樊雪梅，容松

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

腎移植術(shù)是治療腎功能衰竭的重要方法。但移植后仍面臨著與腎缺血再灌注損傷(RIRI)相關(guān)的術(shù)后感染、腎功能恢復(fù)延遲、移植腎失功能等難題，對短期和長期移植結(jié)果有重要影響[1,2]。巨噬細(xì)胞是極具異質(zhì)性和可塑性的免疫細(xì)胞之一，研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞與RIRI密切相關(guān)，在RIRI過程中發(fā)揮抗炎和促炎的雙重作用。多種無菌缺血性腎損傷模型實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，巨噬細(xì)胞參與了RIRI過程的所有階段，包括初始損傷、后續(xù)修復(fù)及晚期纖維化。我們以巨噬細(xì)胞為切入點(diǎn)，對其表型轉(zhuǎn)換及其參與RIRI機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 巨噬細(xì)胞的起源和異質(zhì)性

巨噬細(xì)胞在固有免疫、惡性腫瘤、代謝和繁殖等系統(tǒng)起關(guān)鍵作用，并以浸潤巨噬細(xì)胞及組織固有巨噬細(xì)胞兩種形式存在于體內(nèi)[1]。前者由骨髓來源的未成熟單核細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)后移行至各組織分化而來，后者則廣泛分布于全身各組織，因定居組織不同而命名不同，如分布在肝臟者稱為Kupffer細(xì)胞，分布在皮膚者稱為Langerhans細(xì)胞，分布在大腦者稱為小膠質(zhì)細(xì)胞。目前認(rèn)為固有巨噬細(xì)胞有三種來源，由血液中造血前體細(xì)胞在組織局部分化而來[2]、源于卵黃囊[3]及源于胎肝組織[4]。自發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞以來，探索其在各種病理機(jī)制中發(fā)揮何種作用一度成為研究熱點(diǎn)。大量研究已證實(shí)，巨噬細(xì)胞具有可塑性和異質(zhì)性[5]，被作為單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞譜系的標(biāo)志。巨噬細(xì)胞具有多樣性轉(zhuǎn)錄譜，可極化為不同亞型以響應(yīng)微環(huán)境的動態(tài)變化，從而發(fā)揮不同的功能。

2 巨噬細(xì)胞的分型、表型轉(zhuǎn)換及功能

目前多數(shù)文獻(xiàn)將巨噬細(xì)胞分為M1、M2兩類亞型：經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(M1)和替代活化的巨噬細(xì)胞(M2)。巨噬細(xì)胞在干擾素(IFN)、Toll樣受體等信號刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，極化為M1，在IL-4、IL-13等信號刺激下極化為M2，二者的平衡狀態(tài)與腎臟微環(huán)境相關(guān)，可能與巨噬細(xì)胞源性轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、刺激精氨酸酶(Arg)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活(STAT)、NF-κB等信號通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。然而，有學(xué)者提出M1/M2分型方法并不嚴(yán)謹(jǐn)，M1、M2是巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境因素刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)換這一動態(tài)過程的兩個(gè)極端，該分型方法并不能反映該過程的真實(shí)性。

多項(xiàng)研究表明巨噬細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換是復(fù)雜連續(xù)的過程，并非直接由M1轉(zhuǎn)變到M2。如：M2三種附加亞型的研究(М2a由IL-4、IL-13等誘導(dǎo)，發(fā)揮組織修復(fù)作用；M2b由免疫復(fù)合物等誘導(dǎo)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；M2c由IL-10、TGF-β等誘導(dǎo)，發(fā)揮抗炎作用)；Mantovani等[6]認(rèn)為M2樣巨噬細(xì)胞具有M2的部分表型特征而非全部特征；Malyshev等[7]提出體內(nèi)尚不存在純粹的只表達(dá)M1或M2表面標(biāo)記物的巨噬細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞除M1、M2表型外，還存在新的表型——M3轉(zhuǎn)換表型[7]。可見，巨噬細(xì)胞的具體分型、表型轉(zhuǎn)換等仍需更深入的研究。但目前廣泛使用的是M1/M2分型方法，因其簡化了巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的復(fù)雜性，便于研究中的描述。

M1、M2的表面標(biāo)記物也尚未統(tǒng)一。TLR-4、MARCO受體、CD25、CD80可作為M1的表型特征，甘露糖受體、CD163、CD209等可作為M2的表型特征。Sun等[8]報(bào)道CD16、IL-1R、IL-12等可為M1的表面標(biāo)記，通過釋放IL-6、TNF-α、IL-1、ROS、iNOS、等炎性細(xì)胞因子及CXCL5、CXCL9等趨化因子以招募其他免疫細(xì)胞，發(fā)揮促炎作用；IL-1R(M2a)、CD86(M2b)、CD150、CD163(M2c)可為M2各類附加亞型的表面標(biāo)記，釋放IL-10、IL-12、TGF-β、Arg-1等因子，發(fā)揮抗炎、修復(fù)、促纖維化等作用。李康等[9]認(rèn)為，iNOS、IL-12、CDl6/32可用于鑒定M1；Arg-1、CD206、Dectin-1可用于鑒定M2。探究巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物，以鑒定巨噬細(xì)胞亞型是研究其在病理過程中發(fā)揮何種功能的重中之重。

關(guān)于M1、M2功能的研究已取得一定成果。Gordon等[10]認(rèn)為，M1可清除入侵微生物及腫瘤細(xì)胞并促進(jìn)Ⅰ型免疫反應(yīng)，參與初始炎癥反應(yīng)；M2則主要參與碎片清除、血管生成、組織重塑及傷口愈合并促進(jìn)Ⅱ型免疫反應(yīng)，在炎癥后期發(fā)揮重要作用。簡言之，M1在組織損傷中發(fā)揮促炎作用，M2則參與抗炎、組織修復(fù)及纖維化。

3 巨噬細(xì)胞在RIRI中的作用

3.1 巨噬細(xì)胞促進(jìn)RIRI的炎癥反應(yīng) RIRI動物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，受損腎小管和內(nèi)皮細(xì)胞可分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、IL-6和IL-8等趨化因子及炎性細(xì)胞因子，引導(dǎo)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等向腎間質(zhì)快速浸潤[11]。巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞通過其模式識別受體，識別病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)，以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。RIRI發(fā)生時(shí)，缺血受損的腎組織釋放大量DAMPs[12]，如高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、熱休克蛋白(HSPs)等，這些DAMPs與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合(如Toll樣受體TLRs)，激活巨噬細(xì)胞，引發(fā)非感染性炎癥，促進(jìn)腎組織損傷[2,13]，此期促炎性巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位，腎小管細(xì)胞凋亡顯著。Mulay等[14]認(rèn)為炎癥與腎臟損傷在自動放大循環(huán)中相互增強(qiáng)，細(xì)胞損傷釋放DAMP等可通過TLRs激活浸潤單核細(xì)胞為促炎表型，浸潤活化的促炎性巨噬細(xì)胞又進(jìn)一步分泌多種促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致壞死性炎癥，而抑制這類巨噬細(xì)胞可減輕甚至阻止受損腎免疫病理學(xué)的進(jìn)展。

RIRI發(fā)生后，巨噬細(xì)胞是嚙齒類動物腎小管周圍聚集的主要細(xì)胞類型之一。研究發(fā)現(xiàn)，使用脂質(zhì)體氯膦酸鹽(LC)使巨噬細(xì)胞減少或缺失，可減輕腎形態(tài)學(xué)損傷及減少尿素氮和肌酐的增加，抑制細(xì)胞因子、預(yù)防或消耗巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞歸巢，可降低模型形態(tài)和功能的損傷。損傷腎中的巨噬細(xì)胞經(jīng)歷從M1到M2表型轉(zhuǎn)換的動態(tài)變化。M1產(chǎn)生活性氧、氮中間體等效應(yīng)分子，IL-1β、TNF、IL-6、IL-12等炎性因子及MCP-1、CCL2、CXCL10、CXCL11等趨化因子促進(jìn)組織損傷，同時(shí)還高表達(dá)iNOS，以分解L-精氨酸為瓜氨酸和NO，NO的大量聚集可致組織損傷[15,16]。Inoue等[17]新近的研究認(rèn)為，M1表達(dá)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的C型凝集素(Mincle)可介導(dǎo)腎急性期損傷，Mincle的表達(dá)受TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)，它通過酪氨酸激酶(Syk)/ NF-κB信號通路維持M1的炎性表型，促進(jìn)iNOS、MCP-1、TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致腎損傷，而抑制Mincle的表達(dá)則有腎保護(hù)作用。因此，控制RIRI中M1介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，可為移植腎存活提供良好的微環(huán)境，是腎移植領(lǐng)域值得努力的方向。

3.2 巨噬細(xì)胞參與RIRI的修復(fù) RIRI時(shí)腎小管受損，管狀細(xì)胞顯著增殖，修復(fù)過程即啟動，于第3天達(dá)峰值，隨后1周內(nèi)緩慢下降。在此修復(fù)期研究中發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞經(jīng)歷了表型變化并發(fā)揮著保護(hù)和修復(fù)作用。Lin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞缺乏時(shí)腎上皮細(xì)胞中典型的Wnt通路反應(yīng)減少，腎修復(fù)大大減弱；使用Wnt途徑調(diào)節(jié)劑后修復(fù)增強(qiáng)，表明巨噬細(xì)胞源性Wnt7b(Wnt通路配體)在修復(fù)和刺激腎上皮細(xì)胞再生中起重要作用，印證了巨噬細(xì)胞參與受損腎的修復(fù)過程。進(jìn)一步追蹤熒光標(biāo)記的促炎性M1實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，修復(fù)期腎中的 M1可轉(zhuǎn)換為M2，巨噬細(xì)胞經(jīng)歷了促小管炎癥損傷到支持小管修復(fù)的表型轉(zhuǎn)換。相似地，Cao等[19]認(rèn)為 RIRI后M2可刺激腎小管上皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞增生，這可能與M2抑制M1、減少促炎因子及iNOS的產(chǎn)生有關(guān)。M2還可表達(dá)高水平Arg-1、甘露糖受體(MR)及IL-10等[20,21]，Arg可與 iNOS競爭性結(jié)合同一底物L(fēng)-精氨酸，將其裂解為脯氨酸和多胺，促進(jìn)細(xì)胞分裂和膠原形成，從而發(fā)揮其促修復(fù)作用，另外，多胺又可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2轉(zhuǎn)換，進(jìn)一步對損傷組織進(jìn)行修復(fù)和重塑。IL-10是公認(rèn)的內(nèi)源性抗炎因子代表之一，主要來源于巨噬細(xì)胞和Th細(xì)胞，也可以由損傷腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，一定濃度的IL-10可抑制 MCP-1、IL-2、INF-γ、IL-8、IL-1、TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生，發(fā)揮其抗炎促修復(fù)作用[22]。在RIRI修復(fù)期，用LC敲除小鼠巨噬細(xì)胞后可使小鼠腎損傷加重，表明此期的巨噬細(xì)胞發(fā)揮腎臟保護(hù)作用與其高表達(dá)IL-10及抑制TNF-α分泌有關(guān)[23]。此外，Huen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，體巨噬細(xì)胞修復(fù)表型的激活機(jī)制與腎近端小管細(xì)胞分泌的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF，一種STAT5的激活劑)上調(diào)相關(guān)，GM-CSF受到STAT5通路的調(diào)節(jié)，而體內(nèi)、體外GM-CSF功能的阻斷性實(shí)驗(yàn)也證實(shí)該阻斷可減弱巨噬細(xì)胞的替代激活，導(dǎo)致修復(fù)期腎小管細(xì)胞增殖減少。盡管巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腎臟修復(fù)的具體機(jī)制仍在爭論中，但隨著研究的不斷深入，已確定可增加有益因子的釋放、阻斷損傷表型激活通路、促進(jìn)修復(fù)表型激活通路、控制炎性環(huán)境、保持M2表型穩(wěn)定等，因此以M2為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法仍然值得期待。

3.3 巨噬細(xì)胞參與RIRI后的纖維化 持續(xù)的炎癥反應(yīng)是RIRI后慢性腎臟疾病發(fā)生的重要原因，包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種炎癥細(xì)胞、炎癥因子參與受損腎組織的纖維化。通過抗巨噬細(xì)胞血清或LC消除巨噬細(xì)胞可減少持續(xù)性炎癥及隨后的纖維化發(fā)展。實(shí)驗(yàn)研究表明，巨噬細(xì)胞可刺激和釋放TGF-β1、MCP-1、血小板源生長因子(PDGF)、IL-l等促纖維化因子，這些因子不僅可誘導(dǎo)腎臟某些固有細(xì)胞(如腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等)活化為成肌纖維細(xì)胞(可合成細(xì)胞外基質(zhì)而促進(jìn)腎臟纖維化)，還可抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，加快腎纖維化[25]。TGF-β1是腎纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子及公認(rèn)的腎纖維化指標(biāo)之一，不僅可誘導(dǎo)成肌纖維細(xì)胞通過Smad 信號通路促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成，還能通過減少基質(zhì)金屬蛋白酶等促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，進(jìn)一步加重纖維化進(jìn)展。此外，TGF-β1還可直接促進(jìn)膠原的合成。巨噬細(xì)胞在一定刺激下(如LPS、IL-1、IFN-γ、某些病毒)高表達(dá)MCP-1，MCP-1又可直接趨化巨噬細(xì)胞進(jìn)入受損組織，該相互作用導(dǎo)致二者在組織大量聚集和累積，使腎臟炎癥持續(xù)。持續(xù)的M2浸潤可能導(dǎo)致某些傷口愈合生長因子的持續(xù)產(chǎn)生，最初的組織修復(fù)機(jī)制可能進(jìn)展為有害的纖維化。因此巨噬細(xì)胞也被認(rèn)為是導(dǎo)致腎纖維化的重要因素，控制巨噬細(xì)胞活化和浸潤能預(yù)防RIRI后腎纖維化的發(fā)展。

4 巨噬細(xì)胞在RIRI中的研究方向

巨噬細(xì)胞具有可塑性、異質(zhì)性，廣義上根據(jù)不同微環(huán)境刺激情況被分為經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型，分別在組織損傷中發(fā)揮促炎和抗炎及促纖維化作用。但目前根據(jù)刺激物不同，對巨噬細(xì)胞亞型進(jìn)行分類的方法值得我們深思：活體微環(huán)境中通常有多種刺激因子同時(shí)存在，共同影響著巨噬細(xì)胞，此時(shí)巨噬細(xì)胞會向哪一種表型轉(zhuǎn)換？此時(shí)仍根據(jù)刺激因子類型來區(qū)分巨噬細(xì)胞亞型及M2附加亞型是否合理？可見，對巨噬細(xì)胞分型及表型轉(zhuǎn)換的研究仍任重道遠(yuǎn)。不論巨噬細(xì)胞如何分型、如何發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，其在病理過程中發(fā)揮損傷與修復(fù)的雙向作用是明確的，這使我們對以巨噬細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法有了信心，進(jìn)一步研究誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向有益表型轉(zhuǎn)換并使之保持穩(wěn)定，調(diào)控甚至阻斷其向有害表型轉(zhuǎn)換，這也是以巨噬細(xì)胞為基礎(chǔ)的、更好地提高臨床器官移植成功率、存活率的研究方向。目前的研究已證實(shí)，巨噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)換為M2修復(fù)表型，這些成果使輸注M2及其相關(guān)因子用于治療腎臟疾病的方法成為可能，且已有諸多動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)輸注M2a、M2c等細(xì)胞對動物模型的治療作用。

但我們也面臨著挑戰(zhàn)，例如巨噬細(xì)胞的許多中間表型可能共存于同一組織中，對其極化和不同表型功能機(jī)制的研究尚不透徹，如何在保證誘導(dǎo)修復(fù)表型的同時(shí)，阻斷其他有害表型的極化尚不明確；修復(fù)表型的引入是否會帶來組織細(xì)胞惡性增殖的威脅及過度修復(fù)以致纖維化尚不明確；人類RIRI的治療中，如何得到純合且表型保持穩(wěn)定的M2，同時(shí)如何把握輸注時(shí)機(jī)、劑量尚不明確。因此，在缺乏關(guān)于人類巨噬細(xì)胞類型及其可塑性、功能型的研究背景下，基于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞療法在用于人類之前仍需大量臨床研究的支持。