高 燕，鐘素飛，奉樹成

(上海植物園 上海城市植物資源開發(fā)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，上海 200231)

微型月季(RosachinensisMinima或Rosaroelletti)為薔薇科多年生木本植物，株型矮小，整體植株不超過30 cm[1]。葉片和花朵嬌小，花朵直徑3 cm左右，色彩絢麗，單朵花期10 d左右，整株花期可達(dá)1個(gè)月，適應(yīng)性強(qiáng)，一年內(nèi)多次花芽分化，是一種優(yōu)良的園林綠化和盆栽材料[2]。微型月季因小巧玲瓏、花量大、不間斷開花、花色絢爛等原因備受人們喜愛。但因株型矮小、節(jié)數(shù)少，加之受種苗數(shù)量、季節(jié)等諸多因素的制約[3]，常規(guī)扦插和嫁接繁殖方法的繁殖系數(shù)低、繁殖速度慢、成本高[4]。為此，特開展微型月季組織培養(yǎng)體系研究，以提高育苗產(chǎn)量，降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2016—2017年在上海植物園進(jìn)行。材料取自上海植物園薔薇園。2016年3月初，取微型月季莖尖部位作為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)。

主要試劑包括75%乙醇、0.1% HgCl2、體積分?jǐn)?shù)0.5%的吐溫20。純凈水、裝有50 mL純凈水的100 mL三角瓶、鑷子、托盤、濾紙，121 ℃滅菌18 min備用。

1.2 方法

取微型月季莖段上部較柔軟部分1～2 cm(帶腋芽)，去除葉片，在加洗潔精的水中清洗20 min，再用流水沖洗1 min。在超凈工作臺(tái)中，將沖洗干凈的微型月季莖尖投入裝有50 mL純凈水的100 mL三角瓶中清洗1次，然后用75%乙醇振蕩清洗30 s、無菌水沖洗2次，再用0.1% HgCl2+體積分?jǐn)?shù)0.5%的吐溫20消毒，最后無菌水沖洗5次，濾紙吸干莖段表面水分。

以下培養(yǎng)基配置中如無特殊說明，均須添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂7.8 g·L-1，并調(diào)節(jié)pH值至5.8。

1.3 處理設(shè)計(jì)

1.3.1 滅菌

按1.2節(jié)方法操作至加入HgCl2和吐溫20，分別滅菌3、6、9 min，用無菌水沖洗外植體5次以盡量減少HgCl2對(duì)外植體的傷害。然后，用無菌濾紙吸干外植體表面水分待用。比較不同滅菌時(shí)間下微型月季莖尖的污染率和出芽率。

1.3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA和NAA，以誘導(dǎo)微型月季莖尖出芽。6-BA濃度分別設(shè)定為0、1、2 mg·L-1，NAA濃度分別設(shè)定為0、0.1、0.2 mg·L-1。

1.3.3 增殖培養(yǎng)

增殖過程是促進(jìn)微型月季細(xì)胞不斷分裂、分化，形成大量芽的過程。以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA和NAA，對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，觀察微型月季發(fā)育情況，確定最佳增殖培養(yǎng)基。6-BA濃度分別設(shè)定為0、1、2 mg·L-1，NAA濃度分別設(shè)定為0、0.06、0.12 mg·L-1。

1.3.4 生根培養(yǎng)

英國(guó)史上最糟糕的麥克風(fēng)政治風(fēng)波發(fā)生在1993年，主角是時(shí)任首相梅杰。他罵內(nèi)閣部分成員是“野種”，聲稱他們會(huì)被“釘死在十字架上”。事后，他遭到了國(guó)內(nèi)嚴(yán)厲的指責(zé)。

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，對(duì)比添加0.3 mg·L-1IBA和不添加IBA條件下微型月季的生根情況。

1.4 煉苗和移栽

獲得帶根的健康微型月季組培苗后，將苗移植入大棚。選擇最適合的基質(zhì)和最佳生長(zhǎng)條件，以保證微型月季正常生長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌

滅菌3 min，污染率為93.3%，基本整個(gè)莖尖受到污染；滅菌6 min，污染率降低到13.3%，繼續(xù)培養(yǎng)20 d，出芽率可達(dá)73.3%，長(zhǎng)出的新芽發(fā)育狀況良好；滅菌9 min，污染率僅為6.7%，但繼續(xù)培養(yǎng)20 d，出芽率降至20.0%。綜上，以滅菌6 min較適宜。

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)

由表1可以看出，不添加6-BA，NAA濃度分別為時(shí)0、0.1、0.2 mg·L-1時(shí)，基本無法誘導(dǎo)出芽或者誘導(dǎo)率很低。當(dāng)6-BA為1 mg·L-1、NAA為0.1、0.2 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率分別為83.3%和73.3%，誘導(dǎo)22 d左右可出芽，芽生長(zhǎng)速度快，發(fā)育正常。當(dāng)6-BA為2 mg·L-1、NAA為0.2 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率為60.1%，但誘導(dǎo)出的芽培養(yǎng)一段時(shí)間后，有玻璃化傾向，特別是芽基部畸形，個(gè)別出現(xiàn)芽連在一起且透明化的情況。綜上，MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1適合微型月季誘導(dǎo)出芽，經(jīng)過22 d培養(yǎng)，83.3%的莖段可誘導(dǎo)出芽，新芽生長(zhǎng)速度快，發(fā)育正常，生長(zhǎng)健康。

2.3 增殖培養(yǎng)

幼苗生長(zhǎng)至1.5 cm左右時(shí)，從基部切下，轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基中。由表2可知，MS培養(yǎng)基中不添加6-BA時(shí)，其伸長(zhǎng)和增殖速度緩慢。添加1 mg·L-16-BA+0.06 mg·L-1NAA時(shí)，芽的生長(zhǎng)速度明顯加快，伸長(zhǎng)倍率達(dá)到3.84，增殖倍率為4.20，植株健康，芽生長(zhǎng)迅速、粗壯，增殖速度快。添加1 mg·L-16-BA+0.12 mg·L-1NAA時(shí)，伸長(zhǎng)倍率為3.51，對(duì)應(yīng)的增殖倍率為3.93，芽生長(zhǎng)迅速，少數(shù)有畸形，個(gè)別有生根。當(dāng)6-BA為2 mg·L-1時(shí)，生長(zhǎng)速度較快，但是苗不粗壯，并隨著NAA濃度的升高，逐漸出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。由此可知，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+1 mg·L-16-BA+0.06 mg·L-1NAA，此時(shí)芽生長(zhǎng)迅速且健康，節(jié)間短，增殖速度快。

表1 6-BA和NAA濃度對(duì)微型月季誘導(dǎo)出芽的影響

表2 繼代1個(gè)月時(shí)不同激素含量對(duì)微型月季 增殖的影響

2.4 生根培養(yǎng)

叢生芽長(zhǎng)到3～4 cm時(shí)，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基。從表3可以看出：不添加激素，僅用基本培養(yǎng)基1/2MS情況下，平均生根數(shù)為3.69，平均根長(zhǎng)為4.12 cm，此時(shí)植株伸長(zhǎng)系數(shù)為1.46倍，生根率為86%。在基本培養(yǎng)基1/2 MS中添加IBA 0.3 mg·L-1，生根數(shù)有了很大提升，接近無激素培養(yǎng)基的2倍，達(dá)7.24，平均根長(zhǎng)略短于無激素培養(yǎng)基，為3.79 cm，莖段伸長(zhǎng)倍率為1.98，生根率為98%。由此可知，1/2 MS+IBA 0.3 mg·L-1是更適宜的生根培養(yǎng)基。

表3 繼代1個(gè)月時(shí)不同培養(yǎng)基對(duì)微型月季增殖和 生根的影響

圖1 生根2個(gè)月后根的生長(zhǎng)情況

2.5 煉苗和移栽

在生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1個(gè)月后，植株健康且健壯，待植株生長(zhǎng)至4 cm左右、有大量健康根時(shí)，可以煉苗、移栽。在培養(yǎng)間揭去瓶蓋放置3 d后，用清水沖洗根，除掉黏附其上的培養(yǎng)基，略微整理并種植于內(nèi)置珍珠巖的穴盤中，穴盤規(guī)格45 cm×45 cm，每個(gè)穴盤種植150株左右。2個(gè)月后觀察，主根發(fā)育明顯，生長(zhǎng)健壯，成活率可達(dá)98%。每個(gè)月噴灑2次0.1%多菌靈。經(jīng)過2個(gè)多月，由于珍珠巖無法保存營(yíng)養(yǎng)成分，且受密植條件限制，須將健康植株轉(zhuǎn)至新的營(yíng)養(yǎng)缽中。營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)基質(zhì)為草炭∶珍珠巖3∶1(體積比)，移栽20 d后每月施1/1 000氮磷鉀肥(圖2)。

圖2 煉苗移栽后微型月季開花

3 小結(jié)與討論

組織培養(yǎng)是利用植物細(xì)胞全能性原理實(shí)施的技術(shù)[5]。從原理上來說，植物的每個(gè)細(xì)胞都可以發(fā)育成一個(gè)獨(dú)立的個(gè)體，但由于現(xiàn)有技術(shù)的局限性，目前還不能完全實(shí)現(xiàn)。實(shí)際操作中，一般會(huì)選擇植物分生能力較強(qiáng)的部位作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，例如莖尖、腋芽、根尖等，細(xì)胞的分裂和分化能力直接決定了組織培養(yǎng)中細(xì)胞的繁殖速度和繁殖效率。本試驗(yàn)中選取微型月季莖段帶腋芽的幼嫩部位，即選取分生能力較強(qiáng)的部位作為外植體進(jìn)行試驗(yàn)，有利于后期培養(yǎng)過程中的快速繁殖。

組織培養(yǎng)要在完全無菌條件下進(jìn)行。要獲得完全無菌的接種材料，一方面可以選取植物組織內(nèi)部無菌的材料，另一方面，可以通過消毒處理殺死植物材料表面存在的各種微生物。一般多根據(jù)試驗(yàn)材料選用合適的消毒劑及適合的濃度和處理時(shí)間，以及合適的消毒方法[6]。常規(guī)試驗(yàn)中經(jīng)常使用5%～10%漂白粉、70%～75%酒精、0.1%～0.2%升汞，及2%～10%次氯酸鈉等滅菌液脫毒[7]。本試驗(yàn)采用添加了體積分?jǐn)?shù)0.5%吐溫20的0.1%升汞溶液作為滅菌溶液，滅菌6 min，隨后用無菌水多次沖洗，以減少升汞對(duì)外植體的毒害。吐溫主要起到增加滲透性、提高滅菌效率的作用。在此條件下，污染率降至13.3%。20 d后出芽率可達(dá)73.3%，且新出芽體健康，色澤翠綠，生長(zhǎng)迅速。

生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素在組織培養(yǎng)中是常用的激素。激素的正確配比可以促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)，在組織培養(yǎng)過程中具有決定性作用。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素不一定適用于組織培養(yǎng)的每個(gè)步驟，其使用情況取決于植物各階段發(fā)育情況。本試驗(yàn)中，誘導(dǎo)和增殖步驟均使用生長(zhǎng)素NAA和細(xì)胞分裂素6-BA，而生根過程采用的是生長(zhǎng)素IBA。采用6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1是比較適合微型月季誘導(dǎo)的配比，在此配比下，經(jīng)過22 d的生長(zhǎng)，莖段誘導(dǎo)率可達(dá)83.3%，芽生長(zhǎng)情況較好。增殖過程中最佳的激素方案為MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.06 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂7.8 g·L-1，此時(shí)伸長(zhǎng)倍率3.84，對(duì)應(yīng)增殖倍率4.20，植株健康，莖段粗壯，節(jié)間短，生長(zhǎng)旺盛。在快速增殖過程中，除了基部分化不定芽外，伸長(zhǎng)的每個(gè)節(jié)間也可以切斷用于增殖，繁殖速度大大提高。過高的生長(zhǎng)素或分裂素會(huì)引起植株的玻璃化。植物組織玻璃化，即植物結(jié)構(gòu)發(fā)育畸形，是一種生理失調(diào)或生理病變，很難繼續(xù)用于繼代培養(yǎng)和擴(kuò)繁材料[8]。IBA是人工合成生長(zhǎng)素，在促進(jìn)生根過程中起重要作用。本試驗(yàn)中，添加IBA與無激素添加培養(yǎng)基生根效果差異明顯，添加IBA的培養(yǎng)基生根量接近無激素培養(yǎng)基的2倍，生根率也從原來的86%提高到98%。

植株在生根培養(yǎng)基上促進(jìn)根生長(zhǎng)，但是過長(zhǎng)的根會(huì)導(dǎo)致其纏繞，增加煉苗難度，且過長(zhǎng)的根在轉(zhuǎn)移到基質(zhì)后會(huì)腐爛。因此培養(yǎng)1個(gè)月，根長(zhǎng)至3～5 cm即可取出煉苗。為了逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，首先在培養(yǎng)室下開蓋3 d，適應(yīng)外部環(huán)境后，取出幼苗并用流水沖洗去除培養(yǎng)基，用于煉苗。培養(yǎng)基徹底清除才能防止苗發(fā)霉長(zhǎng)菌，但不是去除培養(yǎng)基即可保證后期不會(huì)發(fā)霉長(zhǎng)菌，因此在煉苗后須定期噴灑多菌靈溶液，同時(shí)須保證通風(fēng)良好。煉苗最初采用珍珠巖固定根部，大孔隙可以保持根部生長(zhǎng)環(huán)境良好，但珍珠巖保水性較差，因此需要每天澆水。隨后生長(zhǎng)2個(gè)月，根得到了足夠生長(zhǎng)，主根明顯，此時(shí)需要寬松、保水和提供養(yǎng)分的基質(zhì)，因此將植株轉(zhuǎn)移到草炭∶珍珠巖3∶1(體積比)基質(zhì)中，并定期施加薄肥。大的營(yíng)養(yǎng)缽可以提供足夠的土壤空間和肥力，有利于植物的正常發(fā)育。

[1] 蒲建霞. 微型月季組培快繁技術(shù)[J]. 北方園藝, 2006(4):156.

[2] 牟會(huì)斌. 微型月季微繁體系的構(gòu)建及組培生根機(jī)理研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2001.

[3] 張作梅. 微型月季組培快繁技術(shù)體系的研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[4] 劉慧. 微型月季莖段組培快繁技術(shù)研究[J]. 北方園藝, 2011(14):114-116.

[5] 高燕, 宋垚, 葉康,等. 礬根歐布西迪昂組培快繁技術(shù)[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015 (6):895-898.

[6] 高燕, 魏宇昆, 奉樹成. 貴州鼠尾草組織培養(yǎng)育苗技術(shù)[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 58(3):407-411.

[7] 楊海蓮, 孫曉潞, 宋未. 植物內(nèi)生細(xì)菌的研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1998, 25(4):224-227.

[8] 胡彥, 趙艷. 植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用以及在培養(yǎng)過程中存在的問題[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004，32(專輯):130-134.