程旭鋒，張新峰，劉 琦，喬翠霞，趙慧朵，馬書平

(1. 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，鄭州 450008； 2. 河南省腫瘤醫(yī)院，鄭州 450008； 3.河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450008； 4.河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450008)

隨著抗腫瘤技術的提高，癌癥患者的生存時間不斷延長，其發(fā)生骨轉移的風險也在不斷增加，如晚期乳腺癌骨轉移的發(fā)生率高達65 %～75 %[1-2]。臨床治療骨轉移癌的主要藥物雙磷酸鹽、地諾單抗等，主要是通過抑制破骨活性而減輕骨吸收，并不能修復已存在的骨損傷。前期研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，《金匱要略》白術附子湯及其核心藥物“附子-白術”藥對可抑制乳腺癌骨轉移、修復骨損傷，然而其作用機理尚不清楚。本文旨在研究“附子-白術”藥對對破骨細胞和成骨細胞增殖、分化及功能的影響，為“附子-白術”藥對防治惡性腫瘤骨轉移提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

10只出生48 h以內的SPF級Sprague-Dawley (SD)大鼠，購自河南省實驗動物中心(合格證號SCXK(豫)2010-0002)。

DMEM培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、0.25%胰蛋白酶溶液均為美國Invitrogn公司產品；β-甘油磷酸鈉、 磷酸化抗壞血酸(ASAP)、 地塞米松、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、17β-雌二醇 (17β-estradiol，E2)、1α, 25-(OH)2VitD3、Triton X-100、RANKL、M-CSF、抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染色試劑盒均為美國Sigma公司產品；抗酒石酸酸性磷酸酶測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產品(批號20140805)；堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP) 測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產品(批號20140805)；附片配方顆粒(批號140321)、白術配方顆粒(批號140615)均為江陰天江藥業(yè)有限公司產品。

1.2 “附子-白術”藥對藥液的制備

附片配方顆粒20包(每包相當于制附子3 g)、白術配方顆粒4包(每包相當于白術10 g)溶于1000 ml的DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，制備成100 mg·mL-1的“附子-白術”藥對溶液；采用DMEM培養(yǎng)液稀釋，制備實驗所需濃度的“附子-白術”藥對溶液(1 mg·mL-1、10 mg·mL-1)。

1.3 附子白術藥對對破骨細胞的影響

1.3.1 乳鼠破骨細胞制備與分組 無菌條件下迅速取出出生48 h以內SD大鼠的長骨，PBS沖洗骨髓腔，采用細胞濾網過濾細胞，采用Histopaque 1077 (Sigma)細胞分離液分離單核細胞，接種于24孔培養(yǎng)板中；單核細胞采用含10%的胎牛血清、50 ng/ml的RANKL和 30 ng/ml的M-CSF α-MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液1次，采用0.1%膠原酶和0.2%中性蛋白酶去除基質細胞；培養(yǎng)7 d左右，待細胞鋪滿70%～80%孔底時胰蛋白酶消化傳代，接種于24孔培養(yǎng)板中，待細胞鋪滿孔底時進行以下實驗。實驗分組為對照組、藥對低劑量組(1 mg·mL-1)和藥對高劑量組(10 mg·mL-1)。

1.3.2 TRAP 染色陽性計數(shù)[6-7]將24孔細胞培養(yǎng)板中的破骨細胞按照1.3.1項分組，每組6個復孔(n=6)，培養(yǎng)24 h吸棄上清液，加入含/或不含各劑量藥對的培養(yǎng)液進行干預72 h；PBS 沖洗3次，10%的甲醛固定3 min，蒸餾水沖洗，0.5% Triton X-100 37 ℃處理10 min。按抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒說明書進行 TRAP染色，二甲苯透明，中性塑膠封片，顯微鏡下觀察，計算整張玻片中TRAP陽性細胞數(shù)(N)。細胞相對抑制率=(N對照組-N給藥組)/N對照組×100%。

1.3.3 破骨細胞TRAP酶活力的測定[6-7]將24孔細胞培養(yǎng)板中的破骨細胞按照1.3.1項分組，每組4個復孔(n=4)，培養(yǎng)24 h吸棄上清液，加入含/或不含各劑量藥對的培養(yǎng)液進行干預72 h；PBS 沖洗3次，0.5% Triton X-100 裂解，然后按照抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 測試盒說明書進行，于酶標儀上檢測530 nm處吸光度并記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)說明書計算公式換算成金氏單位(以U/L表示)。

1.4 附子白術藥對對成骨細胞的影響

1.4.1 乳鼠顱骨成骨細胞的培養(yǎng)[6-7]與分組 無菌條件下迅速取出出生48 h以內SD乳鼠的頭蓋骨剪碎(約1 mm×1mm)，37 ℃條件下0.25%胰酶消化20 min，棄上清液，0.1% Ⅱ型膠原酶消化2次，每次30 min，收集并合并2次上清液，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液以終止消化，4 ℃溫度下1000 r/min離心10 min去上清液，加入含15% FBS 的DMEM培養(yǎng)液制備單細胞懸液，接種于24 cm2培養(yǎng)皿，24 h后更換培養(yǎng)液，除去未貼壁的細胞，以后每3 d換液1次；培養(yǎng)至細胞鋪滿70%～80%皿底時胰蛋白酶消化傳代，制備原代細胞懸液。原代細胞懸液以5×107個/L濃度接種于24 cm2培養(yǎng)皿，每皿12 ml，每2～3 d換液1次，待培養(yǎng)至細胞鋪滿70%～80%皿底時，胰蛋白酶消化傳代(記為P1代)；將P1代細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞鋪滿80% 孔底時，加入含0.1 mol/L的β-甘油磷酸鈉和10-7mol/L的地塞米松及50 mg/L的ASAP培養(yǎng)液進行成骨誘導，同時進行細胞分組進行以下實驗。實驗分為對照組、藥對低劑量組(1 mg·mL-1)和藥對高劑量組(10 mg·mL-1)。

1.4.2 MTT法檢測成骨細胞的增殖[6-8]將96孔細胞培養(yǎng)板中的成骨細胞按照1.4.1項分組，每組6個復孔(n=6)，培養(yǎng)24 h吸棄上清液，加入含/或不含各劑量藥對的培養(yǎng)液進行干預48 h，并以全培養(yǎng)液(不含破骨細胞和成骨細胞)為空白對照組(培養(yǎng)液組)；每孔加入10 g/L的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄各孔上清液，分別加入150 μL DMSO振蕩10 min，酶標儀于570 nm波長下檢測各孔吸光度(A)。相對增殖率(%)=(A給藥組-A對照組)/(A對照組-A培養(yǎng)液組)×100%。

1.4.3 成骨細胞ALP活性的測定[6-8]將96孔細胞培養(yǎng)板中的成骨細胞按照1.4.1項分組，每組4個復孔(n=4)，培養(yǎng)24 h吸棄上清液，加入含L-抗壞血酸(50 mg/L)、β-甘油磷酸鈉(10 mol/L)、地塞米松(10 μmol/L)和各劑量藥對的培養(yǎng)液進行干預72 h；按照堿性磷酸酶試劑盒說明書進行操作，酶標儀于507 nm波長下檢測各孔吸光度，根據(jù)說明書計算公式換算成金氏單位，再用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，ALP活性以U/μg表示。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 “附子-白術”對破骨細胞增殖和TRAP 活力的影響

圖1顯示，破骨細胞為貼壁細胞，邊緣呈不規(guī)則形態(tài)，經TRAP 染色后會在酶活性部位形成不溶性棕紅色染料。在顯微鏡下，可以清晰地看到胞漿呈棕紅色、細胞核數(shù)大于 3的陽性細胞，即為破骨細胞。表1所示，“附子-白術”藥對低濃度(1 mg/L)、高濃度組(10 mg/L)破骨細胞數(shù)量明顯低于對照組(P<0.05，P<0.01)，細胞抑制率分別為14.28%、32.74%；與對照組比較，“附子-白術”藥對組(1 mg/L、10 mg/L)TRAP活力值均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

圖1 各組破骨細胞TRAP染色

表1 各組破骨細胞增殖和TRAP酶活力結果

注：與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 “附子-白術”對成骨細胞增殖和ALP活力的影響

表2顯示，“附子-白術”藥對低濃度(1 mg/L)、高濃度組(10 mg/L)在570 nm 處的吸光度值明顯高于對照組(P<0.05，P<0.01)，細胞相對增殖率分別為9.09%、24.24%；與對照組比較，“附子-白術”藥對組(1 mg/L、10 mg/L)ALP活力值均顯著升高(P<0.01)。

表2 各組成骨細胞增殖結果

注：與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

骨轉移癌屬于中醫(yī)學“骨痹”“濕痹”等范疇，其發(fā)生發(fā)展與中醫(yī)腎脾關系密切[3-5]?！端貑枴の迮K生成》曰： “腎之合骨也，其榮在發(fā)，其主脾也。”《景岳全書》進一步指出： “脾腎不足及虛弱失調之人，多有積聚之病?！痹谏砩希⑴c腎相互資助、相互促進，病理上脾與腎更是相互影響、互為因果。腎陽不足，不能溫煦脾陽致脾陽不振；脾陽虛弱，可損及腎陽引起腎陽亦虛，二者最終均可導致脾腎陽虛，即脾與腎在病理上存在惡性循環(huán)關系，單獨溫腎或健脾均不能取得良好的臨床療效。因此，本課題組在既往文獻及實驗研究基礎[3-5,9-14]上提出，乳腺癌骨轉移的治療當脾腎同調，使后天之精源源不斷地化生充養(yǎng)先天，先天之精旺盛又能不斷地滋養(yǎng)后天；腎陽得溫，脾胃得健，骨轉移癌方得以抑制?！案阶?白術”藥對為《金匱要略》附子白術湯的核心藥物，具有溫腎陽健脾、通絡止痛等功效。前期研究[3-5]證實，“附子-白術”藥對可抑制乳腺癌骨轉移，減輕骨損傷。本研究考察“附子-白術”藥對對破骨細胞和成骨細胞的影響，探討其防治骨轉移癌的機理。

正常的骨代謝需要破骨細胞介導的“骨吸收”和成骨細胞介導的“骨形成”維持動態(tài)平衡[15-16]；惡性腫瘤骨轉移損傷以溶骨性損傷為主，惡性腫瘤及其分泌的細胞因子可導致破骨細胞的“骨吸收”增強，并抑制成骨細胞的“骨形成”作用減弱，從而引起溶骨性損傷。因此，抑制破骨細胞的增殖、促進成骨細胞的增殖與分化，才將有望修復溶骨性損傷[6-8]。本研究中TRAP 染色陽性細胞計數(shù)結果表明，“附子-白術”藥對低、高劑量(1 mg/L和10 mg/L)能顯著性抑制破骨細胞的增殖。破骨細胞來源于骨髓產生的破骨細胞前體，本實驗采用培養(yǎng)基中所含的1α,25-(OH)2Vit D3具有誘導破骨細胞前體分化成熟的功能，因此TRAP染色的細胞數(shù)目既包括成熟的破骨細胞，也包括經誘導而來的破骨細胞，表明“附子-白術”藥對可能具有抑制骨髓細胞向破骨細胞分化及破骨細胞增殖的作用。TRAP為破骨細胞分泌的特異性酶，其活力可代表破骨細胞的骨吸收能力和活性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，“附子-白術”藥對低、高劑量(1 mg/L和10 mg/L)組能夠顯著性抑制TRAP活力，表明“附子-白術”藥對可能具有抑制骨髓細胞的骨吸收能力和活性的作用。

成骨細胞由間充質干細胞發(fā)育而來，成骨細胞可分泌細胞外基質，在骨微環(huán)境下礦化為骨基質，骨基質中的成骨細胞分化成熟后可形成骨細胞[18]，促進成骨細胞增殖，有望成為治療各種溶骨性骨損傷的有效方法。本實驗發(fā)現(xiàn)，低、高劑量的“附子-白術”藥對(1 mg/L和10 mg/L)可促進成骨細胞的增殖。ALP是成骨細胞所分泌的蛋白酶，是成骨細胞分化的特異性標志物[19]。本實驗低、高劑量的“附子-白術”藥對(1 mg/L和10 mg/L)可增強ALP的活性，說明其可促進成骨細胞的分化。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)“附子-白術”藥對具有抑制骨髓細胞向破骨細胞分化，并抑制破骨細胞的增殖和活性及骨吸收功能的作用，同時也能促進成骨細胞的增殖和分化，將為臨床治療惡性腫瘤骨轉移提供理論和實驗數(shù)據(jù)。

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