王成志,彭元亮,史夏青,周曉慶,楊滿意,趙勁風(fēng),廖明媚
(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1. 衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3. 神經(jīng)內(nèi)科,湖南 長(zhǎng)沙 410008;2. 中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410078)
肝癌是世界上第六大癌癥,腫瘤致死率排名第二[1]。晚期肝癌的治療仍是一個(gè)世界性難題,化療雖可延長(zhǎng)晚期肝癌患者的生存期,但毒副作用較大,分子靶向治療具有無限前景,找到靶向治療的肝癌藥物迫在眉睫。
葫蘆素I(cucurbitacin I)又名JSI-124,是從葫蘆科植物中提取出來的三萜甾醇類物質(zhì)[2],最近的研究表明葫蘆素I具有潛在的抗癌效果,能引起膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[3]、乳腺癌[4]、骨肉瘤[5]及肝癌[6]等腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,而葫蘆素I引起腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制復(fù)雜。在乳腺癌[4]和骨肉瘤[5]中,葫蘆素I抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的激活,抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。在肝癌中,葫蘆素I激活P53信號(hào)[6],上調(diào)促凋亡蛋白Fas及Bax的表達(dá)引起細(xì)胞凋亡。葫蘆素I還能通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(FGFR1)和p-STAT3抑制細(xì)胞增殖和血管生成[7-8]。葫蘆素I還能激活NF-κB信號(hào)通路[3],引起IL-6、IL-8和SOCS3的表達(dá)升高。然而其對(duì)肝癌的作用和機(jī)制目前尚不完全明確,本研究擬探討葫蘆素I對(duì)肝癌的作用及其潛在的分子機(jī)制。
人肝癌細(xì)胞HepG2、QGY-7703、SMMC-7721均來自本實(shí)驗(yàn)室凍存。葫蘆素I購(gòu)自Sigma公司,STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、髓樣細(xì)胞白血病1(myeloid cell leukemia 1,Mcl-1)、survivin、GAPDH一抗和二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。CCK-8試劑盒購(gòu)買自同仁化學(xué)公司,TRIzol購(gòu)買自Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)買自東洋紡公司,SYBR Green染料購(gòu)買自Biotool公司,細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)買自美國(guó)BD公司,Hochest 33342購(gòu)買自碧云天公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞(HepG2、QGY-7703、SMMC-7721)培養(yǎng)于10%胎牛血清,1%青霉素和鏈霉素,37 ℃,5%CO2,DMEM培養(yǎng)基中。
1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力將肝癌細(xì)胞(HepG2、QGY-7703、SMMC-7721)接種于96孔板,每孔8 000個(gè)細(xì)胞,每組5個(gè)復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁后,加入含有不同濃度的葫蘆素的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)孵育2 h,檢測(cè)450 nm處吸光值。
1.2.3 細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中,每孔100~200個(gè)細(xì)胞,每組2個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)過夜后更換含有不同濃度的葫蘆素I的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周,待形成肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng),PBS清洗3次,室溫干燥,甲醇固定20 min,棄甲醇后加入吉姆薩工作液染色30 min,流水洗凈,干燥后肉眼觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。
1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集處理好的細(xì) 胞, 加 入 800 μL PBS+0.5%BSA洗 滌 1次,離心去上清,加入10 μL破膜劑處理1 min,加入100 μL PI染液,室溫下靜置20 min,加入400 μL PBS+0.5%BSA重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞周期。
1.2.5 Hochest 33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集處理好的細(xì)胞,加入100 μL 0.01 mg/mL的Hoechst 33342染液,避光染色10 min,PBS洗2次,重懸細(xì)胞后滴在干凈的載玻片上,并在載玻片一端滴入少許封片劑,取干凈的蓋玻片從一端緩慢蓋下,避免氣泡產(chǎn)生,制好后熒光顯微鏡下觀察并拍照。
1.2.6 Western blot 收集處理后的細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,10%的SDS-PAGE凝膠電泳,250 mA轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,5%BSA封閉1 h,一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,二抗孵育1 h,TBST洗膜3次,ECL化學(xué)發(fā)光顯影。
1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR 收集處理的細(xì)胞,TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,根據(jù)試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)PCR采用SYBR Green染料法,根據(jù)說明書體系進(jìn)行擴(kuò)增,使用β-actin作為內(nèi)參基因。QuantStudio?實(shí)時(shí)PCR軟件分析基因相對(duì)表達(dá)情況。引物序列(5'→3')STAT3(上游:GGA GAA ACA GGA TGG CCC AA,下游:ATC CAA GGG GCC AGA AAC TG);Mcl-1(上游:CAC TTC CGC TTC CTT CCA GT, 下 游:GGT GGC CAA AAG TCG CCC);Survivin( 上 游:AGG ACC ACC GCA TCT CTA CA, 下 游:TTT CCT TTG CAT GGG GTC GT);β-actin(上游:CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC,下游:CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT)。
用不同濃度的(0.5、1、5、10 μmol/L)葫蘆素I處理肝癌細(xì)胞(HepG2、QGY-7703、SMMC-7721)24、48 h,CCK-8法分析葫蘆素I對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響,結(jié)果顯示,各濃度的葫蘆素I均能抑制肝癌細(xì)胞的增殖,并具有時(shí)間和濃度依賴性(均P<0.05)。3種細(xì)胞48 h的IC50值分別是0.19、4.16、1.13 μmol/L(圖1)。
圖1 葫蘆素I處理后肝癌細(xì)胞增殖活力變化Figure 1 Changes in proliferative viabilities of different types of HCC cells after cucurbitacin I treatment
細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析葫蘆素I對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的克隆形成能力的影響,結(jié)果顯示,1 μmol/L的葫蘆素I處理幾乎完全抑制了HepG2細(xì)胞的克隆形成(圖2)。
圖2 葫蘆素I處理HepG2后細(xì)胞克隆形成情況Figure 2 Colony-forming ability of HepG2 after cucurbitacin I treatment
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)葫蘆素I處理HepG2細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期變化,結(jié)果顯示,1 μmol/L的葫蘆素I引起HepG2細(xì)胞周期改變,使細(xì)胞周期阻滯在G2期(圖3)。
圖3 葫蘆素I處理后HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期變化Figure 3 Changes in cell cycle of HepG2 cells after cucurbitacin I treatment
葫蘆素I處理HepG2細(xì)胞24 h后,Hochest 33342染色分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示,1 μmol/L葫蘆素I處理后染色質(zhì)皺縮、細(xì)胞核固縮、核裂解,出現(xiàn)凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)變化(圖4)。
圖4 葫蘆素I處理后HepG2細(xì)胞形態(tài)變化(×400)Figure 4 Morphological change of HepG2 cells after cucurbitacin I treatment (×400)
用Western blot分析葫蘆素I處理HepG2細(xì)胞24 h后蛋白表達(dá)變化,結(jié)果顯示,5、10 μmol/L的葫蘆素I處理后,抗凋亡蛋白Mcl-1、survivin的表達(dá)均明顯下調(diào);同時(shí),5、10 μmol/L的葫蘆素I處理后,STAT3及其磷酸化分子p-STAT3的表達(dá)均明顯下調(diào)(圖5)。
圖5 葫蘆素I處理后HepG2細(xì)胞抗凋亡因子及其相關(guān)信號(hào)分子蛋白的表達(dá)Figure 5 The protein expressions of anti-apoptoti factors and the related signaling molecules in HepG2 cells after cucurbitacin I treatment
用實(shí)時(shí)定量PCR分析葫蘆素I處理HepG2細(xì)胞前后mRNA的相對(duì)變化,結(jié)果(圖6)顯示,與對(duì)照組比較,1 μmol/L葫蘆素I處理組STAT3、Mcl-1、survivin的mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)(P=0.000、0.005、0.000)。
圖6 葫蘆素I處理后HepG2細(xì)胞抗凋亡因子及其相關(guān)信號(hào)分子mRNA的表達(dá)Figure 6 The mRNA expressions of anti-apoptoti factors and the related signaling molecules in HepG2 cells after cucurbitacin I treatment
Mcl-1是Bcl-2家族中的主要抗凋亡蛋白[9],在肝癌中高表達(dá),與肝癌的生存和耐藥相關(guān),抑制Mcl-1可增加肝癌對(duì)化療藥物的敏感性[10]。針對(duì)Mcl-1開發(fā)的抑制劑S63845具有廣譜的抗癌效果,且具有較好的安全性[11]。生存蛋白survivin在肝癌中高表達(dá),促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和生存,降低肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[12-14]。因此Mcl-1和survivin可能是治療肝癌的潛在靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn),葫蘆素I不僅抑制Mcl-1和survivin的蛋白表達(dá),還下調(diào)其mRNA的表達(dá)水平,這與在骨肉瘤細(xì)胞[5]研究結(jié)果一致。
STAT3是與腫瘤相關(guān)的一個(gè)主要轉(zhuǎn)錄因子,在肝癌中持續(xù)活化,活化狀態(tài)的STAT3(p-STAT3 Y705)能進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控下游基因表達(dá)[15-16],促進(jìn)細(xì)胞增殖與存活。有大量研究[17-20]表明,抗凋亡Mcl-1和Survivin是STAT3信號(hào)通路的下游基因,抑制STAT3通路能顯著抑制其下游基因Mcl-1和Survivin的表達(dá)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葫蘆素I能抑制Mcl-1和survivin的表達(dá),其是否通過STAT3通路尚不明確,我們的研究結(jié)果顯示葫蘆素I抑制了STAT3的激活,還下調(diào)Mcl-1和survivin的mRNA的表達(dá)水平,說明葫蘆素I是通過STAT3信號(hào)通路抑制Mcl-1和survivin的表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)葫蘆素I還從轉(zhuǎn)錄水平抑制STAT3的表達(dá),與其在塞扎里綜合征中的結(jié)果一致[21],STAT3 mRNA表達(dá)下調(diào)也與microRNA的調(diào)控相關(guān)[22]。非磷酸化的STAT3也能進(jìn)入細(xì)胞核與染色質(zhì)結(jié)合,維持染色質(zhì)的穩(wěn)定,調(diào)控基因的表達(dá)[23-24],葫蘆素I抑制STAT3的表達(dá)還可能破壞染色質(zhì)的穩(wěn)定性,造成DNA損傷,其細(xì)胞內(nèi)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。
腫瘤的發(fā)展還與細(xì)胞周期密切相關(guān),有研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素I能下調(diào)cyclin B1和cdc2的表達(dá)[25],葫蘆素D也能引起細(xì)胞周期阻滯在G2/M期[26]。本研究發(fā)現(xiàn),葫蘆素I能使HepG2細(xì)胞周期阻滯在G2期。
本研究發(fā)現(xiàn),葫蘆素I能抑制肝癌細(xì)胞(HepG2、QGY-7703、SMMC-7721)的增殖,且具有時(shí)間和濃度依賴性。葫蘆素I抑制HepG2細(xì)胞的克隆形成,阻滯周期進(jìn)展。葫蘆素I通過STAT3信號(hào)通路抑制Mcl-1和survivin的表達(dá),引起HepG2細(xì)胞凋亡。盡管在細(xì)胞水平葫蘆素I對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出較好效果,但由于生物體的復(fù)雜性,在體內(nèi)是否有同樣顯著效果還有待進(jìn)一步研究。
葫蘆素I能抑制肝癌細(xì)胞增殖,引起細(xì)胞周期阻滯,誘導(dǎo)凋亡發(fā)生,其初步的分子機(jī)制是葫蘆素抑制STAT3的激活,從而抑制其下游抗凋亡蛋白Mcl-1、survivin的表達(dá)。葫蘆素I可能作為一種治療肝癌的靶向藥物。
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