張 能 蘇 鵬 崔 偉 黃 翔 李曉光 羅 旭

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科（貴州遵義 563003）

局限性前列腺癌行根治術(shù)后5年存活率可高達(dá)99%，但發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者5年生存率僅28%[1]。PSA、Gleason分級(jí)和臨床分期是前列腺癌危險(xiǎn)因素分級(jí)的三個(gè)關(guān)鍵因素，隨危險(xiǎn)因素等級(jí)升高患者預(yù)后越差。因此，對(duì)危險(xiǎn)因素相關(guān)的蛋白標(biāo)記物深入研究有重要的臨床價(jià)值。轉(zhuǎn)錄因子KLF4屬于組織依賴型基因，既可以作為腫瘤抑制基因也可以扮演癌基因[2,3]。KLF4在胃癌[4]、前列腺癌[5]表達(dá)量顯著降低或缺失。恢復(fù)KLF4后能降低前列腺癌細(xì)胞活性和生長(zhǎng)速度、克隆形成、遷移和侵襲，其低表達(dá)是前列腺癌預(yù)后不良的重要指標(biāo)[5]。E-cadherin最重要的生理作用是介導(dǎo)同型上皮細(xì)胞黏附和維持組織正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，E-cadherin表達(dá)下降時(shí)細(xì)胞間黏附力減低，當(dāng)腫瘤細(xì)胞一旦獲得轉(zhuǎn)移的必要條件時(shí)即發(fā)生轉(zhuǎn)移[6]。高侵襲乳腺癌的研究表明E-cadheirn是KLF4的關(guān)鍵靶基因，KLF4誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)阻滯上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。本文通過(guò)檢測(cè)人前列腺癌組織中KLF4和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，探討其與前列腺癌危險(xiǎn)因素等級(jí)間的關(guān)系及臨床意義。

材料和方法

一、臨床資料

回顧性檢測(cè)分析2015年1月至2017年1月我院泌尿外科手術(shù)切除的臨床及病理資料完整的前列腺癌標(biāo)本，共56例。所有病例術(shù)前未進(jìn)行放療及內(nèi)分泌治療，術(shù)后病理診斷為前列腺癌。年齡50～67歲（平均64.3歲）；術(shù)前PSA分布情況：＜10mg/L 9例，10～20mg/L 26例，＞20mg/L 21例；術(shù)前穿刺活檢Gleason評(píng)分情況：≤6分6例，7分33例，≥8分17例；臨床分期：≤T2a 9例，T2b 19例，≥T2c 28例。選取同期行TURP的56例BPH患者前列腺組織作對(duì)照。

二、方法

KLF4兔抗人多克隆抗體（ab26648）購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，E-cadherin（ab6528）鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz生物有限公司；SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。使用免疫組化SP兩步法檢測(cè)KLF4和E-cadherin蛋白的表達(dá)。根據(jù)廠家提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)完成具體實(shí)驗(yàn)步驟：組織標(biāo)本制作成5μm厚切片，檢測(cè)前常規(guī)脫蠟水化，經(jīng)微波修復(fù)抗原后使用過(guò)氧化酶滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次后山羊血清封閉。滴加一抗（KLF4 1:100 ，E-cadherin 1:100），4℃冰箱過(guò)夜，PBS反復(fù)沖洗3次后滴加二抗37℃孵育30 min，DAB顯色蒸餾水終止反應(yīng)，經(jīng)蘇木精復(fù)染后，樹(shù)脂封片后顯微鏡下觀察。陰性一抗對(duì)照用PBS緩沖液代替，以檢測(cè)細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，以染色細(xì)胞＞10%為陽(yáng)性表達(dá)；染色細(xì)胞＜10%為陰性表達(dá)。BPH組織中KLF4蛋白主要在細(xì)胞漿表達(dá)，少部分細(xì)胞胞核呈陽(yáng)性反應(yīng)，而前列腺癌組織中胞漿表達(dá)量明顯減少或者只有胞核表達(dá)。E-cadherin蛋白在前列腺癌細(xì)胞膜表達(dá)明顯減少，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)陽(yáng)性異常染色或以細(xì)胞質(zhì)為主的染色。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)所有統(tǒng)計(jì)資料都采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間陽(yáng)性率的檢驗(yàn)應(yīng)用x2檢驗(yàn)完成，各危險(xiǎn)因素指標(biāo)間兩種蛋白陽(yáng)性率差異性比較采用行×列表x2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05；KLF4與E-cadherin蛋白表達(dá)（交叉頻數(shù)）相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

結(jié) 果

《中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南》（2014年版）中，根據(jù)PSA、Gleason分值及臨床分期3項(xiàng)綜合指標(biāo)將前列腺癌危險(xiǎn)度分為低危、中危及高危3個(gè)等級(jí)[8]。本研究檢測(cè)前列腺癌中KLF4與E-cadherin 蛋白的表達(dá)水平，研究它們與前列腺癌不同危險(xiǎn)因素等級(jí)相應(yīng)指標(biāo)間關(guān)系。

一、KLF4和E-cadherin蛋白在人前列腺癌和BPH組織的表達(dá)

本研究中前列腺癌組織的KLF4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為12.5%（7/56），明顯低于BPH組織中表達(dá)率75%（42/56），兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=44.44，P = 0.000）；E-cadherin蛋白在前列腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為32.1%（18/56），明顯低于BPH組織中的表達(dá)87.5% （49/56），兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=35.70，P = 0.000），見(jiàn)表1和圖1。

二、前列腺癌組織中KLF4，E-cadherin的表達(dá)的相關(guān)性

根據(jù)KLF4及E-cadherin在前列腺癌組織中表達(dá)的分布情況，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示KLF4與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)，r =0.527，P＜0.05，見(jiàn)表2。

三、前列腺癌組織中KLF4與E-cadherin蛋白及其與危險(xiǎn)級(jí)別參數(shù)間的關(guān)系

56例前列腺癌組織中KLF4蛋白和E-cadherin蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)分別為7例及18例。其中KLF4和E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量在不同PSA分級(jí)中的分布情況分別是：＜10mg/L 3例、6例，10～20mg/L 4例、8例，＞20mg/L 0例、4例。KLF4及E-cadherin在不同PSA分級(jí)中表達(dá)結(jié)果顯示兩者與PSA分級(jí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2分別是6.713，6.592；P分別是0.026，0.037）。KLF4和E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量在不同Gleason分級(jí)中的分布情況分別是：≤6分 2例、12例，7分 4例、5例，≥8分 1例、1例。KLF4及在不同Gleason分級(jí)中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示KLF4蛋白與Gleason分級(jí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=0.530，P=1），但E-cadherin蛋白表達(dá)與Gleason分級(jí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異x2=15.453，P=0.000）。KLF4、E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量在不同臨床分期中的分布情況分別是：≤ T2a期 5例、12例，T2b期2例、5例，≥T2c期0例、2例，KLF4及E-cadherin在不同臨床分期中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2分別是8.936，16.598；P分別是0.007，0.000）（見(jiàn)表3）。

圖1 人前列腺癌和BPH組織中KLF4和E-cadherin蛋白的表達(dá)（SP法，×400）

表1 KLF4和E-cadherin在前列腺癌組織中及BPH中的表達(dá)

表2 前列腺癌中KLF4和E-cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

表3 KLF4與E-cadherin蛋白在前列腺癌各危險(xiǎn)因素中的表達(dá)情況及相關(guān)性

討 論

前列腺癌是發(fā)達(dá)國(guó)家男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，來(lái)自美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)顯示前列腺癌的死亡率僅次于肺癌，成為第二位致死性惡性腫瘤[9]。前列腺癌的治療包括根治性切除術(shù)、放療、化療及去勢(shì)術(shù)，為了更好的選擇治療方案及對(duì)預(yù)后進(jìn)行判斷，術(shù)前根據(jù)血清PSA 、Gleason 評(píng)分和臨床分期將前列腺癌分為低、中、高危三個(gè)等級(jí)。隨著前列腺癌危險(xiǎn)因素等級(jí)升高患者預(yù)后越差，對(duì)危險(xiǎn)因素相關(guān)的基因蛋白深入研究對(duì)提高前列腺癌的早期診斷和預(yù)后判斷非常必要。

生理狀態(tài)下KLF4對(duì)皮膚屏障形成、維持胃腸道上皮穩(wěn)態(tài)以及胃腸道上皮細(xì)胞增殖與分化[10]等方面發(fā)揮重要的作用，若敲除胃腸道上皮細(xì)胞內(nèi)的KLF4后，上皮表現(xiàn)為異常增殖、分化改變及易受射線傷害[11]。有研究證明轉(zhuǎn)錄因子KLF4參與腫瘤干細(xì)胞的維持而與造成腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為相關(guān)[12,13]，KLF4屬于組織依賴型基因，既可抑制腫瘤生長(zhǎng)也可以扮演癌基因[2,3]，在消化道腫瘤及前列腺癌中KLF4屬于抑癌基因[4,5]，并且KLF4是前列腺癌預(yù)后不良的標(biāo)志物之一。本報(bào)道結(jié)果顯示56例前列腺癌中僅7例（12.5%，7/56）KLF4蛋白表達(dá)陽(yáng)性，與相同BPH組織（75%，42/56）相比兩者間存在差異。KLF4在不同危險(xiǎn)因素中的分布情況顯示，KLF4陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量在不同PSA分級(jí)中的分布情況分別是：＜10mg/L 3例，10～20mg/L 4例，＞20mg/L 0例，KLF4在不同PSA分級(jí)中進(jìn)行比較，結(jié)果表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=6.713，P= 0.026）。這一結(jié)果目前尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但兩者各自表達(dá)變化的精確程度、可能機(jī)制及相關(guān)性研究需更大數(shù)量的病例及細(xì)胞變化內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證。KLF4表達(dá)水平與Gleason分值間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.530，P=1）；KLF4對(duì)臨床分期這一危險(xiǎn)因素的預(yù)測(cè)價(jià)值，免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)結(jié)果顯示KLF4陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量在≤T2a期、T2b期及≥T2c期分別是5例、2例及0例，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示不同臨床分期中KLF4表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=8.936，P= 0.007）。這表明隨著臨床分期越晚KLF4蛋白表達(dá)越低，結(jié)合PSA及臨床分期情況提示KLF4是前列腺癌預(yù)后重要的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

E-cadherin蛋白主要表達(dá)于上皮細(xì)胞內(nèi)，介導(dǎo)同型細(xì)胞黏附及維持組織的形態(tài)。上皮來(lái)源的惡性腫瘤中E-cadherin都呈低表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；分子機(jī)制顯示E-Cadherin表達(dá)減少參與了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移最關(guān)鍵步驟[14]。侯鑄等[15]發(fā)現(xiàn)前列腺癌中E-cadherin表達(dá)減少。E-cadherin在BPH組織上皮呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，前列腺癌組織表達(dá)明顯減弱，本實(shí)驗(yàn)顯示18例前列腺癌組織中E-cadherin蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性（18/56，32.1%），與BPH組織（87.5%，49/56）相比兩者間存在差異（x2=35.70，P= 0.000）。在不同危險(xiǎn)因素中的分布情況顯示，E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量在不同PSA分級(jí)中的分布情況分別是：＜10mg/L 6例，10～20mg/L 8例，＞20mg/L 4例，E-cadherin在不同PSA分級(jí)中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=6.592，P=0.037）；Gleason分級(jí)中結(jié)果顯示≤6分、7分及≥8分 E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性分別為12例、5例及1例，隨著Gleason分值增加E-cadherin蛋白的表達(dá)逐漸降低，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=15.453，P=0.000）。前列腺癌Gleason分級(jí)越高細(xì)胞形態(tài)學(xué)異型性不斷升高甚至出現(xiàn)壞死組織結(jié)構(gòu)，前列腺組織失去正常上皮結(jié)構(gòu)；E-cadherin是上皮表型最重要的標(biāo)志物，它隨著上皮細(xì)胞減少而呈低表達(dá)狀態(tài)，因此隨著Gleason分級(jí)越高E-cadherin表達(dá)越低。不同Gleason分級(jí)間E-cadherin表達(dá)異常有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合IHC顯示E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量在≤T2a期、T2b期及≥T2c期分別是10例、6例及2例，不同臨床分期中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=16.598，P=0.000）。本次檢測(cè)的E-cadhein蛋白表達(dá)與前列腺癌組織分化程度及臨床分期間的關(guān)系和既往研究結(jié)果一致[15]。上述結(jié)果表明KLF4及E-cadherin蛋白隨著前列腺癌組織分級(jí)降低、腫瘤浸潤(rùn)深度加深而降低，這一結(jié)果提示兩種蛋白表達(dá)減少或者缺失與前列腺癌危險(xiǎn)因素分級(jí)密切相關(guān)，是前列腺癌除PSA、Gleason分級(jí)及臨床分期等公認(rèn)的危險(xiǎn)因素之外的重要分子標(biāo)志物，他們的異常表達(dá)亦能判定前列腺癌的臨床進(jìn)展及預(yù)后。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中KLF4和E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)（r =0.527，P＜0.05），提示KLF4和E-cadherin蛋白表達(dá)降低在前列腺癌分級(jí)中相互促進(jìn)，它們?cè)谇傲邢侔┲械南嗷プ饔煤芸赡芡橄侔┑那忠u轉(zhuǎn)移一樣，由于E-cadherin的減少引起KLF4表達(dá)降低，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[7]。前列腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有著密切的關(guān)系，而EMT最重要的標(biāo)志是E-cadherin蛋白表達(dá)量減少或者缺失。前列腺癌組織中E-cadherin、KLF4蛋白低表達(dá)在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，聯(lián)合檢測(cè)E-cadherin和KLF4蛋白可以更有效的判斷前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性?，F(xiàn)在推測(cè)可能的機(jī)制是E-cadherin蛋白的減少引起KLF4表達(dá)降低，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞浸潤(rùn)甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)，在前列腺癌中KLF4和E-cadherin變化及可能機(jī)制需在分子水平及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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