茅汝佳，高 燕

(上海植物園 上海城市植物資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，上海 200231)

壽為百合科瓦葦屬(Haworthia)多年生草本植物[1]，原產(chǎn)于南非。大多數(shù)壽葉片呈蓮座狀緊密排列，有線(xiàn)狀脈紋[2]。巴迪亞壽(Haworthiamirabilisvar. badia)是近些年雜交出的新的園藝品種，屬于硬葉類(lèi)植株，葉緣有白色小刺，葉表面有白色條紋，呈現(xiàn)透明或半透明的窗[3]，松散總狀花序，白色小花。由于其外形可愛(ài)、生長(zhǎng)緩慢，備受園藝工作者和花卉愛(ài)好者的喜愛(ài)。

瓦葦屬植物很多品種自交不親和[4]。目前市面上的大多為分株繁殖和葉插繁殖，這類(lèi)方法都存在繁殖速度慢、繁殖系數(shù)低、生長(zhǎng)速度慢等問(wèn)題，而采用組織培養(yǎng)的方法可以很好地解決。近些年，同屬部分多肉品種組培獲得成功，目前有康平壽[5]、截型十二卷[6]、克里克特壽[7]、冰沙糖壽[8]等多肉品種組織培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)于2015—2016年在上海植物園科研中心實(shí)施。巴迪亞壽取自上海植物園多肉館，如圖1。在幼嫩花序抽長(zhǎng)并且花蕾尚未展開(kāi)時(shí)，截取整個(gè)花莖部位作為起始材料。

圖1 巴迪亞壽幼嫩花序

1.2 方法

取巴迪亞壽幼嫩花序部位，去除閉合花蕾的外苞片，將花蕾連同花柄逐個(gè)分離，放置玻璃瓶中，紗布封口?；ㄐ虿课幌扔孟礉嵕芤航?0 min，后在流水下沖洗2 h。準(zhǔn)備酒精燈、75%乙醇、2%次氯酸鈉溶液、0.1%升汞溶液。提前滅菌以下材料：玻璃瓶裝ddH2O、封口100 mL三角瓶、紗布、鑷子、手術(shù)刀、濾紙。

1.2.1 滅菌

以下工作均在超凈工作臺(tái)中完成：外植體放置于無(wú)菌三角瓶中，用無(wú)菌水沖洗2次后，75%乙醇振蕩清洗30 s，再用無(wú)菌水沖洗2次。隨后用2%次氯酸鈉溶液和0.1%升汞溶液兩種消毒液對(duì)外植體消毒，再用無(wú)菌水沖洗6次后，濾紙吸干水分，放置于培養(yǎng)基上。消毒液和消毒時(shí)間的差異對(duì)外植體誘導(dǎo)有不同的影響，根據(jù)誘導(dǎo)階段出芽的差異確定最佳消毒辦法。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)

利用MS為基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基，添加不同濃度的激素。激素采用細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA形成不同組合，6-BA的濃度范圍為0～2 mg·L-1，NAA的濃度范圍為0～0.2 mg·L-1。根據(jù)誘導(dǎo)結(jié)果確定最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

利用MS為基本培養(yǎng)基，添加不同激素，配置增殖培養(yǎng)基。激素采用細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA形成不同組合，6-BA的濃度范圍為0～2 mg·L-1，NAA的濃度范圍為0～0.04 mg·L-1。根據(jù)增殖階段植物的生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖率確定最佳增殖培養(yǎng)基。

1.2.4 生根培養(yǎng)

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度激素，激素分別采用IAA、IBA、NAA 3種，濃度范圍為0～1 mg·L-1，配置成不同的生根培養(yǎng)基。根據(jù)苗生長(zhǎng)狀態(tài)、根生長(zhǎng)狀態(tài)、生根率和根長(zhǎng)等確定最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.5 馴化移植

組培生根后，在自然光照下培養(yǎng)1周，揭開(kāi)瓶蓋放置3 d。取出組培苗放置水盆中，清洗附著在苗上的培養(yǎng)基。將清洗過(guò)的組培苗放置陰干一周后，整理根并種植于穴盤(pán)中。

1.2.6 育苗培養(yǎng)

組培苗在馴化移植成功后，從穴盤(pán)轉(zhuǎn)至營(yíng)養(yǎng)缽中?；|(zhì)仍然采用草炭∶火山石∶鹿沼土∶赤玉為3∶1∶1∶2(V∶V)。室內(nèi)溫度保持20 ℃左右，濕度85%，每1個(gè)月澆水使用多菌靈溶液起到殺菌的功效。如有條件，可以每月施加薄肥一次。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌方法的篩選

滅菌材料為壽幼嫩花序，每1.0～1.5 cm截取成一小段，分離單個(gè)未展開(kāi)花蕾，去除苞片。在經(jīng)過(guò)初步洗潔精和流水浸泡沖洗后，先用75%乙醇浸泡30 s，清水沖洗2次，再?lài)L試2種滅菌液滅菌，分別為2%次氯酸鈉溶液和0.1%升汞溶液。由于兩種滅菌液的滅菌效率不同，對(duì)外植體的傷害也不同，選取適合的滅菌時(shí)間尤為重要。實(shí)驗(yàn)中，用2%次氯酸鈉溶液分別對(duì)外植體滅菌6、12和18 min，用0.1%升汞溶液分別對(duì)外植體滅菌5、8和11 min，獲得不同的污染率和出芽率。如表1所示，用2%次氯酸鈉溶液滅菌12 min時(shí)，相比較同滅菌液的另外兩個(gè)滅菌時(shí)間，出芽率最高為35%，此時(shí)對(duì)應(yīng)的污染率為12.5%。當(dāng)用2%次氯酸鈉溶液滅菌18 min時(shí)，污染率比12 min的滅菌時(shí)間更低，僅為2.5%，但是由于滅菌液對(duì)外植體的滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，出芽率降低為7.5%。與之對(duì)應(yīng)，采用0.1%升汞溶液作為滅菌液，滅菌8 min時(shí)，污染率為7.5%，此時(shí)的出芽率為75%，而滅菌時(shí)間達(dá)到11 min后，污染率為0，此時(shí)的出芽率降低為5%。綜合比較，以高出芽率和正常出芽形態(tài)為目的，用0.1%升汞溶液滅菌8 min為最佳的滅菌方法，此時(shí)污染率為7.5%，而出芽率達(dá)到75%。

表1 不同滅菌液和滅菌時(shí)間對(duì)巴迪亞壽誘導(dǎo) 脫菌的影響

2.2 誘導(dǎo)階段激素選擇

以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA和NAA兩種激素。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是組織培養(yǎng)誘導(dǎo)階段常使用的激素，適當(dāng)?shù)募に貪舛扰浔瓤梢源龠M(jìn)組織誘導(dǎo)。

滅菌后的起始材料接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基添加細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA。如表2所示，6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率最高為66.7%。此時(shí)，15 d左右可以出芽，生長(zhǎng)速度較快且芽體發(fā)育正常。不添加激素的基本培養(yǎng)基上未能誘導(dǎo)出芽，最后起始材料呈灰褐色。只添加了NAA的情況下，誘導(dǎo)情況不理想，僅在NAA 0.1 mg·L-1時(shí)，有少量芽出現(xiàn)，誘導(dǎo)率僅為6.7%，且芽生長(zhǎng)極為緩慢。當(dāng)6-BA 1 mg·L-1時(shí)，少量細(xì)弱的芽出現(xiàn)，且生長(zhǎng)較慢。6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.2 mg·L-1時(shí)，15 d左右誘導(dǎo)出芽，在此情況下誘導(dǎo)出的芽生長(zhǎng)較快且發(fā)育正常，此時(shí)誘導(dǎo)率為26.7%，基部有少量球形綠色愈傷形成。6-BA 2 mg·L-1時(shí)，芽的誘導(dǎo)率僅為13.3%，同時(shí)有少量綠色愈傷組織。當(dāng)6-BA 2 mg·L-1，而NAA的含量升高達(dá)到 0.2 mg·L-1時(shí)，芽開(kāi)始出現(xiàn)畸形的現(xiàn)象，芽體變形，芽膨大，玻璃化明顯，基部有愈傷。

表2 不同激素含量對(duì)壽誘導(dǎo)的影響

由此可以看出，6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1是最適合芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基組合，此時(shí)芽誘導(dǎo)率66.7%，沒(méi)有形成愈傷組織。

2.3 增殖階段激素選擇

經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)基接近1個(gè)月的培養(yǎng)，將誘導(dǎo)的芽轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基。如果芽基部有愈傷，撥除干凈再轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基。

表3看出，不同激素濃度對(duì)巴迪亞壽的芽增殖有不同的影響。當(dāng)不含6-BA時(shí)，增殖率較低，最高的只有1.85倍，苗伸長(zhǎng)倍率最高也僅為1.39倍，整體來(lái)說(shuō)略有生長(zhǎng)，但是生長(zhǎng)較弱。當(dāng)6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.02 mg·L-1時(shí)，芽的伸長(zhǎng)倍率為2.65倍，對(duì)應(yīng)的增殖倍率達(dá)到最大，為4.62倍，葉片生長(zhǎng)明顯，形成大量新芽。當(dāng)6-BA為2 mg·L-1時(shí)，芽的伸長(zhǎng)和增殖倍率都略有下降，葉片細(xì)長(zhǎng)，部分出現(xiàn)基部愈傷的現(xiàn)象。特別當(dāng)6-BA和NAA濃度較高的時(shí)候，芽膨大變形成為綠色半透明的畸形苗，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。圖2看出，在增殖培養(yǎng)基(6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.02 mg·L-1)上培養(yǎng)25 d，芽生長(zhǎng)健壯，沒(méi)有畸形和玻璃化的情況。

表3 不同激素含量對(duì)巴迪亞壽芽增殖的影響

2.4 生根培養(yǎng)

將增殖的芽分成單株取出轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基為1/2MS，添加IAA、IBA、NAA 3種激素，觀(guān)察壯苗結(jié)果和生根情況。

根據(jù)表4可以看出，3種不同激素對(duì)植株影響有較大差異。完全不添加激素的情況下，僅1/2MS培養(yǎng)基使植株略有生長(zhǎng)，但非常有限，植株整體基本沒(méi)有粗壯，沒(méi)有形成根。添加IBA后，苗上部分生長(zhǎng)正常(圖3)，但是無(wú)法形成或者僅少量形成根，IBA 0.5 mg·L-1時(shí)，根的長(zhǎng)度為0.5～1.0 cm。添加 NAA后，植株下端形成愈傷，且無(wú)法形成根。添加IAA 0.5 mg·L-1的情況下，植株粗壯，形態(tài)正常，部分生長(zhǎng)良好可以看到窗，且形成粗壯根，根平均數(shù)量6～10根，長(zhǎng)度2～7 cm。

表4 不同激素含量對(duì)巴迪亞壽壯苗和生根的影響

注：起始材料為莖段。

圖2 壽增殖培養(yǎng)25 d的植株

圖3 生根培養(yǎng)1個(gè)月后形成根

2.5 馴化移植

組培苗形成完整植株后，可以轉(zhuǎn)至穴盤(pán)煉苗。穴盤(pán)中裝入的基質(zhì)為草炭∶火山石∶鹿沼土∶赤玉為3∶1∶1∶2(V∶V)。種植組培苗于穴盤(pán)后，少量澆水，上方安置遮光網(wǎng)，放置于大棚內(nèi)，溫度20 ℃，濕度85%左右(圖4)。生長(zhǎng)2個(gè)月，壽成活率可達(dá)98%。從土中挖出根，可以看到根相比較前期伸長(zhǎng)明顯，且部分形成新根。

圖4 馴化移植3個(gè)月后的巴迪亞壽

2.6 育苗技術(shù)培養(yǎng)

巴迪亞壽喜歡涼爽通風(fēng)的半陰環(huán)境。在自然狀態(tài)下培養(yǎng)時(shí)，一般春、秋兩季養(yǎng)護(hù)較易，而高溫的夏季或者低于0 ℃的冬季，巴迪亞壽處于半休眠至休眠狀態(tài)，生長(zhǎng)緩慢或停止。養(yǎng)護(hù)時(shí)，要注意通風(fēng)、涼爽和干燥，可選擇適當(dāng)遮陰，避免烈日暴曬和長(zhǎng)期雨淋。巴迪亞壽喜歡空氣濕度略高的環(huán)境，但不可頻繁澆水或積水，防澇防浸泡。初期的小苗可以用帶蓋的育苗盤(pán)種植，用以保持空氣中的水分。但是夏季高溫時(shí)需要去除育苗盤(pán)的蓋子，防止植物因悶濕而死亡。

巴迪亞壽對(duì)光照較敏感。植株的生長(zhǎng)于光照有直接關(guān)系。光照過(guò)強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致葉片灼傷，而光照太弱會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)散漫不緊湊，并且“窗”透明度差。恰當(dāng)?shù)墓庹詹拍茏尠偷蟻唹塾型昝赖闹晷秃兔髁恋摹按啊薄?/p>

3 小結(jié)與討論

植物組織培養(yǎng)是植物快速繁殖最有效的辦法，相比較葉插、播種等方法有很多優(yōu)勢(shì)，例如繁殖速度快，繁殖系數(shù)大；繁殖后代整齊，遺傳性狀得以保持；可獲得脫毒苗等。植物組織培養(yǎng)需要選用適合的外植體，外植體可以從新生側(cè)芽、葉片、花序和種子等方面選擇。但因?yàn)樾卵堪l(fā)生部位在根部接近土壤處，難滅菌，葉片分生能力較差，后期分化也比較弱；種子為雜交產(chǎn)物，母體的優(yōu)良性狀難以保持，因此細(xì)胞分裂旺盛的花序是很好的起始材料[9]。花序經(jīng)過(guò)滅菌后可以作為誘導(dǎo)材料。次氯酸鈉利用分解的氯氣殺菌，毒性較小。升汞是一種劇毒物質(zhì)，利用其重金屬汞離子破壞微生物蛋白質(zhì)的方法殺菌。在本實(shí)驗(yàn)中，利用0.1%升汞振蕩滅菌8 min是比較適合的滅菌方法，污染率為7.5%，出芽率為75%。升汞滅菌后，需要用滅菌水多次振蕩沖洗，本實(shí)驗(yàn)中沖洗6次，盡可能漂洗升汞殘留物，減少升汞對(duì)外植體的傷害。

將滅菌的壽接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加了6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1，此組合可以獲得較高的誘導(dǎo)率，同時(shí)誘導(dǎo)出的芽體發(fā)育正常，沒(méi)有出現(xiàn)膨大或者玻璃化，可以保證后續(xù)過(guò)程中芽的正常發(fā)育。

分離芽體轉(zhuǎn)至適宜的增殖培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基添加6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.02 mg·L-1，可以保證芽體正常發(fā)育，沒(méi)有出現(xiàn)膨大或者玻璃化，另外也保證了巴迪亞壽的增殖率和伸長(zhǎng)率。在此培養(yǎng)條件下，伸長(zhǎng)率為2.65倍，增殖率為4.62倍，植株正常發(fā)育。

實(shí)驗(yàn)后期的生根過(guò)程中，分別添加3種激素對(duì)比后，發(fā)現(xiàn)1/2MS附加激素IAA 0.5 mg·L-1，組培苗生長(zhǎng)健壯，發(fā)育正常，沒(méi)有畸形和愈傷發(fā)生，并且可以形成粗壯根，每株平均6～10根，長(zhǎng)度2～7 cm。另外，每瓶種植少量苗可以促進(jìn)植株發(fā)育。實(shí)驗(yàn)中每瓶種植1～2棵明顯比種植4～6棵的粗壯。組培壯苗的過(guò)程可以促進(jìn)巴迪亞壽快速生長(zhǎng)，打破自然狀態(tài)下壽長(zhǎng)勢(shì)緩慢的特點(diǎn)。

常規(guī)多肉繁殖方法有分株繁殖、葉插繁殖和播種繁殖。分株和葉插兩種繁殖方法有很多相似的地方，例如取得健康植株上部或者肉質(zhì)葉后，放置在干燥的地方，涂抹多菌靈，防止傷口腐爛。在傷口晾干后，直接扦插入土，保持土壤濕潤(rùn)可以促進(jìn)基部生根、植株成活。本實(shí)驗(yàn)中嘗試生根苗種植和未生根苗瓶外生根兩種方法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中為防止植物長(zhǎng)菌，可以用稀釋的多菌靈浸泡10 min再晾干。未生根苗的生根方法與葉插法一致。在隨后兩個(gè)月的觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)，未生根苗的根可以在土中生長(zhǎng)出，但是生長(zhǎng)速度較慢，且根相比較已生根苗細(xì)軟。半年后觀(guān)察兩種苗，生根苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛，而未生根苗相比弱很多。因此，組培中生根的步驟值得保留。

馴化成功后，將生長(zhǎng)健壯的苗從營(yíng)養(yǎng)缽中轉(zhuǎn)至盆中生長(zhǎng)，但是夏季高溫的時(shí)候不適合巴迪亞壽的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)苗時(shí)，盆底放置5～6粒奧綠緩釋肥(意大利撒得盼化學(xué)公司Sadepan Chimicas.r.l)，再添加基質(zhì)草炭∶火山石∶鹿沼土∶赤玉為3∶1∶1∶2(V∶V)。通透性較好的基質(zhì)有助于根的健康生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)盆初期不加其他肥料，防止植物不耐受。轉(zhuǎn)盆兩個(gè)月后，每月噴施氮、磷、鉀有效養(yǎng)分各為20%的通用型花多多水溶速效肥，稀釋濃度為1%。生長(zhǎng)期澆水掌握不干不澆，澆則澆透的原則，避免積水，更不能淋雨，尤其不能長(zhǎng)期淋雨，以避免爛根，但也不宜長(zhǎng)期干旱，否則葉片干癟，葉色黯淡[10]。

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