于 穎，牟星禹，陸 萌，羅 瑤，劉詩堯，楊玉婷，汪 紅，樊 佳

(四川大學 生命科學學院，四川 成都 610065)

20世紀60年代，Stolp和Petiold首次分離得到了蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)[1]。它廣泛分布于自然水域、污水和土壤中，是一類專門以捕食細菌為生的寄生性細菌，可以有效裂解水體中的一些病原菌[2-3]，同時還可以緩解水體中一些有害物質的影響[4]，并且對魚類致病菌有明顯的裂解作用[5-7]，因此可利用該特性來防止水產動物的病害，其微生物生態(tài)制劑在水產養(yǎng)殖方面也發(fā)揮了較大的作用[8-9]。

噬菌蛭弧菌是一類可以寄生于其他細菌并使其裂解的革蘭氏陰性細菌，因此，在半固體和固體介質中蛭弧菌侵噬宿主菌后會形成類似于病毒感染細胞后形成的空斑。利用這一特性，在教學中已成功開設了蛭弧菌菌斑觀察實驗[10]及蛭弧菌對污水凈化實驗[11]。通過上述實驗，學生可以更加直觀地了解到蛭弧菌特有的生物學特性。為了進一步探究蛭弧菌“活抗生素”的可行性，并使學生進一步了解蛭弧菌的特性，菌種保藏方法就顯得極為重要。通常實驗室采取4℃平板保藏法來保藏菌種[12]，該方法不但操作簡單，且復活率達到100%，但是這種方法一般只能保藏4個月左右，4個月后培養(yǎng)基就會嚴重脫水變干，需要不斷活化轉種來保持它的生物學活性。因此該方法耗時繁瑣不適合長期保存。為了方便實驗教學，找到一種既可以延長蛭弧菌保藏時間又較為簡便的方法尤為重要。而關于蛭弧菌的保藏方法，國內外的研究比較少，且各實驗室報道結果各異。1963年文獻[13]提出了在含有宿主細胞的YP瓊脂中保藏蛭弧菌，每月轉種一次的培養(yǎng)方法。2002年文獻[12]為了探究蛭弧菌在水產養(yǎng)殖方面的作用，曾利用蛭弧菌Bd-9進行了5種保藏方法及其存活效果的觀察實驗，其結論為冷凍干燥法保藏效果最好，21個月的復活率高達100%，其次為4℃營養(yǎng)肉湯液保藏法和-20℃甘油保藏法，17個月復活率均為67%。2008年文獻[14]發(fā)現以1/100 NB等低營養(yǎng)液體為保護液，瓊脂為載體，加入適量宿主菌后保存于4℃，蛭弧菌保藏可達兩年以上。而在國際上，公認的長時高效的保藏蛭弧菌菌株的方法有冷凍真空干燥法和液態(tài)氮超低溫兩種。這兩種方法雖然有效，但其操作繁瑣，成本高昂。其他一些簡單易行的方法，如自來水宿主軟瓊脂保藏蛭弧菌培養(yǎng)物方法，雖然簡單，但保藏時間較短且效果差[15]，不符合實驗室教學時長期使用蛭弧菌的需求。因此為了尋找一種更為簡單高效并適合實驗室教學用的保藏方法，本文采用了-80℃甘油保藏法、4℃平板保藏法和4℃甘油保藏法這三種方法對實驗室培養(yǎng)的蛭弧菌進行保藏處理，并篩選出最佳保藏方法為-80℃甘油保藏法。該方法的建立不僅簡單快捷，而且降低了實驗成本，同時也為繼續(xù)開展蛭弧菌相關實驗奠定了基礎。

1 實驗材料

1.1 試驗菌種

本文蛭弧菌由四川大學微生物實驗室提供；宿主菌為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，為本課題組保存菌種。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

宿主菌培養(yǎng)基為液體LB培養(yǎng)基。蛭弧菌培養(yǎng)基為雙層培養(yǎng)基，上層為0.4%瓊脂LB半固體培養(yǎng)基，下層為2%瓊脂培養(yǎng)基，具體配置方法見文獻[11]。

1.3 主要儀器及試劑

GR85DA全自動滅菌鍋購自Zeaway，1300系列-A2生物安全柜購自美國Thermo，SHP-080生化培養(yǎng)箱購自上海精宏，Micro-17離心機購自美國Thermo。甘油由市面上購買所得，121℃滅菌20 min；生理鹽水(0.85%)121℃滅菌20 min。

2 實驗方法

2.1 制備宿主菌菌懸液

勾取斜面培養(yǎng)基上的大腸桿菌菌體至液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，置于4℃冰箱中備用。

2.2 蛭弧菌純液的制備

取已長有較大蛭弧菌單斑的雙層平板，按無菌操作要求，用火焰滅菌的接種環(huán)挑取蛭弧菌單斑浸泡于裝有1 mL滅菌生理鹽水的EP管中，搗碎混勻后10 000 g離心10 min，用無菌注射器吸取上清液，再用0.22 μm的細菌過濾器去除大腸桿菌，以獲得純的蛭弧菌菌液。

2.3 蛭弧菌的保藏方法

2.3.1 4℃平板保藏法

將稱裝有3.5 mL已加熱融化的上層半固體LB培養(yǎng)基冷卻至約50℃，依次加入0.2 mL大腸桿菌菌懸液和0.3 mL蛭弧菌菌懸液，震蕩混勻后立即傾倒于預制好的下層培養(yǎng)基上，待其凝固后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中擴增培養(yǎng)24～120 h，觀察培養(yǎng)皿中菌斑的生長情況。待長出較多的蛭弧菌菌斑后用封口膜密封好皿口，將培養(yǎng)皿倒置于4℃的冰箱中保藏。

2.3.2 4℃甘油保藏法

雙層平板法培養(yǎng)蛭弧菌方法同2.3.1節(jié)。當觀察到有大量蛭弧菌菌斑出現后，向其中加入10 mL已滅菌的甘油，并用封口膜將培養(yǎng)基密封好后置于4℃的冰箱中保藏。

2.3.3 -80℃甘油保藏法

蛭弧菌純液的制備方法同2.2節(jié)。將菌液與甘油以4∶1的比例加入10 mL的滅菌管中，在振蕩器上充分搖勻后，用封口膜密封管口。先將混合液置于-20℃的冰箱中預冷24 h，然后放入-80℃的冰箱中保藏。

2.4 蛭弧菌的復蘇實驗

取以上3種方法保藏的菌種定期進行復蘇實驗，觀察保藏效果。蛭弧菌的復活方法為雙層平板培養(yǎng)法。對4℃平板法保藏的蛭弧菌來說，先將雙層平板的上層刮到滅菌的生理鹽水中，并將培養(yǎng)基盡量搗碎，然后置于37℃下放置30 min，讓更多的蛭弧菌游離出培養(yǎng)基。按2.2節(jié)方法，得到純的蛭弧菌菌懸液。再按2.3.1節(jié)方法制成蛭弧菌雙層平板，并分別在第1～第5天觀察平板上菌斑的形成情況。對于4℃甘油平板保藏法所保藏的菌種，應先將培養(yǎng)基中的甘油倒掉后再制成菌液，再按上述方法進行試驗。對于-80℃甘油保藏的菌液，待其恢復室溫后便可直接使用，按上述方法制作雙層平板以供觀察。實驗結果出現至少兩個蛭弧菌菌斑為陽性，少于兩個為陰性。

3 結果與分析

我們對三種不同方法保存的蛭弧菌定期進行復蘇實驗以檢測菌種活性，并做統(tǒng)計。如圖1所示，3種保藏方法復蘇后的蛭弧菌均可形成噬菌斑。

(a)4℃平板保藏2個月 (b)4℃甘油保藏12個月板保藏方法時蛭弧菌可(c)-80℃甘油保藏18個月

圖1 三種保藏方法比較

統(tǒng)計結果如表1所示。從表1中可以看到，采用4℃平板保藏方法時蛭弧菌可保存1～2個月；4℃甘油保藏法可保藏11～12個月；效果最好的是-80℃甘油保藏法，連續(xù)保藏18個月后，蛭弧菌仍保持較高的活性。

表1蛭弧菌不同保藏方法的活性鑒定結果

時間/月4℃平板保藏法4℃甘油保藏法-80℃甘油保藏法1+++2+++3-++4-++5++6++7++8++9++10++11++12-+

(續(xù)表)

時間/月4℃平板保藏法4℃甘油保藏法-80℃甘油保藏法13-+14+15+16+17+18+

注：+表示蛭弧菌檢測結果為陽性；-表示蛭弧菌檢測結果為陰性

4 結束語

蛭弧菌是一類可以通過細菌濾器并寄生于多種有害細菌并導致其裂解的革蘭氏陰性細菌[16]，有望成為“活抗菌素”[17-18]，因此也被認為是自然凈化的生物因子之一?；隍位【倪@些獨特的生物學特性，四川大學生物科學實驗教學中心開設了一系列關于蛭弧菌的創(chuàng)新實驗——用雙層平板法培養(yǎng)蛭弧菌[10]、用平板菌落計數法驗證蛭弧菌對污水的凈化效果[11]和用相差顯微鏡觀察蛭弧菌形態(tài)和運動[19]。上述創(chuàng)新實驗均獲得了較好的課堂效果和反饋，但在實際教學過程中由于蛭弧菌保存方法有限，蛭弧菌長時間保藏是一個難題。因此開發(fā)一種既能長期保存又成本低廉操作簡單的菌種保存方法就成了當務之急。

本文使用同一種蛭弧菌及同一種宿主菌，對蛭弧菌的3種保藏方法進行了比較。結果發(fā)現-80℃甘油保藏法保藏時間可長達18個月，復蘇后不僅第一代活性較高，而且第二代和第三代活性仍然較好。該方法不僅需要的儀器設備簡單，操作步驟十分簡便，而且不需要頻繁接種。因此，該方法非常適合于基礎實驗教學中使用，為本實驗教學中心繼續(xù)開設蛭弧菌相關實驗奠定了基礎。

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