美合日古麗·薩塔爾 張盼盼 斯依提·阿木提買買提祖農(nóng)·買蘇爾 姚巧玲 蔣 萍 阿地力江·伊明**

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（烏魯木齊 830011）；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室；3. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室

膽固醇向孕烯醇酮轉(zhuǎn)化是類固醇激素生物合成的必經(jīng)途徑，該反應(yīng)發(fā)生在線粒體內(nèi)膜上，但其反應(yīng)底物膽固醇卻位于線粒體外膜的細(xì)胞質(zhì)中[1]，類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein , StAR protein）在此過程中起著重要調(diào)節(jié)作用。長(zhǎng)期慢性濕寒刺激是眾多疾病的發(fā)病誘因，異常黏液質(zhì)證候與陽痿病證模型大鼠性腺軸相關(guān)激素發(fā)生紊亂[2]，本文探討異常黏液質(zhì)型證候與陽痿病證模型大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞StAR的表達(dá)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取正常SD雄性大鼠40只，雌性20只（用于交配實(shí)驗(yàn)），體質(zhì)量為（200±20）g，均由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、主要儀器與試劑

人工氣候箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：BIC-400）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Proteinsimple，型號(hào)：FluorChem E）；阿撲嗎啡（美國Sigma公司）；伊木薩克片（新疆和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20130501）；睪酮放免試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所有限公司）；兔抗鼠StAR抗體（Santa Cruz公司）；羊抗兔二抗試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）；化學(xué)發(fā)光試劑盒（日本nacalai 公司）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）動(dòng)物模型的建立和分組

將40只雄性大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，通過性行為學(xué)與阿撲嗎啡（apomorphin，APO）實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其具有正常性功能后納入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)取8只雄性SD大鼠為正常組，余32只復(fù)制異常黏液質(zhì)證候模型，造模20周后通過APO勃起實(shí)驗(yàn)和性行為學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選出陽痿病證模型后，隨機(jī)分為病證模型組、病證用藥組，未成陽痿者隨機(jī)分為證候模型組及證候用藥組，兩用藥組采用伊木薩克片干預(yù)2周。

（二）取材

用藥2周后，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，分離血清；取一側(cè)睪丸，常規(guī)光、電鏡標(biāo)本固定。另一側(cè)睪丸凍存?zhèn)溆谩?/p>

（三）放免法檢測(cè)血清中睪酮含量

用放免法檢測(cè)血清T含量，具體操作過程按試劑盒說明書在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)放免實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

（四）形態(tài)學(xué)標(biāo)本制作

將甲醛固定的睪丸組織進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚4μm，常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin,H-E）染色，中性樹膠封片后，光鏡下觀察。將戊二醛和鋨酸雙固定的睪丸組織丙酮梯度脫水，Epon環(huán)氧樹脂包埋切片，鉛鈾染色（由新疆醫(yī)科大學(xué)電鏡室制作），JEOLJEM1230透視電鏡下觀察。

（五）免疫組織化學(xué)顯色與評(píng)分

睪丸標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚4μm。采用過氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（S-P）免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封固。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。光鏡下評(píng)分方法：光鏡下每張睪丸切片選取10個(gè)不重復(fù)視野（×200）觀察陽性范圍（0～100）和著色密度（0：無著色；1：弱著色；2：中度著色；3：強(qiáng)著色），最終結(jié)果=（陽性范圍×著色密度）/觀察視野；分值范圍：0～300。

（六）免疫印跡檢測(cè)StAR蛋白的表達(dá)

睪丸組織裂解、定量檢測(cè)蛋白濃度，20μg 蛋白樣品上樣于10% 聚丙烯酰胺（SDS-PAGE） 凝膠進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，PVDF膜用兔源性多克隆抗體StAR（1:500）和β-Tublin（1:1 000）4℃冰箱孵育過夜，TBST洗滌后，滴加二抗室溫孵育2 h，洗膜，然后在目的條帶上滴加化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescent, ECL）劑，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光檢測(cè)蛋白表達(dá)。將獲得的圖像在ImageJ分析軟件進(jìn)行灰度分析，分別測(cè)量StAR蛋白條帶灰度值和β-Tublin蛋白條帶灰度值，兩值相除得出StAR蛋白相對(duì)表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清睪酮含量結(jié)果

3只大鼠造模過程中死亡。放免法血清睪酮含量檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，兩模型組外周血睪酮水平明顯降低（P＜0.05）。伊木薩克片干預(yù)2周后，證候用藥組較證候模型組T水平明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），病證用藥組較病證模型組T水平亦有所上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組大鼠血清睪酮含量變化（±s）

表1 各組大鼠血清睪酮含量變化（±s）

注：與正常組比較，*為P ＜0.05 ；與證候模型組比較，#為P ＜0.05

正常組(n=8) 模型組 用藥組證候(n=8) 病證(n=8) 證候(n=5) 病證(n=8)外周血睪(ng/mL) 1.53±0.79 0.37±0.22* 0.32±0.17* 0.77±0.13# 0.43±0.21*

二、 睪丸光鏡形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

1. 正常組：形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常（見圖1A1、圖1A2）。

圖1 各組大鼠睪丸H-E及IHC染色結(jié)果

2. 證候模型組：生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分生精細(xì)胞壞死脫落（見圖1B1、圖1B2）。

3. 病證模型組：生精細(xì)胞數(shù)量及間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，并伴生精管腔內(nèi)精子數(shù)量減少或無精子（見圖1C1、圖1C2）。

4. 證候用藥組：生精小管形態(tài)、生精細(xì)胞數(shù)量同正常組（見圖1D1、圖1D2）。

5. 病證用藥組：生精小管形態(tài)、生精細(xì)胞數(shù)量較病證模型組改變不明顯（見圖1E1、圖1E2）。

三、 睪丸電鏡觀察

1. 正常組：精原細(xì)胞、支持細(xì)胞緊靠基膜且排列致密，各類生精細(xì)胞層數(shù)較多，精母細(xì)胞核圓，線粒體豐富，生精小管管腔內(nèi)可見較多精子（見圖2A）。

2. 證候模型組：生精細(xì)胞層數(shù)減少，部分壞死，少見精子細(xì)胞，管腔內(nèi)可見精子，胞質(zhì)電子密度變深，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張（見圖2B）。

3. 病證模型組：各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可見精原細(xì)胞、精母細(xì)胞核固縮，精子細(xì)胞界限不清；支持細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分?jǐn)U張（見圖2C）。

4. 證候用藥組：生精細(xì)胞數(shù)量增多，胞質(zhì)電子密度恢復(fù)正常（見圖2D）。

5. 病證用藥組：生精細(xì)胞數(shù)量有所增加，管腔內(nèi)可見少量精子（見圖2E）。

圖2 各組大鼠睪丸電鏡結(jié)果（×2500）

四、睪丸StAR蛋白免疫組化結(jié)果

證候模型組（143.5±22.9）和病證模型組（133.2±64.9）StAR表達(dá)水平顯著低于正常組（232.6±58.6），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；證候用藥組（216.0±47.7）大鼠睪丸間質(zhì)中StAR表達(dá)水平高于證候模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；病證用藥組（159.2±38.3）表達(dá)水平與病證模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見圖1A3至圖1E3）。

五、 睪丸StAR蛋白免疫印跡結(jié)果

各組印跡結(jié)果見圖3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,與正常組（0.71±0.19）相比，證候模型組（0.34±0.05）、病證模型組（0.27±0.08）StAR蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；證候用藥組StAR蛋白表達(dá)水平（0.53±0.05）較證候模型組顯著升高（P＜0.05），病證用藥組表達(dá)水平（0.36±0.09）與病證模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見圖3）。

圖3 睪丸StAR蛋白免疫印跡結(jié)果

討 論

膽固醇由位于睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體外膜上的StAR轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜[3,4]，在細(xì)胞色素 P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）的催化下，膽固醇被轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，后者被轉(zhuǎn)運(yùn)至滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，一方面在β羥類固醇脫氫酶（3β-HSD）作用下被轉(zhuǎn)化為孕酮 ，另一方面被細(xì)胞色素 P450 17α羥化酶（P450c17）催化為17-羥孕酮和雄烯二酮；雄烯二酮在17β羥類固醇脫氫酶（17β-HSD）作用下生成睪酮[5]。目前認(rèn)為StAR在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中起限速作用，StAR蛋白表達(dá)水平與孕烯醇酮的合成水平呈正相關(guān)[6,7]。

已知異常黏液質(zhì)型證候與陽痿病證模型大鼠精子活率與活力顯著性下降，同時(shí)外周血清睪酮水平顯著降低，本研究結(jié)果顯示，光、電鏡下證候模型組及病證模型組睪丸生精小管生精細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常組，生精上皮部分壞死，管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少或無精子，支持細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；兩用藥組上述形態(tài)結(jié)構(gòu)改變部分得到恢復(fù)；免疫組織化學(xué)及免疫印跡結(jié)果顯示兩模型組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中StAR蛋白較正常組顯著降低，兩用藥組StAR蛋白水平較模型組上調(diào)。

綜上表明，異常黏液質(zhì)證候及陽痿病證模型大鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)可發(fā)生病理改變，其機(jī)制可能與睪酮水平下降、睪丸間質(zhì)細(xì)胞StAR水平下降有關(guān)，而對(duì)證維藥伊木薩克片可在一定程度上改善此病理變化。本研究團(tuán)隊(duì)在以往工作中，依據(jù)維吾爾醫(yī)學(xué) “體液論”，建立了維醫(yī)證候和病證概念模型，而該模型亦可出現(xiàn)精子數(shù)量減少，活力降低，這不僅體現(xiàn)了維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽痿與少弱精子癥的同證異病的科學(xué)內(nèi)涵，同時(shí)也提示濕寒性環(huán)境結(jié)合特定的飼料可致使生殖功能受損，這與在寒冷飼養(yǎng)環(huán)境下牛的腎上腺功能低下，雌三醇與睪酮水平減低，影響受孕的文獻(xiàn)報(bào)道[8,9]有一定的類似性。因此，是否睪酮水平的降低是異常黏液質(zhì)證候及陽痿病證的發(fā)病基礎(chǔ)，是否睪丸間質(zhì)細(xì)胞StAR水平下降是該模型睪酮水平變化的物質(zhì)基礎(chǔ)，是否能在上述理論基礎(chǔ)上建立異常黏液質(zhì)型少弱精子癥模型大鼠，仍有待進(jìn)一步研究。

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