王成志，彭元亮，史夏青，周曉慶，楊滿意，趙勁風(fēng)，廖明媚

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1. 衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3. 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2. 中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410078）

肝癌是世界上第六大癌癥，腫瘤致死率排名第二[1]。晚期肝癌的治療仍是一個(gè)世界性難題，化療雖可延長(zhǎng)晚期肝癌患者的生存期，但毒副作用較大，分子靶向治療具有無限前景，找到靶向治療的肝癌藥物迫在眉睫。

葫蘆素I（cucurbitacin I）又名JSI-124，是從葫蘆科植物中提取出來的三萜甾醇類物質(zhì)[2]，最近的研究表明葫蘆素I具有潛在的抗癌效果，能引起膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[3]、乳腺癌[4]、骨肉瘤[5]及肝癌[6]等腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而葫蘆素I引起腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制復(fù)雜。在乳腺癌[4]和骨肉瘤[5]中，葫蘆素I抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的激活，抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。在肝癌中，葫蘆素I激活P53信號(hào)[6]，上調(diào)促凋亡蛋白Fas及Bax的表達(dá)引起細(xì)胞凋亡。葫蘆素I還能通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（FGFR1）和p-STAT3抑制細(xì)胞增殖和血管生成[7-8]。葫蘆素I還能激活NF-κB信號(hào)通路[3]，引起IL-6、IL-8和SOCS3的表達(dá)升高。然而其對(duì)肝癌的作用和機(jī)制目前尚不完全明確，本研究擬探討葫蘆素I對(duì)肝癌的作用及其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞HepG2、QGY-7703、SMMC-7721均來自本實(shí)驗(yàn)室凍存。葫蘆素I購(gòu)自Sigma公司，STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）、髓樣細(xì)胞白血病1（myeloid cell leukemia 1，Mcl-1）、survivin、GAPDH一抗和二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。CCK-8試劑盒購(gòu)買自同仁化學(xué)公司，TRIzol購(gòu)買自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)買自東洋紡公司，SYBR Green染料購(gòu)買自Biotool公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)買自美國(guó)BD公司，Hochest 33342購(gòu)買自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞（HepG2、QGY-7703、SMMC-7721）培養(yǎng)于10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素，37 ℃，5%CO2，DMEM培養(yǎng)基中。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力將肝癌細(xì)胞（HepG2、QGY-7703、SMMC-7721）接種于96孔板，每孔8 000個(gè)細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，加入含有不同濃度的葫蘆素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，檢測(cè)450 nm處吸光值。

1.2.3 細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔100～200個(gè)細(xì)胞，每組2個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)過夜后更換含有不同濃度的葫蘆素I的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周，待形成肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)，PBS清洗3次，室溫干燥，甲醇固定20 min，棄甲醇后加入吉姆薩工作液染色30 min，流水洗凈，干燥后肉眼觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集處理好的細(xì) 胞， 加 入 800 μL PBS+0.5%BSA洗 滌 1次，離心去上清，加入10 μL破膜劑處理1 min，加入100 μL PI染液，室溫下靜置20 min，加入400 μL PBS+0.5%BSA重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞周期。

1.2.5 Hochest 33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集處理好的細(xì)胞，加入100 μL 0.01 mg/mL的Hoechst 33342染液，避光染色10 min，PBS洗2次，重懸細(xì)胞后滴在干凈的載玻片上，并在載玻片一端滴入少許封片劑，取干凈的蓋玻片從一端緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生，制好后熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 Western blot 收集處理后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，10%的SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%BSA封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR 收集處理的細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)PCR采用SYBR Green染料法，根據(jù)說明書體系進(jìn)行擴(kuò)增，使用β-actin作為內(nèi)參基因。QuantStudio?實(shí)時(shí)PCR軟件分析基因相對(duì)表達(dá)情況。引物序列（5'→3'）STAT3（上游：GGA GAA ACA GGA TGG CCC AA，下游：ATC CAA GGG GCC AGA AAC TG）；Mcl-1（上游：CAC TTC CGC TTC CTT CCA GT， 下 游：GGT GGC CAA AAG TCG CCC）；Survivin（ 上 游：AGG ACC ACC GCA TCT CTA CA， 下 游：TTT CCT TTG CAT GGG GTC GT）；β-actin（上游：CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC，下游：CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 葫蘆素I對(duì)肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

用不同濃度的（0.5、1、5、10 μmol/L）葫蘆素I處理肝癌細(xì)胞（HepG2、QGY-7703、SMMC-7721）24、48 h，CCK-8法分析葫蘆素I對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，各濃度的葫蘆素I均能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并具有時(shí)間和濃度依賴性（均P＜0.05）。3種細(xì)胞48 h的IC50值分別是0.19、4.16、1.13 μmol/L（圖1）。

圖1 葫蘆素I處理后肝癌細(xì)胞增殖活力變化Figure 1 Changes in proliferative viabilities of different types of HCC cells after cucurbitacin I treatment

2.2 葫蘆素I對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2克隆形成的影響

細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析葫蘆素I對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的克隆形成能力的影響，結(jié)果顯示，1 μmol/L的葫蘆素I處理幾乎完全抑制了HepG2細(xì)胞的克隆形成（圖2）。

圖2 葫蘆素I處理HepG2后細(xì)胞克隆形成情況Figure 2 Colony-forming ability of HepG2 after cucurbitacin I treatment

2.3 葫蘆素I對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)葫蘆素I處理HepG2細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示，1 μmol/L的葫蘆素I引起HepG2細(xì)胞周期改變，使細(xì)胞周期阻滯在G2期（圖3）。

圖3 葫蘆素I處理后HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期變化Figure 3 Changes in cell cycle of HepG2 cells after cucurbitacin I treatment

2.4 葫蘆素I對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

葫蘆素I處理HepG2細(xì)胞24 h后，Hochest 33342染色分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，1 μmol/L葫蘆素I處理后染色質(zhì)皺縮、細(xì)胞核固縮、核裂解，出現(xiàn)凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)變化（圖4）。

圖4 葫蘆素I處理后HepG2細(xì)胞形態(tài)變化（×400）Figure 4 Morphological change of HepG2 cells after cucurbitacin I treatment (×400)

2.5 葫蘆素I處理HepG2細(xì)胞后蛋白表達(dá)變化

用Western blot分析葫蘆素I處理HepG2細(xì)胞24 h后蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，5、10 μmol/L的葫蘆素I處理后，抗凋亡蛋白Mcl-1、survivin的表達(dá)均明顯下調(diào)；同時(shí)，5、10 μmol/L的葫蘆素I處理后，STAT3及其磷酸化分子p-STAT3的表達(dá)均明顯下調(diào)（圖5）。

圖5 葫蘆素I處理后HepG2細(xì)胞抗凋亡因子及其相關(guān)信號(hào)分子蛋白的表達(dá)Figure 5 The protein expressions of anti-apoptoti factors and the related signaling molecules in HepG2 cells after cucurbitacin I treatment

2.6 葫蘆素I處理HepG2細(xì)胞后mRNA表達(dá)相對(duì)變化

用實(shí)時(shí)定量PCR分析葫蘆素I處理HepG2細(xì)胞前后mRNA的相對(duì)變化，結(jié)果（圖6）顯示，與對(duì)照組比較，1 μmol/L葫蘆素I處理組STAT3、Mcl-1、survivin的mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)（P=0.000、0.005、0.000）。

圖6 葫蘆素I處理后HepG2細(xì)胞抗凋亡因子及其相關(guān)信號(hào)分子mRNA的表達(dá)Figure 6 The mRNA expressions of anti-apoptoti factors and the related signaling molecules in HepG2 cells after cucurbitacin I treatment

3 討 論

Mcl-1是Bcl-2家族中的主要抗凋亡蛋白[9]，在肝癌中高表達(dá)，與肝癌的生存和耐藥相關(guān)，抑制Mcl-1可增加肝癌對(duì)化療藥物的敏感性[10]。針對(duì)Mcl-1開發(fā)的抑制劑S63845具有廣譜的抗癌效果，且具有較好的安全性[11]。生存蛋白survivin在肝癌中高表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和生存，降低肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[12-14]。因此Mcl-1和survivin可能是治療肝癌的潛在靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素I不僅抑制Mcl-1和survivin的蛋白表達(dá)，還下調(diào)其mRNA的表達(dá)水平，這與在骨肉瘤細(xì)胞[5]研究結(jié)果一致。

STAT3是與腫瘤相關(guān)的一個(gè)主要轉(zhuǎn)錄因子，在肝癌中持續(xù)活化，活化狀態(tài)的STAT3（p-STAT3 Y705）能進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控下游基因表達(dá)[15-16]，促進(jìn)細(xì)胞增殖與存活。有大量研究[17-20]表明，抗凋亡Mcl-1和Survivin是STAT3信號(hào)通路的下游基因，抑制STAT3通路能顯著抑制其下游基因Mcl-1和Survivin的表達(dá)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葫蘆素I能抑制Mcl-1和survivin的表達(dá)，其是否通過STAT3通路尚不明確，我們的研究結(jié)果顯示葫蘆素I抑制了STAT3的激活，還下調(diào)Mcl-1和survivin的mRNA的表達(dá)水平，說明葫蘆素I是通過STAT3信號(hào)通路抑制Mcl-1和survivin的表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)葫蘆素I還從轉(zhuǎn)錄水平抑制STAT3的表達(dá)，與其在塞扎里綜合征中的結(jié)果一致[21]，STAT3 mRNA表達(dá)下調(diào)也與microRNA的調(diào)控相關(guān)[22]。非磷酸化的STAT3也能進(jìn)入細(xì)胞核與染色質(zhì)結(jié)合，維持染色質(zhì)的穩(wěn)定，調(diào)控基因的表達(dá)[23-24]，葫蘆素I抑制STAT3的表達(dá)還可能破壞染色質(zhì)的穩(wěn)定性，造成DNA損傷，其細(xì)胞內(nèi)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

腫瘤的發(fā)展還與細(xì)胞周期密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素I能下調(diào)cyclin B1和cdc2的表達(dá)[25]，葫蘆素D也能引起細(xì)胞周期阻滯在G2/M期[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素I能使HepG2細(xì)胞周期阻滯在G2期。

本研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素I能抑制肝癌細(xì)胞（HepG2、QGY-7703、SMMC-7721）的增殖，且具有時(shí)間和濃度依賴性。葫蘆素I抑制HepG2細(xì)胞的克隆形成，阻滯周期進(jìn)展。葫蘆素I通過STAT3信號(hào)通路抑制Mcl-1和survivin的表達(dá)，引起HepG2細(xì)胞凋亡。盡管在細(xì)胞水平葫蘆素I對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出較好效果，但由于生物體的復(fù)雜性，在體內(nèi)是否有同樣顯著效果還有待進(jìn)一步研究。

葫蘆素I能抑制肝癌細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，其初步的分子機(jī)制是葫蘆素抑制STAT3的激活，從而抑制其下游抗凋亡蛋白Mcl-1、survivin的表達(dá)。葫蘆素I可能作為一種治療肝癌的靶向藥物。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J].CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87–108. doi: 10.3322/caac.21262.

[2] Chen JC, Chiu MH, Nie RL, et al. cucurbitacins and cucurbitane glycosides: structures and biological activities[J]. Nat Prod Rep,2005, 22(3):386–399.

[3] McFarland BC, Gray GK, Nozell SE, et al. Activation of the NF-κB pathway by the STAT3 inhibitor JSI-124 in human glioblastoma cells[J]. Mol Cancer Res, 2013, 11(5):494–505. doi: 10.1158/1541–7786.MCR-12–0528.

[4] Qi J, Xia G, Huang C R, et al. JSI-124 (cucurbitacin I) inhibits tumor angiogenesis of human breast cancer through reduction of STAT3 phosphorylation[J]. Am J Chin Med, 2015, 43(2):337–347.doi: 10.1142/S0192415X15500226.

[5] Oi T, Asanuma K, Matsumine A, et al. STAT3 inhibitor, cucurbitacin I, is a novel therapeutic agent for osteosarcoma[J]. Int J Oncol,2016, 49(6):2275–2284. doi: 10.3892/ijo.2016.3757.

[6] 吳思思, 朱國(guó)念, 倪銀蕓, 等. 葫蘆素Ⅰ(JSI-124)通過p53信號(hào)通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2017,33(1):33–38.Wu SS, Zhu GN, Ni YY, et al. cucurbitacin Ⅰ (JSI-124)-induced apoptosis of HepG2 cells via p53 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology, 2017, 33(1):33–38.

[7] Yuan G, Yan S, Xue H, et al. JSI-124 suppresses invasion and angiogenesis of glioblastoma cells in vitro[J]. PLoS One, 2015,10(3):e118894. doi: 10.1371/journal.pone.0118894.

[8] Kim HJ, Kim J. Antiangiogenic effects of cucurbitacin-I[J]. Arch Pharm Res, 2015, 38(2):290–298. doi: 10.1007/s12272–014–0386–5.

[9] Zhao J, Xin M, Wang T, et al. Nicotine enhances the antiapoptotic function of Mcl-1 through phosphorylation[J]. Mol Cancer Res,2009, 7(12):1954–1961. doi: 10.1158/1541–7786.MCR-09–0304.

[10] Liao M, Zhao J, Wang T, et al. Role of bile salt in regulating Mcl-1 phosphorylation and chemoresistance in hepatocellular carcinoma cells[J]. Mol Cancer, 2011, 10:44. doi: 10.1186/1476–4598–10–44.[11] Kotschy AS, Szlavik ZN, Murray J, et al. The MCL1 inhibitor S63845 is tolerable and effective in diverse cancer models[J].Nature, 2016, 538(7626):477–482. doi: 10.1038/nature19830.

[12] Su C. Survivin in survival of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Lett, 2016, 379(2):184–190. doi: 10.1016/j.canlet.2015.06.016.

[13] 李志紅, 王志明, 穆拉德, 等. 三氧化二砷與阿霉素對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2中survivin表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)普通外科雜志, 2005,14(6):441–447.Li ZH, Wang ZM, MU LD, et al. Effects of arsenic trioxode and adriamycin on survivin expression in hepatocellular carcinoma cell line HepG2[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2005,14(6):441–447.

[14] 龍厚勇, 劉君, 鄭啟昌. Survivin在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 中國(guó)普通外科雜志, 2007, 16(3):281–283.Long HY, Liu J, Zheng QC. Expression and clinical signi fi cance of survivin in hepatocellular carcinoma[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2007, 16(3):281–283.

[15] Carpenter RL, Lo HW. STAT3 Target Genes Relevant to Human Cancers[J]. Cancers (Basel), 2014, 6(2):897–925. doi: 10.3390/cancers6020897.

[16] 廖明媚, 王成志, 楊滿意, 等. JAK2-STAT3信號(hào)通路在肝細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)普通外科雜志, 2017, 26(1):102–108.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2017.01.017.Liao MM, Wang CZ, Yang MY, et al. Research progress of JAK2-STAT3 signing pathway in hepatocellular carcinoma[J]. Chinese Journal of General Surgery, 2017, 26(1):102–108. doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2017.01.017.

[17] Wang J, Zhang G, Dai C, et al. Cryptotanshinone potentiates the antitumor effects of doxorubicin on gastric cancer cells via inhibition of STAT3 activity[J]. J Int Med Res, 2017, 45(1):220–230. doi: 10.1177/0300060516685513.

[18] Radhakrishnan H, Ilm K, Walther W, et al. MACC1 regulates Fas mediated apoptosis through STAT1/3 – Mcl-1 signaling in solid cancers[J]. Cancer Letters, 2017, 403:231–245. doi: 10.1016/j.canlet.2017.06.020.

[19] Lee DH, Sung KS, Bartlett DL, et al. HSP90 inhibitor NVPAUY922 enhances TRAIL-induced apoptosis by suppressing the JAK2-STAT3-Mcl-1 signal transduction pathway in colorectal cancer cells[J]. Cell Signal, 2015, 27(2):293–305. doi: 10.1016/j.cellsig.2014.11.013.

[20] Li S, Priceman S J, Xin H, et al. Icaritin inhibits JAK/STAT3 signaling and growth of renal cell carcinoma[J]. PLoS One, 2013,8(12):e81657. doi: 10.1371/journal.pone.0081657.

[21] van Kester MS, Out-Luiting JJ, von dem Borne PA, et al.cucurbitacin I inhibits STAT3 and induces apoptosis in Sézary cells[J]. J Invest Dermatol, 2008, 128(7):1691–1695. doi: 10.1038/sj.jid.5701246.

[22] Koukos G, Polytarchou C, Kaplan JL, et al. MicroRNA-124 regulates STAT3 expression and is down-regulated in colon tissues of pediatric patients with ulcerative colitis[J]. Gastroenterology,2013, 145(4):842–852. doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.001.

[23] Timofeeva OA, Chasovskikh S, Lonskaya I, et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.[J]. J Biol Chem, 2012, 287(17):14192–14200. doi: 10.1074/jbc.M111.323899.

[24] Pe?a G, Cai B, Liu J, et al. Unphosphorylated STAT3 modulates alpha 7 nicotinic receptor signaling and cytokine production in sepsis [J]. Eur J Immunol, 2010, 40(9):2580–2589. doi: 10.1002/eji.201040540.

[25] Su Y, Li G, Zhang X, et al. JSI-124 inhibits glioblastoma multiforme cell proliferation through G(2)/M cell cycle arrest and apoptosis augment[J]. Cancer Biol Ther, 2008, 7(8):1243–1249.

[26] Ku JM, Kim SR, Hong SH, et al. cucurbitacin D induces cell cycle arrest and apoptosis by inhibiting STAT3 and NF-κB signaling in doxorubicin-resistant human breast carcinoma (MCF7/ADR)cells[J]. Mol Cell Biochem, 2015, 409(1/2):33–43. doi: 10.1007/s11010–015–2509–9.