李非凡 楊 昊 肖佳云 王靈敏 黃 婭 王 羽 滕曉明

同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院（上海 201204）

隨著輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)約有50%的不育由于男性生殖功能缺陷導(dǎo)致[1]。而男性不育原因有很多，如染色體異常、內(nèi)分泌異常、精索靜脈曲張、繼發(fā)于感染或輸精管切除梗阻性不育等等。精液常規(guī)參數(shù)如精液量、精子濃度、pH值、前向運運精子百分率（PR,%）以及精子形態(tài)等評價精液質(zhì)量有局限性，約有15%左右的男性不育患者精液常規(guī)分析為正常且各參數(shù)波動較大，已不能滿足臨床需要[2]。精子DNA碎片率（DNA fragmentation index，DFI）反映了遺傳物質(zhì)DNA的完整性或損傷程度，被認(rèn)為是一個輔助評價精液質(zhì)量的重要指標(biāo)，尤其是在輔助生殖技術(shù)方面。本文對精子DFI和精液常規(guī)檢查參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行研究。

資料與方法

選擇2016年1月至2016年12月在本院就診的3 020位男性作為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：身體健康，無睪丸外傷、腮腺炎、家族遺傳性疾病及性功能障礙病史，無不良生活嗜好（酗酒、吸煙等），男性檢查睪丸、附睪、輸精管等均無異常。精液檢查之前禁欲2～7d。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重少精子癥患者，即精子濃度＜2×106/mL；（2）精液檢查有白細(xì)胞精液癥的患者[3]；（3）手淫法取精過程中有遺漏者；（4）精液不液化及液化不良者。

一、采集方法

用手淫法收集精液并射入專用清潔的廣口塑料容器中，樣本放置37℃恒溫箱60min內(nèi)待其完全液化利用計算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)獲取所需各項精液常規(guī)參數(shù)。同時將樣本分裝到1.5 ml的EP管中并放置于-20℃冰箱冷凍保存，在一周內(nèi)立即借助流式細(xì)胞儀進(jìn)行DFI分析檢測。

二、儀器與試劑

1. 精液常規(guī)分析：精子濃度、精子總活力、前向運動精子百分率、精子總數(shù)等通過西班牙SCA分析儀和日本Nikon顯微鏡進(jìn)行分析。將10μL已經(jīng)完全液化的精液加至以色列產(chǎn)精子計數(shù)板（Makler counting chamber，se fi-medical instruments）配合SCA進(jìn)行分析，得到精子濃度、總活力、前向運動精子百分率等并記錄。

2. 精子DNA完整性檢測：采用浙江星博生物科技有限公司精子核完整性染色試劑盒（SCSA）試劑盒，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號：YZB/浙（甬）0159-2-12。標(biāo)本制備：嚴(yán)格按照說明書操作。流式細(xì)胞儀檢測樣本：平衡樣品線后將已染好色的樣本加入樣品室，立即啟動樣品流；檢測精子的流動速度（流動速度應(yīng)在100～300個/s，若速度過大，應(yīng)重新稀釋樣本）；2min后開始收集數(shù)據(jù)，至少有5000個細(xì)胞的測定值加以記錄和統(tǒng)計；每個樣本至少連續(xù)檢測兩次。結(jié)果判讀：精子核經(jīng)過酸處理液處理后，經(jīng)吖啶橙染色，異常精子核染色質(zhì)成單鏈與染料吖啶橙結(jié)合發(fā)橙黃色或紅色熒光；正常精子核染色質(zhì)為雙鏈，與吖啶橙結(jié)合發(fā)綠色熒光，若紅光比值增高，說明精子核完整性程度降低。如圖1，DFI正常散點在綠色熒光區(qū)域較為集中，圖2分散為DFI異常。

圖1 DFI正常

三、統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0軟件包，相關(guān)性分析使用雙變量并用Pearson分別進(jìn)行分析。P＜0.05時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 DFI異常

結(jié) 果

一、DFI與精液參數(shù)的關(guān)系

本研究結(jié)果表明，DFI值與精子濃度不存在相關(guān)性（r =0.003，P＞0.05）。DFI值與精子總活力存在顯著負(fù)相關(guān)（r =-0.447，P＜0.01）；DFI值與前向運動精子百分率存在顯著負(fù)相關(guān)（r = -0.444，P＜0.01）。DFI值與精液量存在正相關(guān)（r =0.078，P＜0.01）；DFI值與精子總數(shù)存在正相關(guān)（r =0.069，P＜0.01），見表1。

表1 DFI與精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性分析

討 論

特發(fā)性不育人群，一般認(rèn)為存在精子功能異?；蛱囟ɑ蚍肿尤毕菁吧趁庖弋惓５龋珼NA損傷會導(dǎo)致受精失敗，甚至影響受精卵、胚胎發(fā)育[4]。人類精子DNA是遺傳信息載體，其完整性程度決定遺傳物質(zhì)能否正確傳遞給子代，精子染色質(zhì)損傷影響精子的受精能力[6]。目前認(rèn)為，導(dǎo)致精子DNA損傷主要有3個原因：精子染色質(zhì)組裝異常，精子細(xì)胞的異常凋亡以及氧化應(yīng)激反應(yīng)[5,7]。在精子的逐漸成熟過程中，組蛋白為體積更小的富含精氨酸和半胱氨酸的魚精蛋白（HP）所取代，這一過程降低了精子本身對內(nèi)外環(huán)境變化的修復(fù)能力，DNA雙鏈超螺旋折疊壓縮過程中產(chǎn)生的扭曲應(yīng)力修復(fù)異常，導(dǎo)致精子DNA碎片化及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常[8]。但魚精蛋白和二硫鍵共同作用使精子染色體高度濃縮從而更加緊密，成熟后的精子對內(nèi)外環(huán)境變化抵抗力較強(qiáng)[9]。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的主動性生理性自殺行為，對動物個體的正常發(fā)育、自穩(wěn)態(tài)的維持、免疫耐受等多種生理病理過程具有重要意義。人體細(xì)胞凋亡失調(diào)（包括不恰當(dāng)?shù)募せ罨蛞种疲l(fā)多種多方面疾病，精子DNA損傷包括其中。在生成精子較少的睪丸中，已經(jīng)開始凋亡的生殖細(xì)胞終止凋亡，偏離正常程序，并進(jìn)一步分化成成熟精子，會顯著增加精子DNA碎片。研究表明，空氣污染、吸煙都會導(dǎo)致精子DNA異常凋亡。機(jī)體過量生物活性氧類物質(zhì)不再有助于精子獲能，開始導(dǎo)致精子DNA質(zhì)膜完整性損傷以及DNA鏈的斷裂，從而損傷精子DNA。

許多方法已被開發(fā)應(yīng)用于精子DNA完整性分析，如末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法（TUNEL）、精子染色質(zhì)擴(kuò)散實驗（SCD）和精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）等方法。本文檢測精子DNA碎片試劑盒所用為SCSA法，SCSA法快速、無偏差地通過流式細(xì)胞儀分析結(jié)合吖啶橙與單、雙鏈DNA結(jié)合后產(chǎn)生不同熒光而對精子DNA完整性進(jìn)行評估，可以提供具有卓越精確度和重復(fù)性的強(qiáng)大統(tǒng)計數(shù)據(jù)，具有非常低的變異系數(shù)且操作方便，適合大量精子快速評估（～5000），可以進(jìn)行批量檢測，滿足臨床需求。在常規(guī)實驗室操作中具有靈活性，可用冷凍標(biāo)本[10,11]。

精子DNA完整性檢測在輔助診斷男性不育中的作用已越來越受重視。一般檢測結(jié)果中將精子DFI結(jié)果分為DFI≤15%、15%＜DFI≤30%、DFI＞30% 3組，DFI值越高，反映精子DNA完整性越差。本研究結(jié)果表明，精子濃度與DFI值不存在相關(guān)性，精子總活力、PR與DFI值存在顯著負(fù)相關(guān)，精液量與精子總數(shù)和DFI值存在顯著正相關(guān)。其中精子DFI與患者精子總活力、PR級精子百分率存在明顯的負(fù)相關(guān)，與孫靜波等[12]和麥選誠等[3]的研究相一致，即表明精子活力越好，DFI越低，其DNA完整性越好。而DFI與精子濃度無顯著相關(guān)性，與麥選誠等2016年得出研究結(jié)果一致[3]，而與此前曾蘭等得出的DFI與精子濃度呈負(fù)相關(guān)性結(jié)果不一致[2]。值得一提的是與此前研究[9,12]精子總數(shù)、精液量與DFI無顯著相關(guān)性不同，本次統(tǒng)計得出精子總數(shù)、精液量均和DFI呈顯著正相關(guān)，即是精子總數(shù)越高，DFI值越高，精子DNA完整性越差。其原因尚未清楚，推測可能受到禁欲天數(shù)影響，禁欲天數(shù)越長相對的精液量和精子總數(shù)就越多，精子核碎片增多，DFI增高。本設(shè)計作為一個初步的相關(guān)性分析，還存在一定不足，如未對禁欲天數(shù)進(jìn)行分類統(tǒng)計比較。但就目前結(jié)果而言，精子DNA碎片指數(shù)與多項精液參數(shù)都存在顯著相關(guān)性，尤其是精子總活力和前向運動精子百分率。

結(jié) 論

我們通過研究精子DNA碎片指數(shù)與精液參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了精子DNA碎片指數(shù)與精子總活力、前向運動精子百分率負(fù)相關(guān)這個“表象”，至于是否有更深層次的機(jī)制聯(lián)系，有待進(jìn)一步深入研究。而這些精液參數(shù)指標(biāo)一定程度上可以為評價精子DNA完整性提供參考，可以為有需求卻暫時無法開展精子DNA碎片檢查項目的醫(yī)院提供參考。

1 黎智彪, 嚴(yán)共全, 黃莉, 等. 精子DNA碎片率與男性不育的關(guān)系研究. 中國醫(yī)藥科學(xué) 2016; 6(9): 128-130

2 曾蘭, 葉飛, 李運星, 等. 精子DNA完整性與精液常規(guī)參數(shù)相關(guān)性分析. 中國計劃生育和婦產(chǎn)科 2014; 6(4): 47-50

3 麥選誠, 董云華, 陳斌, 等. 不育患者精子DNA損傷和精液常規(guī)參數(shù)關(guān)系分析. 中國男科學(xué)雜志 2016; 30(4): 19-22

4 張艷萍, 張麗紅, 邱毅. 特發(fā)性男性不育癥患者精子功能檢測的臨床分析. 生殖與避孕 2015; 35(7): 489-493

5 Evenson D,Wixon R. Meta-analysis of sperm DNA fragmentation using the sperm chromatin structure assay.Reprod Biomed Online 2006; 12(4): 466-472

6 Osman A, Alsomait H, Seshadri S, et al. The effect of sperm DNA fragmentation on live birth rate after IVF or ICSI: a systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online 2015; 30(2): 120-127

7 Gomes M, Goncalves A, Rocha E, et al. Effect of in vitro exposure to lead chloride on semen quality and sperm DNA fragmentation. Zygote 2015; 23(3): 384-393

8 陳亮, 徐陽. 精子DNA碎片化檢測在男性生殖領(lǐng)域的臨床應(yīng)用. 中國男科學(xué)雜志 2014; 28(7): 60-62

9 秦文松, 劉英, 段金良. 精子DNA碎片指數(shù)與精液參數(shù)的相關(guān)性研究. 中國性科學(xué) 2014; 23(4): 55-57

10 Evgeni E, Charalabopoulos K, Asimakopoulos B. Human sperm DNA fragmentation and its correlation with conventional semen parameters. J Reprod Infertil 2014;15(1): 2-14

11 Donald P. Evenson. The sperm chromatin structure assay(SCSA) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci 2016; 169(6): 56-75

12 孫靜波, 姜宏, 何瑞冰.精子DNA完整性與精液參數(shù)的相關(guān)性研究. 中國男科學(xué)雜志 2010; 24(4): 26-29