董小林，戰(zhàn)麗萍，鄔剛，李青蕓，魏歡，李建輝，李妍平

本研究背景和創(chuàng)新點：

帕金森病是一種常見的神經退行性疾病，病因是中腦黑質多巴胺能神經元凋亡缺失，多巴胺合成減少是導致其震顫和運動障礙的主要原因，酪氨酸羥化酶（TH）是多巴胺能神經元的主要分子標記和功能分子。機體利用左旋酪氨酸（L-tyrosine），在TH的催化下生成左旋多巴，左旋多巴在芳香族脫羧酶的催化下脫去羧基最后生成左旋多巴胺。本研究分離、培養(yǎng)胎鼠原代神經元，采過反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）從多巴胺能神經元中克隆大鼠TH（rTH） cDNA，將該片段包裝到重組慢病毒中。將Lv-rTH重組慢病毒感染大鼠成纖維細胞REF，體外檢測表明Lv-rTH重組慢病毒能在體外成功和高效地表達rTH。通過腦內立體定位注射6羥多巴胺（6-OHDA）的方法建立了大鼠帕金森病模型，建模后進行基因治療，給予Lv-rTH重組慢病毒腦內注射，通過阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉實驗進行行為學評分，免疫組化進行神經元恢復評分，結果發(fā)現(xiàn)：Lv-rTH重組慢病毒能顯著減少由阿撲嗎啡誘導的自體旋轉且能上調大鼠帕金森病模型TH表達陽性細胞所占比例。

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種常見的神經系統(tǒng)變性病，患者的主要臨床表現(xiàn)為：運動遲緩、肌強直、靜止性震顫、姿勢步態(tài)異常等［1-2］。已有研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素和多種殺蟲劑是PD的重要危險因素［3］。PD的病理特征主要是中腦黑質多巴胺能神經元減少和壞死。多巴胺能神經元主要是一類能產生多巴胺的神經元，能將神經沖動信號傳遞至紋狀體，而紋狀體主要控制骨骼肌的運動，因此多巴胺合成的減少導致了機體的運動障礙?；谠摬±砘A，PD患者的治療主要通過維持紋狀體內多巴胺和乙酰膽堿兩種遞質的平衡，使臨床癥狀得以改善。左旋多巴最早用于治療PD，該藥物在治療早期病情緩解效果較好，但是隨著治療“蜜月期”的結束，左旋多巴會導致多種運動并發(fā)癥［4］。而多巴胺激動劑類藥物雖能一定程度緩解癥狀，但長期使用會導致消化道反應和精神癥狀等不良反應［5］。手術治療雖能改善癥狀，但不能根治疾病，術后仍需應用藥物治療，也可能帶來相關并發(fā)癥，如舌頭和手的麻痹、辨距不清和意識不清等癥狀［6］，也存在一定局限性。

基因治療主要是將相關基因通過載體導入病灶部位，對靶點區(qū)域的細胞進行修復、補償和校正，以恢復相關區(qū)域正常生理功能，基因治療主要適用于病灶區(qū)域單一和明確的疾病。國外有研究報道利用神經營養(yǎng)因子對PD進行基因治療，主要是通過導入神經營養(yǎng)因子〔包括膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF）、Neurturin和腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）〕促進和保護相關神經元的存活［7］。但是，多數(shù)PD患者發(fā)病時大量的多巴胺神經元丟失，因此，提升患者相關神經核團對多巴胺的合成可能是治療該疾病的關鍵。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）表達于多巴胺能神經元，是該類神經元分子標志物。TH是催化左旋多巴產生的加氧酶，是多巴胺合成中的關鍵限速酶［8］。慢病毒載體是一種廣泛應用于基因表達和基因治療的缺陷型載體，相比于其他載體，慢病毒載體具有能在機體內持續(xù)穩(wěn)定表達、較低的免疫性和外源基因容量大的特點，已廣泛應用于心血管疾病、腫瘤和自身免疫疾病的治療［9］。為了探索和評估利用TH作為PD基因治療的評價效果，本研究克隆了大鼠TH基因（rTH基因），構建了攜帶rTH的慢病毒載體，并利用該載體對大鼠PD模型進行基因治療，為PD基因治療提供新思路，為臨床研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 慢病毒載體LvX、pHelper和大腸埃希菌DH5α由本研究室保存，大鼠成纖維細胞REF和293T細胞由本研究室保存。限制性內切酶NotI、BamHI、PrimeStar HS DNA Polymerase 和 T4 DNA Ligase購自寶生物工程（大連）有限公司，質粒大提試劑盒購自Qiagen公司。上游引物P1：5'-GCGGCCGC ACCATGCCCACCCCCAGCGCC-3'和 下 游 引 物 P2：5'-GGGGATCCTTAGCTAATGGCACTCAG-3'由北京六合華大基因科技有限公司合成。Anti-TH antibody（AF7566）和BDNF購自R&D Systems。Western Chemiluminescent HRP底物和HRP標記二抗購自Merck Millipore公司。Opti-MEM、Lipofectamine 2000、DMEM 高 糖、Neural Basal培 養(yǎng) 基、B27 Serum Free Supplement和 胎 牛 血清（FBS）等購自ThermoFisher公司。成年Sprague-Dawley大鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司。6羥多巴胺（6-OHDA）和阿撲嗎啡（apomorphine）購自Sigma Aldrich。

1.2 方法

1.2.1 胎鼠原代神經元的分離、培養(yǎng)和鑒定 2014年11月—2015年12月，取雌性和雄性Sprague-Dawley大鼠各10只，按照2∶1進行合籠過夜飼養(yǎng)。第2天分籠飼養(yǎng)，記錄時間，動態(tài)檢測雌性大鼠體質量以確定雌性大鼠妊娠天數(shù)。準確選取妊娠14 d雌性大鼠1只，處死后取出子宮。在預冷的Hank's平衡鹽溶液（HBSS）無菌培養(yǎng)皿中分離胎鼠大腦，從中腦腹側處取神經組織，剪碎。將神經組織平鋪于多聚賴氨酸包被的6孔板中，37 ℃，5% CO2孵育30 min。加入B27培養(yǎng)液〔Neural Basal，2% B27 Serum Free Supplement，1% 雙 抗，5%FBS和10 ng/ml BDNF〕，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，每3 d半量換液，于14 d得到大鼠原代神經元，對神經元進行鑒定。采用免疫組化法將大鼠原代神經元用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，加入固定和透化液（2%多聚甲醛，0.2% Triton X-100，PBS pH=7.4）處理15 min；加入丙酮和甲醇混合物（7∶3），-20 ℃處理10 min。細胞固定和破膜后，用PBS洗滌3次。加入封閉液〔5%牛血清清蛋白（BSA）/0.05% Tween-20，PBS pH=7.4〕封閉30 min。封閉結束后加入封閉液稀釋的一抗，工作濃度為1 μg/ml，結合2 h，PBST洗滌3次，加入二抗（1∶1 000）孵育60 min，PBST洗滌3次后加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。

1.2.2 rTH基因的克隆 取1×106個胎鼠原代神經元，利用Qiagen RNeasy Mini Kit提取細胞總RNA。檢測RNA純度和濃度后進行cDNA的反轉錄。取500 ng細胞總RNA，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。取模板cDNA，以rTH擴增上下游引物，利用PrimeStar HS DNA Polymerase擴增rTH基因。反應體系為：5×PrimeSTAR Buffer 10 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μl，上、下游引物各10 pmol，cDNA 1 μl，Polymerase 0.5 μl，總體積 50 μl。反應條件：98 ℃預變性 2 min；98 ℃變性 10 s，55 ℃復性 15 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min，16℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 Lv-rTH重組慢病毒的包裝 將rTH PCR產物進行膠回收純化，純化產物和LvX載體進行NotI和BamHI雙酶切。酶切產物經過膠回收純化后用T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜。連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞。Lv-rTH重組質粒通過酶切進行鑒定。對Lv-rTH和pHelper質粒進行大量擴增。使用Qiagen去內毒素質粒大提試劑盒提取質粒，測濃度后備用。復蘇293T細胞，取對數(shù)生長期293T細胞，調整細胞密度至0.5×106cells/ml，接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)12 h。次日細胞密度達到70%融合度進行轉染。使用Opti-MEM培養(yǎng)液對293T細胞洗滌3次。取15 ml離心管，加入40 μg Lv-rTH和30 μg pHelper載體混合。加入Opti-MEM培養(yǎng)液至2.5 ml，孵育5 min。取200 μl Lipofectamine 2000，加入2.3 ml Opti-MEM培養(yǎng)液進行稀釋。將載體混合液與脂質體稀釋液進行混合，室溫孵育20 min。將DNA與Lipofectamine 2000混合液均勻滴加至293T細胞的培養(yǎng)液中，十字混勻后放置37 ℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜后換新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。收集上清液，4 ℃，4 000×g離心10 min。上清液使用0.45 μm濾器過濾，過濾上清液進行濃縮和純化，最后測定滴度進行保存。

1.2.4 實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（RTPCR）、免疫熒光實驗和Western blotting法檢測大鼠成纖維細胞REF中rTH基因表達 取對數(shù)生長期大鼠成纖維細胞REF，以5×106/ml密度接種至6孔板，37 ℃5% CO2過夜培養(yǎng)。次日，以MOI=100的感染復數(shù)接種Lv-rTH重組慢病毒，以未攜帶基因的慢病毒Lv-NC為對照。加入終濃度5 μg/ml Polybrene增強感染，感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進行實時熒光定量RT-PCR、免疫熒光實驗和Western blotting檢測。RT-PCR反應體系及反應條件參見1.2.2。免疫熒光實驗二抗采用異硫氰酸熒光素（FITC）標記，采用封閉液稀釋（1∶250），37 ℃孵育60 min。PBST洗滌4次后熒光顯微鏡下觀察。Western blotting法檢測選取大鼠原代神經元、接種Lv-rTH重組慢病毒、Lv-NC大鼠成纖維細胞REF，每種細胞取5×106個，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解。利用BCA法測定細胞裂解物蛋白濃度，調整蛋白濃度一致。10%十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白電轉至甲醇激活的聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。轉膜后將膜用PBS洗滌3次，5%脫脂奶4 ℃封閉過夜。加入anti-TH一抗，同時以anti β-actin抗體為內參對照，濃度分別為0.5 μg/ml和0.1 μg/ml，PBST洗滌3次后加入二抗進行孵育（1∶5 000）。PBST洗滌4次后加入Chemiluminescent HRP底物，暗室曝光顯影。

1.2.5 PD建模和基因治療 PD建模和基因治療分為對照組、Lv-NC治療組和Lv-rTH治療組，每組入選7只成年雌性Sprague-Dawley大鼠。采用腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg進行麻醉，麻醉后，將大鼠固定于立體定位注射儀，雙耳固定耳桿并調節(jié)至相同刻度，固定鼻托。頭部備皮，消毒后切開暴露顱骨。Lv-NC治療組和Lv-rTH治療組大鼠右側紋狀體注射6-OHDA 20 μg，損毀多巴胺能神經元，完成PD建模，注射坐標：前囟=-1.0 mm，右側水平偏移=3.5 mm，深度=5.5 mm，緩慢注射、緩慢退針，注射后縫合大鼠頭皮；對照組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液。造模14 d后評估和再次注射病毒進行基因治療。每只大鼠注射損毀側紋狀體和黑質2個點。紋狀體注射坐標：前囟=0.8 mm，右側水平偏移=3.5 mm，深度=5.5 mm；黑質核團注射坐標：前囟=5.5 mm，右側水平偏移=2.4 mm，深度=7.5 mm（見圖1）。每只大鼠每個點注射病毒1×109TU/ml，共注射 5 μl。

1.2.6 阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉實驗和免疫組化實驗 LvrTH重組慢病毒對大鼠基因治療的療效主要通過行為學和組織學進行評估。注射Lv-rTH重組慢病毒前1周開始對大鼠進行PD癥狀的行為學評估，主要通過肌肉注射阿撲嗎啡2.5 mg/kg進行。肌肉注射后觀察每只大鼠60 min內自發(fā)旋轉圈數(shù)，計算每分鐘自發(fā)旋轉圈數(shù)進行評估。行為學觀察進行11周后處死大鼠。取出腦組織，采用10%甲醛溶液固定，固定后進行脫水、透明和石蠟包埋，切片后進行免疫組化，脫蠟、脫二甲苯，Tris-EDTA緩沖液抗原煮沸修復，修復后采用3%過氧化氫處理、封閉和一抗孵育。孵育結束后洗片4～5次，加入酶標二抗進行孵育，最后洗滌5～6次后加入DAB顯色。采用Image J圖形分析軟件計算大鼠中腦黑質TH陽性神經元所占比例。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據處理，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胎鼠原代神經元的培養(yǎng)和鑒定 選取胎鼠中腦原代神經元（見圖2、3），免疫組化法檢測顯示，所獲得神經元能表達TH（見圖4）。

2.2 rTH基因的克隆和Lv-rTH重組慢病毒的包裝RT-PCR檢測顯示得到分子量約為1 500 bp的特異擴增基因片段（見圖5）?；驕y序結果與GeneBank中NM_012740.3所公布序列完全一致（見圖6）。

2.3 Lv-rTH重組慢病毒體外表達檢測 RT-PCR檢測顯示rTH基因在大鼠成纖維細胞REF的轉錄（見圖7）。免疫熒光檢測顯示接種Lv-rTH重組慢病毒的大鼠成纖維細胞REF中有rTH基因表達，未攜帶基因的慢病毒Lv-NC的大鼠成纖維細胞REF中無熒光信號（見圖8）。Western blotting法檢測顯示接種Lv-rTH重組慢病毒的大鼠成纖維細胞REF中表達分子量約為60 kD的蛋白（見圖9）。

2.4 3組大鼠不同時間自發(fā)旋轉速率比較 3組大鼠治療前1周自發(fā)旋轉速率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3 組大鼠治療 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周自發(fā)旋轉速率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中治療 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周，Lv-NC治療組和Lv-rTH治療組大鼠自發(fā)旋轉速率較對照組增快，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療2、3、5、6、8、9、10周，Lv-rTH治療組大鼠自發(fā)旋轉速率較Lv-NC治療組減慢，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

圖1 大鼠紋狀體和黑質腦內立體定位注射坐標Figure 1 Stereotactic coordinates of rat striatum and substantial nigra

圖2 分離胎鼠中腦原代神經元Figure 2 Isolation of primary fetal rat neurons

圖3 胎鼠中腦原代神經元細胞形態(tài)（×200）Figure 3 Morphology of primary rat neurons

圖4 免疫組化法檢測胎鼠中腦原代神經元TH表達（×400）Figure 4 Detection of TH expression in primary rat neurons by immunohistochemistry

圖5 RT-PCR檢測rTH基因Figure 5 Detection of rTH gene by RT-PCR

圖6 Lv-rTH重組慢病毒包裝圖Figure 6 Lv-rTH recombinant lentivirus vector packaging

圖7 RT-PCR檢測rTH基因在大鼠成纖維細胞REF中的表達Figure 7 Expression of rTH gene in rat fibroblasts REF detected by RT-PCR

2.5 3組大鼠中腦黑質TH陽性神經元所占比例 免疫組化實驗顯示與Lv-NC治療組大鼠中腦黑質相比，LvrTH治療組大鼠經過治療后向正常大鼠中腦恢復（見圖10）。3組大鼠中腦黑質TH陽性神經元所占比例比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中Lv-NC治療組和Lv-rTH治療組大鼠中腦黑質TH陽性神經元所占比例較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Lv-rTH治療組大鼠中腦黑質TH陽性神經元所占比例較Lv-NC治療組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

圖8 免疫組化檢測rTH基因在大鼠成纖維細胞REF中的表達（×200）Figure 8 Expression of rTH gene in REF detected by immunohistochemistry

圖9 Western blotting檢測rTH基因在大鼠成纖維細胞REF中的表達Figure 9 Expression of rTH gene in REF detected by Western blotting

表2 3組大鼠中腦黑質TH陽性神經元所占比例比較（x±s，%）Table 2 Comparitson of the proportions of TH-positive neurons in the substantial nigra between the three groups

表1 3組大鼠不同時間自發(fā)旋轉速率比較（x±s，r/min）Table 1 Comparison of the spontaneous rotation rates of the rats in three groups at different time points

圖10 免疫組化檢測大鼠中腦黑質TH陽性神經元（×200）Figure 10 TH-positive neurons in the substantial nigra detected by immunohistochemistry

3 討論

本研究體外分離、培養(yǎng)了胎鼠中腦多巴胺能神經元，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)TH呈陽性表達，證明實驗所分離和培養(yǎng)的神經元為多巴胺能神經元，通過RT-PCR從多巴胺能神經元中成功克隆了約為1 500 bp的cDNA片段，經測序確認，該片段與理論片段序列完全一致，證明所獲得的基因為rTH。將該rTH cDNA片段包裝到慢病毒中，并感染大鼠成纖維細胞REF，體外通過實時熒光定量RT-PCR、免疫熒光實驗和Western blotting法證明所包裝的rTH重組慢病毒能在體外成功和高效地表達rTH。通過腦內立體定位注射6-OHDA的方法建立了大鼠PD模型，建模2周后，給予大鼠腦內注射Lv-rTH重組慢病毒、未攜帶基因的慢病毒Lv-NC及0.9%氯化鈉溶液。通過阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉實驗進行行為學評分，免疫組化進行神經元恢復評分，結果發(fā)現(xiàn)：Lv-rTH重組慢病毒能顯著減少由阿撲嗎啡誘導的自發(fā)旋轉速率，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，Lv-rTH能上調大鼠PD模型中腦黑質TH表達陽性神經元所占比例。

目前國內對PD的基因治療主要使用神經營養(yǎng)因子（GDNF、Neurturin和BDNF）。研究報道通過基因載體或者重組蛋白遞送至模型后相關核團能保護多巴胺能神經元，抵抗造模藥物6-OHDA和MTPT的神經損傷作用［9-11］。美國Ceregen公司研發(fā)了攜帶Neurturin基因的重組腺相關病毒，并對其臨床療效進行了測試，表明患者在接受基因治療后，PD癥狀確實有明顯改善，但是正電子發(fā)射計算機斷層顯像（PET-CT）掃描表明患者的紋狀體核團對左旋多巴的利用沒有明顯上升［10，12］。

通過慢病毒作為載體遞送TH對PD進行基因治療的機制是：TH是催化多巴胺合成的關鍵酶［13］。TH是一種單加氧酶，其是催化生物體自身合成左旋多巴胺系列反應的第一步反應的限速酶，機體利用左旋酪氨酸（L-tyrosine），在TH的催化下生成左旋多巴，左旋多巴在芳香族脫羧酶的催化下脫去羧基最后生成左旋多巴胺。本研究在動物模型上證實了通過重組慢病毒在與多巴胺合成相關的神經核團中過表達rTH基因，促進核團多巴胺的合成，能改善動物模型的PD癥狀，降低了阿撲嗎啡誘導的自發(fā)旋轉。同時，免疫組化證實多巴胺合成相關核團TH的表達增強。

流行病學調查報道：全球PD在65～69歲中患病率為0.6%，80歲及以上患病率為4%；中國65歲及以上PD的患病率為2.06%，男性高于女性［14］。據估算我國大約有200萬PD患者，每年新發(fā)病例約10萬人。我國已進入人口老齡化社會，PD已成為僅次于糖尿病和心血管疾病的影響我國人口健康的重大疾病?？诜笮喟褪窃缙谥委烶D的理想藥物，能顯著緩解PD癥狀，但是長期使用左旋多巴可能帶來癥狀波動和異動癥，這種癥狀波動和異動癥有可能對患者造成更為嚴重的損傷。外科手術治療法主要分為神經核團損毀術、腦深部電刺激術和神經組織移植術3種，丘腦損毀術會導致舌與手的麻木、辨距不良和意識混亂，蒼白球損毀術術后會導致視野缺損和偏癱［15-16］。腦深部電刺激有導致顱內出血的風險，與刺激有關的不良反應有對側肢體抽搐、麻木、眼球凝視等癥狀［17］。神經組織移植治療由于使用人類胚胎組織，存在倫理學方面的問題。

慢病毒載體已經發(fā)展到產業(yè)化階段，國內已有專業(yè)開展慢病毒制備的公司和成熟的病毒制備、濃縮和純化工藝，制備成本較低；慢病毒已被廣泛應用于抗腫瘤CAR-T細胞的制備等，具有一定的安全性［18］。因此使用慢病毒作為基因治療載體具有較好的產業(yè)化基礎。其次，慢病毒系統(tǒng)較好地滿足了人類疾病基因治療的要求：能感染大部分哺乳動物細胞；可插入較大的外源基因；能夠整合，且持續(xù)和穩(wěn)定的表達。其他病毒載體主要包括：腺病毒系統(tǒng)和腺相關病毒系統(tǒng)。腺病毒系統(tǒng)由于屬于瞬時表達載體，且免疫原性加大，通常不適宜用于基因治療。腺相關病毒具有較低的免疫原性，且能持續(xù)表達，但是由于其基因組限制，只能容納3 kb的外源基因片段。

綜上所述，本研究通過重組慢病毒載體在目標核團過表達rTH基因，該方案能快速增強多巴胺的合成，緩解模型動物PD癥狀，同時上調大腦黑質TH表達陽性神經元所占比例。盡管如此，該方法不能再生多巴胺能神經元。因此，利用胚胎干細胞或間充質干細胞多向分化潛能，同時通過慢病毒載體遞送相關誘導基因的表達，促進目標核團的神經元再生可能是今后PD基因治療努力的方向。

作者貢獻：戰(zhàn)麗萍進行文章的構思與設計，論文的修訂；董小林進行研究的實施與可行性分析，撰寫論文；鄔剛進行數(shù)據收集；魏歡進行數(shù)據整理；李青蕓進行統(tǒng)計學處理；李建輝進行結果的分析與解釋；李妍平負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

［1］BAIZABAL-CARVALLO J F，JANKOVIC J.Parkinsonism，movement disorders and genetics in frontotemporal dementia［J］.Nat Rev Neurol，2016，12（3）：175-185.DOI：10.1038/nrneurol.2016.14.

［2］PARKINSON J.An essay on the shaking palsy.1817［J］.J Neuropsychiatry Clin Neurosci，2002，14（2）：223-236，discussion 222.DOI：10.1176/jnp.14.2.223.

［3］ALLAM M F，DEL CASTILLO A S，NAVAJAS R F.Parkinson's disease risk factors：genetic，environmental，or both?［J］.Neurol Res，2005，27（2）：206-208.DOI：10.1179/016164105X22057.

［4］FOSTER H D，HOFFER A.The two faces of L-DOPA：benefits and adverse side effects in the treatment of Encephalitis lethargica，Parkinson's disease，multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis［J］.Med Hypotheses，2004，62（2）：177-181.DOI：10.1016/S0306-9877（03）00318-9.

［5］MURATA M.Levodopa in the early treatment of Parkinson's disease［J］.Parkinsonism Relat Disord，2009，15（Suppl 1）：S17-20.DOI：10.1016/S1353-8020（09）70006-9.

［6］BROOKS D J.Dopamine agonists：their role in the treatment of Parkinson's disease［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2000，68（6）：685-689.

［7］OBESO J A，RODRIQUEZ M C，GOROSPE A，et al.Surgical treatment of Parkinson's disease［J］.Bailliere Clin Neurol，1997，6（1）：125-145.

［8］QUDRAT A，UNNI N.Theoretical approaches to lentiviral mediated neurotrophin delivery in potential treatments of Parkinson's disease［J］.Yale J Biol Med，2016，89（2）：215-225.

［9］FJORD-LARSEN L，JOHANSEN J L，KUSK P，et al.Efficient in vivo protection of nigral dopaminergic neurons by lentiviral gene transfer of a modified Neurturin construct［J］.Exp Neurol，2005，195（1）：49-60.DOI：10.1016/j.expneurol.2005.03.006.

［10］HICKEY P，STACY M.AAV2-neurturin （CERE-120） for Parkinson's disease［J］.Expert Opin Biol Ther，2013，13（1）：137-145.DOI：10.1517/14712598.2013.754420.

［11］BARTUS R T，BAUMANN T L，BROWN L，et al.Advancing neurotrophic factors as treatments for age-related neurodegenerative diseases：developing and demonstrating "clinical proof-of-concept"for AAV-neurturin （CERE-120） in Parkinson's disease［J］.Neurobiol Aging，2013，34（1）：35-61.DOI：10.1016/j.neurobiolaging.2012.07.018.

［12］HERZOG C D，BROWN L，KRUEGEL B R，et al.Enhanced neurotrophic distribution，cell signaling and neuroprotection following substantia nigral versus striatal delivery of AAV2-NRTN（CERE-120）［J］.Neurobiol Dis，2013，58（1）：38-48.DOI：10.1016/j.nbd.2013.04.011.

［13］DAUBNER S C，LE T，WANG S.Tyrosine hydroxylase and regulation of dopamine synthesis［J］.Arch Biochem Biophys，2011，508（1）：1-12.DOI：10.1016/j.abb.2010.12.017.

［14］DE LAU L M，BRETELER M M.Epidemiology of Parkinson's disease［J］.Lancet Neurol，2006，5（6）：525-535.DOI：10.1016/S1474-4422（06）70471-9.

［15］BORAUD T，BEZARD E，BIOULAC B，et al.High frequency stimulation of the internal Globus Pallidus （GPi） simultaneously improves parkinsonian symptoms and reduces the firing frequency of GPi neurons in the MPTP-treated monkey［J］.Neurosci Lett，1996，215（1）：17-20.

［16］GHIKA J，VILLEMURE J G，F(xiàn)ANKHAUSER H，et al.Efficiency and safety of bilateral contemporaneous pallidal stimulation （deep brain stimulation） in levodopa-responsive patients with Parkinson's disease with severe motor fluctuations：a 2-year follow-up review［J］.J Neurosurg，1998，89（5）：713-718.DOI：10.3171/jns.1998.89.5.0713.

［17］Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease Study Group，OBESO J A，OLANOW C W，et al.Deep-brain stimulation of the subthalamic nucleus or the pars interna of the globus pallidus in Parkinson's disease［J］.N Engl J Med，2001，345（13）：956-963.DOI：10.1056/NEJMoa000827.

［18］ESCORS D，BRECKPOT K.Lentiviral vectors in gene therapy：their current status and future potential［J］.Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2010，58（2）：107-119.DOI：10.1007/s00005-010-0063-4.