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        Nano DSC法測定ILPR G-四鏈體的熱力學性質

        2018-03-21 01:09:29張又右史全王思雨譚志誠王韶旭
        大連交通大學學報 2018年1期
        關鍵詞:溫區(qū)構象溶菌酶

        張又右,史全,王思雨,譚志誠,王韶旭

        (1.大連交通大學 環(huán)境與化學工程學院,遼寧 大連116028;2.中國科學院大連化學物理研究所 熱化學實驗室,遼寧 大連 116023)

        0 引言

        端粒結構存在于染色體末端,是一種富含鳥嘌呤(Guanine)的非編碼重復序列.端粒DNA的四個鳥嘌呤G在一價金屬陽離子(如K+、Na+)的誘導下[1]可以通過堿基間Hoogsteen氫鍵作用形成環(huán)狀的芳香平面結構——G-四分體(G-quartets),平面通過π-π相互作用進一步形成四鏈體結構.已有文獻報道,當DNA序列形成穩(wěn)定的G-四鏈體時,端粒酶活性降低,相關基因的轉錄和表達被明顯抑制[2].在生物體內,G-四鏈體的不同堿基類型、空間構象、溝槽種類等決定了G-四鏈體具有多態(tài)性和特異性,使得G-四鏈體能夠作為藥物選擇性識別的靶點.因而近年來G-四鏈體在小分子抗病毒[3]和抗腫瘤[4]藥物合成方面得到了廣泛的關注.

        ILPR(insulin linkage polymorohism region)是位于染色體胰島素基因近側啟動子365 bp處的一個基因片段[5],其堿基序列為5′-ACAG4TGTG4-3′.Kennedy等[6]證實了ILPR序列能調節(jié)轉錄因子的活性,且能夠在胰島β細胞之間傳遞轉錄信號,該序列的增多會導致病毒基因具有高傳染性,因此ILPR序列是Ⅰ型糖尿病這一多基因遺傳病的關鍵.Schonhoft等[7]提出當ILPR序列折疊形成穩(wěn)定的G-四鏈體結構時,轉錄水平降低,病毒基因表達被抑制,從而達到靶向治療的目的.

        近年來國內外學者對ILPR G-四鏈體進行了一系列結構和性質研究.Schonhoft等[7]使用熒光淬滅法研究了ILPR G-四鏈體與胰島素溶液的結合常數(shù).Jennifer等[8]利用圓二色光譜法測定了ILPR G-四鏈體與胰島素結合后的結構變化并設計了相應的電化學傳感器.Xiao等[9]在其工作中使用等離子共振技術研究了ILPR G-四鏈體和胰島素樣生長因子-2(IGF-2)的解離常數(shù).Christine等[10]研究了ILPR G-四鏈體與胰島素的作用機制且證明了ILPR能在鉀離子溶液中形成穩(wěn)定的G-四鏈體結構.這些研究在一定程度上探究了G-四鏈體的性質,揭示了ILPR序列和胰島素的結合作用,然而對ILPR G-四鏈體的熱力學性質如比熱研究等涉及較少.

        差示掃描微量熱儀技術(Nano DSC)能夠準確地測定微瓦級別的熱效應,具有高靈敏性和穩(wěn)定的控溫能力,這一量熱技術能從能量角度提供光譜法等其他方法無法直接得到的熱力學基礎參數(shù),在測定G-四鏈體等小分子時能準確獲取體系中相互作用的能量信息.

        本研究主要利用TA Nano DSC在40~100℃溫區(qū)測量了ILPR G-四鏈體在K+溶液中的熔融溫度Tm、融化焓ΔH和等壓比熱Cp,并通過兩態(tài)模型對實驗數(shù)據(jù)進行了擬合,將熱力學行為與微觀結構變化結合起來,為當前進一步研究ILPR G-四聯(lián)體提供新思路.

        1 實驗方法

        1.1 試劑與儀器

        ILPR序列的DNA片段由上海生工生物工程有限公司合成和純化, DNA序列通過質譜檢測,分子量誤差<0.1%;氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀,分析純,購自天津阿法埃莎(Alfa Aesar)化學有限公司;0.1 mol/L甘氨酸溶液(pH為2.4)和0.925 mg/mL溶菌酶溶液由TA Instruments提供;實驗用水為高純水.

        1.2 DNA樣品預處理

        將50 OD DNA片段溶于高純水中,于4℃低溫靜置保存12 h,配置成儲存液.配置PBS緩沖液: 10 mmol/L的K2HPO4溶液和KH2PO4溶液中加入 100 mmol/L的KCl緩沖溶液(調節(jié)pH為7.4).儲存液中加入5 mL PBS緩沖液混合,留作退火處理.

        1.3 Nano DSC實驗

        1.3.1 誤差校準

        使用隨配的脫氣裝置,在20 inches Hg的真空度下將待測甘氨酸與溶菌酶標準試劑脫氣15 min,消除氣泡對后續(xù)實驗的干擾.基線實驗在3 atm壓力下以1℃/min的升溫速率預掃描甘氨酸溶液至85℃,后續(xù)從25℃升溫至85℃,重復兩遍.標準樣品實驗在3 atm壓力下掃描溶菌酶溶液至85℃.誤差校準實驗重復3遍.

        1.3.2 預掃描

        為了避免溶液與儀器器壁之間的熱量交換對熱流信號產生影響,實驗前12 h將適量PBS溶液進樣至Nano DSC中,以1℃/min的升降溫速率進行循環(huán)實驗.

        1.3.3 DNA退火

        混合液在Nano DSC中以1.5℃/min的速率從室溫升至90℃,于90℃恒溫10 min,以確保序列處于單鏈無序狀態(tài),再以0.1℃/min的速率緩慢降至4℃.

        1.3.4 G-四鏈體測定

        緩沖液掃描在3 atm 壓力下于40~110℃溫度范圍內,以0.5℃/min的速率升溫PBS緩沖溶液,重復測定2次.樣品掃描在3 atm 壓力下于40~110℃溫度范圍內,以0.5℃/min的速率升溫退火后的G-四鏈體溶液.

        1.3.5 UV-vis測定

        以PBS緩沖液做參比溶液,在1 cm石英比色皿中加入一定濃度的退火后的G-四鏈體溶液,在波長190~350 nm之間以0.5 nm為間隔測定其吸光度.

        2 實驗結果與討論

        2.1 Nano DSC誤差校準結果

        在40~75℃溫區(qū)范圍內校準0.1 mol/L甘氨酸緩沖液熱流基線后,0.925 mg/mL溶菌酶的摩爾比熱隨溫度變化的曲線Cp,m-T如圖1所示.其中圓點、方塊與三角形分別代表了第一次、第二次與第三次的實驗結果.如圖1所示,溶菌酶的摩爾比熱隨著溫度升高呈現(xiàn)對稱的吸熱峰,在57℃左右有一個吸熱峰值,峰頂溫度即為熔融中點溫度Tm.

        圖1 溶菌酶DSC熱譜圖

        用Nano DSC標準積分軟件計算出的溶菌酶熔融中點溫度和融化焓列于表1.

        表1 重復實驗下溶菌酶的熔融中點溫度和融化焓

        根據(jù)ASTM E 2603-08[11],溶菌酶的熱力學標準參數(shù)列于表2.且由實驗結果可以看出三次校準實驗重復性較好.對比實驗結果和標準值可以認為誤差校準后測量精度已達到標準.

        表2 溶菌酶標準熱力學數(shù)據(jù)

        2.2 ILPR G-四鏈體試驗結果

        圖2所示為ILPR G-四鏈體在40~110℃溫區(qū)范圍的DSC熱譜圖曲線.如圖所示,ILPR G-四鏈體的熔融轉變分別在67.63℃和96.2℃,這表明ILPR G-四鏈體的去折疊熔融過程不是一個簡單的兩態(tài)轉變過程.在低熔融溫度下,第一次構象轉變融程長且溫區(qū)跨度大.在高熔融溫度下,第二次構象轉變峰形變窄,轉變迅速.

        圖2 ILPR G-四鏈體DSC熱譜圖

        已有研究從光譜的角度分析了ILPR G-四鏈體的構象.Paramasivan S[12]和Kypr J[13]曾利用圓二色光譜法對G-四鏈體的特征結構CD譜圖作出總結,研究認為G-四鏈體的平行構象在260~265 nm處出現(xiàn)正Cotton效應、240 nm處出現(xiàn)負Cotton效應;而反平行構象則在295nm處出現(xiàn)正Cotton效應、260 nm處出現(xiàn)Cotton效應.對ILPR G-四鏈體,Dhakal S[14]、Christine M[10]、Schonhoft J D[7]等人經CD熔融實驗表明該G-四鏈體在265、295 nm出現(xiàn)明顯正Cotton效應,如圖3所示.這說明了ILPR G-四鏈體可能是平行構象和反平行構象的混合.

        圖3 ILPR G-四鏈體 CD光譜圖

        在本研究中,可以從比熱的角度分析G-四鏈體可能的結構微觀變化.Liphardt J[15]研究表明,在反平行構象中,G四分體之間鳥嘌呤G形成的環(huán)形相連的連續(xù)結構十分穩(wěn)定,反平行構象解鏈的破裂力高.在圖2中,在較低熔融溫度下,第一次構象轉變峰值處比熱為0.465 J/mol·℃.在較高熔融溫度下,第二次構象轉變峰值處比熱為6.054 J/mol·℃.這說明第二次構象轉變吸熱更多,且需要在溫區(qū)跨度為86~105℃的較高溫度下進行,相比較第一次構象轉變處平緩的吸熱解鏈情況,推斷這是由于反平行構象穩(wěn)定、解鏈所需能量大導致.高溫熔融源自于反平行構象轉變,低溫熔融對應平行構象轉變.兩個熔融峰分離十分明顯,說明這兩種構象轉變過程可能是相對獨立的.

        在圖4中,通過TA Analysis軟件模擬,基線校正后的G-四鏈體摩爾比熱隨溫度變化曲線的去卷積處理可以很好地把原始實驗曲線處理成兩個分立組分的疊加,以此來分離這兩個相對獨立的構象轉變過程.

        圖4 DSC熱譜圖去卷積模擬

        為了準確表達比熱數(shù)據(jù),計算每個轉變過程中的熔融焓,研究中采用了高斯函數(shù)對比熱實驗數(shù)據(jù)進行擬合:

        (1)

        式(1)中的各擬合參數(shù)沒有物理意義,僅作比熱實驗數(shù)據(jù)擬合.所有的擬合參數(shù)(A0、A1、A2、A3)和擬合數(shù)據(jù)與實驗數(shù)據(jù)的均方根偏差(RMS)列于表3.

        由此計算出來G-四鏈體熔融溫度和融化焓列于表4.

        所有ILPR G-四鏈體在40~110℃的摩爾比熱實驗值(以0.5℃為間隔)列于表5.

        表3 比熱擬合系數(shù)

        表4 ILPR G-四鏈體熔融溫度和融化焓

        表5 ILPR G-四鏈體摩爾比熱

        2.3 紫外可見吸收光譜實驗結果

        對ILPR序列,其摩爾吸光系數(shù)ε=283 900 L/(mol·cm),分子量為8.911 8 kD.吸光度A在波長190~350 nm之間的變化曲線如圖5所示.在260 nm 處G-四鏈體溶液吸光度為4.068.由朗伯-比耳定律得:

        A=εbc

        其中,A為吸光度;ε為摩爾吸光系數(shù);b為液池厚度;c為溶液濃度.

        圖5 ILPR G-四鏈體紫外可見吸收光譜圖

        由此計算得退火后的G-四鏈體溶液濃度為14.33 μmol/L.

        3 結論

        通過Nano DSC法進行ILPR序列退火處理,并通過紫外光譜測試得到退火后的ILPR G-四鏈體濃度.在3 atm壓力下,40~110℃溫區(qū)準確測量了ILPR G-四鏈體在K+溶液中的等壓比熱,并通過去卷積擬合數(shù)據(jù)分離兩個結構的變化過程,分別得到熔融中點溫度為(67.63±0.16)℃和(96.2±0.01)℃;融化焓為(170.9±2.1)kJ/mol 主(392.0±1.6)kJ/mol.

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