴基斯坦Precitherm PFV公司，PCR儀購(gòu)于美國(guó)Gene Technologies公司，電泳儀購(gòu)于北京市六一儀器廠，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BioSpectrum AC公司，RNA/DNA檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Gene Quant公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組轉(zhuǎn)染 將CNE2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合70%～80%時(shí)，消化傳代。隨機(jī)將細(xì)胞分為對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組，按照轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明，分別轉(zhuǎn)染negative control miRNA mimics、miR-1 mimics。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。轉(zhuǎn)染24 h收集細(xì)胞，接種于96孔板，每孔加CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀于480 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度(OD)值。以O(shè)D480值代表細(xì)胞增殖能力。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，生理鹽水沖洗2遍，70%乙醇固定1 h。4 ℃碘化丙啶避光染色30 min，銅網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各周期細(xì)胞比例。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、吹打，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液接種于12孔板，恒溫培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，棄培養(yǎng)液，于每孔中央劃出劃痕，洗去死亡細(xì)胞，顯微鏡下拍照。利用軟件測(cè)量24 h細(xì)胞遷移距離。

1.6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染12 h收集細(xì)胞，用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于Transwell小室內(nèi)，外槽加入含5%血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h，蘸去上層細(xì)胞，DAPI染核。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.7 c-met mRNA表達(dá)檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，加入TRIzol 1 mL，充分混勻后移至EP管中。加入氯仿200 μL，劇烈振蕩15 s。室溫靜置5 min，充分裂解沉淀，于4 ℃下12 000 r/min離心15 min，加入異丙醇500 μL，反復(fù)混勻，- 20 ℃靜置30 min。于4 ℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入75%乙醇，振蕩搖勻，于4 ℃下7 500 r/min離心5 min，棄上清。加入無(wú)水乙醇1 mL，小心棄上清，超凈工作臺(tái)干燥10 min。將沉淀溶于30 μL DEPC水中，抽吸數(shù)次。加樣混勻3～5 s，RNA熱變性(65 ℃孵育5 min，冰上1 min)，加樣混勻(20 μL)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃ 20 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。瞬間離心后將cDNA置于于- 20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。c-Met上游引物5′-TCTTGGGACATCAGAGGGTC-3′，下游引物5′-TGACTGCAGGACTGGAAATG-3′;β-actin上游引物5′-CCGAATTCATCATGTTTGAGACCT-TCAA-3′,下游引物5′-CCGGATCCATCTTGCTCGAA-GTCCA-3′。加樣(cDNA 2 μL，蒸餾水7 μL，Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL)混勻，進(jìn)入PCR擴(kuò)增程序(95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min)，共35個(gè)循環(huán)，瞬間離心后得到PCR產(chǎn)物，制膠電泳得到目的條帶后再進(jìn)行分析。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 c-met蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，采用含50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS和蛋白酶抑制劑及1 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白，所有操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以β-actin為內(nèi)參照，通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)條帶目標(biāo)區(qū)域中經(jīng)背景修正之后所有像素積分密度值的總和，計(jì)算目標(biāo)條帶吸光度值與內(nèi)參照條帶吸光度值的比值作為c-met蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 miR-1靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建c-met野生型3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-WT，并以pMIR-WT質(zhì)粒為模板，利用PCR搭橋法構(gòu)建其潛在結(jié)合位點(diǎn)突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-Mut。將miR-1 mimics、negative control miRNA mimics內(nèi)參海腎熒光素酶以及pMIR-WT和pMIR-Mut報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，用passive lysis buffer裂解細(xì)胞并分析雙熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖能力比較 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能為為0.65±0.11，對(duì)照組為1.00±0.05，兩組比較P<0.01。

2.2 兩組細(xì)胞周期變化 轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞比例為(55.2±4.1)%，G2期細(xì)胞比例為(19.5±2.3)%，S期細(xì)胞比例為(22.6±2.8)%；對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例為(43.1±5.0)%，G2期細(xì)胞比例為(23.5±3.0)%，S期細(xì)胞比例為(33.4±4.2)%。與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞比例升高(P<0.05)，S期細(xì)胞比例降低(P<0.05)，G2期細(xì)胞比例變化不明顯(P>0.05)。

2.3 兩組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 轉(zhuǎn)染組、對(duì)照組細(xì)胞遷移距離分別為(175.5±22.4)、(225.4±26.3)mm，侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(36.2±4.1)、(58.5±6.7)個(gè)/視野。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移距離短于對(duì)照組，侵襲細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.4 兩組c-met表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染組、對(duì)照組c-met mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.44±0.06和1.00±0.01，c-met蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.17±0.06、0.65±0.11。與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組c-met mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)。

2.5 miR-1的靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 用miRNA靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)targetscan對(duì)miR-1的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示c-met可作為其潛在靶基因。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-1 mimics可明顯抑制pMIR-WT質(zhì)粒熒光素酶活性，而對(duì)pMIR-Mut質(zhì)粒熒光素酶活性無(wú)明顯影響。

3 討論

鼻咽癌是一種鼻咽部惡性腫瘤，近年來(lái)隨著診療技術(shù)的進(jìn)步，以放療為主的綜合治療明顯改善了鼻咽癌的局部控制率，但由于其發(fā)病部位隱蔽，易發(fā)生早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響其治療效果[7]。因此，深入探究鼻咽癌病理過(guò)程的分子機(jī)制，尋找新的診斷及治療生物標(biāo)記物，對(duì)于改善預(yù)后具有重要意義。miRNA是一類長(zhǎng)18～24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，通過(guò)與靶基因的3′-UTR不完全互補(bǔ)配對(duì),在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)，可參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、發(fā)育、分化及凋亡等生命活動(dòng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。特異性miRNA的表達(dá)異常能影響腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細(xì)胞或組織中存在很多差異表達(dá)的miRNA。有研究顯示，miR-144通過(guò)抑制PTEN促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生及發(fā)展。miR-200可抑制ZEB2和CTNNB1的表達(dá)，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲[8,9]。研究表明，miR-1在肺癌、肝癌、前列腺癌等組織中均表達(dá)較低，扮演抑癌基因的角色[10]。miR-1可通過(guò)抑制LIM和SH3蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)抑制前列腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。Yu等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-1可抑制非小細(xì)胞肺癌A594細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Xu等[12]研究顯示，miR-1可對(duì)LIM蛋白和LASP-1靶向調(diào)控，miR-1過(guò)表達(dá)在結(jié)直腸癌中可抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但miR-1對(duì)鼻咽癌生物學(xué)行為的影響鮮有報(bào)道。

前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在鼻咽癌患者血清中的表達(dá)低于健康人群，提示miR-1低表達(dá)可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究將miR-1 mimics轉(zhuǎn)染入CNE2細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)miR-1過(guò)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNE2細(xì)胞增殖能力被抑制。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-1過(guò)表達(dá)可將CNE2細(xì)胞阻滯于G0/G1期并抑制S期細(xì)胞聚集。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，miR-1能夠抑制CNE2細(xì)胞的遷移和侵襲。以上結(jié)果表明，miR-1在鼻咽癌的病理過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因作用。

c-Met是HGF的特異性膜表面受體，定位于人7號(hào)染色體長(zhǎng)臂，屬于酪氨酸激酶受體類。c-Met在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，但在胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等組織中異常表達(dá)[13]。Herynk等[14]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中HGF與c-Met mRNA 及蛋白表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。Rolle等[15]發(fā)現(xiàn)，c-Met、p-Met及HGF在小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌組織中均高表達(dá)。c-Met高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)浸潤(rùn)，并誘導(dǎo)腫瘤新血管的生成。大量研究顯示，抑制c-Met表達(dá)能夠抑制腫瘤形成和生長(zhǎng)。HGF與c-Met結(jié)合構(gòu)成HGF/c-Met信號(hào)通路，在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤新生血管形成過(guò)程中具有重要作用。HGF與c-Met的胞外區(qū)特異性結(jié)合后，c-Met胞內(nèi)的酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化并激活蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸激酶活性，從而引發(fā)c-Met羧基末端的自身磷酸化。激活的c-Met可使調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附與運(yùn)動(dòng)等不同生物學(xué)效應(yīng)的底物蛋白快速磷酸化，繼而激活多種信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移及凋亡。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌腫瘤組織c-Met表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系，提示其可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。有研究還發(fā)現(xiàn)，c-Met在鼻咽癌組織及癌旁正常黏膜組織高表達(dá)，而在健康人體鼻咽黏膜組織中低表達(dá)，提示c-Met高表達(dá)對(duì)鼻咽癌的診斷及預(yù)后具有重要意義[17～19]。為進(jìn)一步研究miR-1在鼻咽癌中的抑癌作用機(jī)制，本研究通過(guò)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示c-Met是miR-1的潛在靶基因，雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了miR-1能夠與c-Met的3′-UTR特異性結(jié)合，抑制c-Met mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果表明miR-1可能通過(guò)抑制原癌基因c-Met表達(dá)，從而在鼻咽癌中發(fā)揮抑制作用[20，21]。

綜上所述，miR-1通過(guò)結(jié)合其靶基因c-Met的3′-UTR，從而抑制c-Met mRNA和蛋白表達(dá)，阻滯鼻咽癌細(xì)胞于G0/G1期并抑制其S期聚集，繼而抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，發(fā)揮抑癌基因作用。由此推測(cè)，miR-1有可能成為鼻咽癌診治及預(yù)后預(yù)測(cè)的新靶點(diǎn)。