馬 迅，楊 威，趙新梅，宋鵬飛，王 熾，陳興位，閆 輝，李枝武，胡 靖，倪 明*

(1.云南中煙有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】云南是種植烤煙的大省，其立體氣候特點(diǎn)明顯，不同地區(qū)生態(tài)條件差異較大，煙葉的主要倉儲(chǔ)地點(diǎn)在全省分布較廣[1-3]，各個(gè)倉儲(chǔ)地點(diǎn)環(huán)境的溫濕度條件不同，會(huì)影響倉儲(chǔ)煙葉的酶活性[4]。酶類作用是煙葉陳化的機(jī)理之一[5]，在陳化期間，煙葉中的多種物質(zhì)在酶類的作用下氧化分解形成重要的香氣成分[6]，是提高煙葉發(fā)酵質(zhì)量的動(dòng)力[7]，因而有必要研究自然條件下片煙陳化的酶活性變化動(dòng)態(tài)。【前人研究進(jìn)展】國內(nèi)學(xué)者研究了室內(nèi)控制溫濕度處理對烤煙陳化過程中多酚氧化酶、過氧化物酶、脂氧合酶、苯丙氨酸裂解酶活性變化的影響[8-10]，烤煙生長過程中不同移栽時(shí)間的酶活性變化[11]，實(shí)驗(yàn)室煙葉自然陳化的酶活性變化[12]，安徽和貴州烤煙片煙倉儲(chǔ)中化學(xué)成分及相關(guān)酶類的變化[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】昆明、曲靖、紅河均為云南重要煙區(qū)，每年提供大量的煙葉原料，曲靖、楚雄、紅河、元江4個(gè)地區(qū)均處于云南中緯度地區(qū)，溫濕度條件有利于煙葉的陳化處理，是建立大型倉儲(chǔ)基地的適宜地點(diǎn)，也是探究自然陳化的合適地點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在探究4個(gè)存儲(chǔ)地點(diǎn)2個(gè)烤煙品種片煙陳化過程中的蛋白酶、淀粉酶、多酚氧化酶、過氧化物酶的變化動(dòng)態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)地點(diǎn)為曲靖、楚雄、紅河、元江4個(gè)烤煙片煙倉庫。選取昆明、曲靖、紅河3個(gè)產(chǎn)地的烤煙K326和紅大2個(gè)品種的C3F片煙，烤煙生產(chǎn)時(shí)間為2014年，入庫時(shí)間為2015年4月，其中第1批取樣時(shí)間為2015年4月(即陳化時(shí)間0個(gè)月)，第2批取樣時(shí)間為2015年10月(即陳化時(shí)間6個(gè)月)，第3批取樣時(shí)間為2016年1月(即陳化時(shí)間9個(gè)月)，第4批取樣時(shí)間為2016年7月(即陳化時(shí)間15個(gè)月)，共計(jì)96個(gè)樣品，取樣方法見圖1。

1.2 試驗(yàn)方法

4個(gè)倉儲(chǔ)地點(diǎn)環(huán)境溫濕度數(shù)據(jù)來源于各地倉庫管理員的每日記錄，記錄地點(diǎn)為倉庫內(nèi)，記錄每日上午10:00時(shí)和下午14:00時(shí)的溫濕度情況。根據(jù)每日的溫濕度均值算出每個(gè)月的平均溫濕度。

分別在陳化0、6、9和15個(gè)月時(shí)取煙樣進(jìn)行酶活性及其相關(guān)化學(xué)成分含量的測定。淀粉酶活性測定參照鄒琦[14]方法，蛋白酶活性測定參照張樹政[15]方法，多酚氧化酶和過氧化物酶活性測定參照朱廣廉等[16]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)倉儲(chǔ)區(qū)煙葉倉庫的年溫濕度變化情況

4個(gè)倉儲(chǔ)地點(diǎn)煙葉倉庫全年的溫濕度變化特點(diǎn)各異(表1，圖2)，其中，元江倉庫海拔最低，全年溫度和濕度較高，且季節(jié)性變化小，屬于高溫中濕倉儲(chǔ)區(qū)；彌勒倉庫全年濕度較高，但溫度季節(jié)性較強(qiáng)，溫濕度夏、秋兩季較高，冬、春兩季較低，屬于中溫高濕倉儲(chǔ)區(qū)；楚雄倉庫全年溫濕度隨季節(jié)變化的幅度大，季節(jié)性較強(qiáng)，且雨熱同期，屬于中溫中濕倉儲(chǔ)區(qū)；曲靖倉庫全年溫濕度變化幅度較小，季節(jié)性不強(qiáng)，屬于低溫低濕倉儲(chǔ)區(qū)。

2.2 4個(gè)倉儲(chǔ)區(qū)的酶活性變化分析

蛋白酶、淀粉酶、多酚氧化酶、過氧化物酶4種酶活性隨著倉儲(chǔ)區(qū)、烤煙品種和取樣時(shí)間(即陳化時(shí)間)而變化?？偟膩砜矗煌緹熎贩N的酶活性不同，K326品種的4種酶活性均顯著高于紅大品種，4種酶活性隨著取樣時(shí)間變化而變化見表2～5。

圖1 取樣方法Fig.1 Sampling method

表1 4個(gè)陳化倉儲(chǔ)地點(diǎn)的生態(tài)條件Table 1 Ecological conditions of the four storage locations

圖2 4個(gè)倉儲(chǔ)地點(diǎn)的月溫濕度變化Fig.2 Monthly temperature and humidity changes in the four storage locations

表2 元江倉儲(chǔ)區(qū)片煙4種酶活性的變化Table 2 Activities of four enzymes in storage area of Yuanjiang

續(xù)表2 Continued table 2

產(chǎn)地Producingareas陳化時(shí)間(月)AgingtimeK326紅大蛋白酶活性(U/g)Proteaseactivity淀粉酶(U/g)Amylaseactivity過氧化物酶(U/g)Peroxidaseactivity多酚氧化酶(U/g)Polyphenoloxidaseactivity蛋白酶活性(U/g)Proteaseactivity淀粉酶(U/g)Amylaseactivity過氧化物酶(U/g)Peroxidaseactivity多酚氧化酶(U/g)Polyphenoloxidaseactivity6970．3690．1840．33451．2280．3871．3391120．1620．7150．672540．4690．120152640．4120．074500．4450．3270

表3 彌勒倉儲(chǔ)區(qū)片煙4種酶活性的變化Table 3 Activities of four enzymes in storage area of Mile

表4 楚雄倉儲(chǔ)區(qū)片煙4種酶活性的變化Table 4 Activities of four enzymes in storage area of Chuxiong

表5 曲靖倉儲(chǔ)區(qū)片煙4種酶活性的變化Table 5 Activities of four enzymes in storage area of Qujing

2.3 4種酶的變化動(dòng)態(tài)

4個(gè)存儲(chǔ)地點(diǎn)的K326和紅大品種片煙的蛋白酶活性的動(dòng)態(tài)變化基本一致。供試煙樣陳化前期蛋白酶活性較低，陳化0～6個(gè)月其活性開始上升，6～9個(gè)月蛋白酶活性增幅變大，陳化9個(gè)月時(shí)蛋白酶活性達(dá)到最高，此后蛋白酶活性有不同程度降低，其中K326品種片煙蛋白酶活性的變幅更大見圖3。

4個(gè)存儲(chǔ)地點(diǎn)的K326和紅大2個(gè)品種片煙淀粉酶酶活性的總體變化趨勢不明顯，其中紅河和曲靖2個(gè)產(chǎn)地的淀粉酶活性呈現(xiàn)先增加后降低然后再增加的趨勢，昆明產(chǎn)地的片煙淀粉酶活性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢見圖3。

4個(gè)存儲(chǔ)地點(diǎn)的K326和紅大品種過氧化物酶酶活性的變化動(dòng)態(tài)有一定差異，其中，K326品種片煙過氧化物酶活性呈現(xiàn)波動(dòng)變化，陳化0～6個(gè)月時(shí)過氧化物酶活性逐漸降低，6～9個(gè)月時(shí)過氧化物酶活性逐漸增加，9～15個(gè)月時(shí)過氧化物酶活性逐漸降低；紅大品種片煙過氧化物酶活性0～6個(gè)月時(shí)呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，6～9個(gè)月時(shí)降低幅度變大，9～15個(gè)月時(shí)降低趨勢變緩，但至15個(gè)月時(shí)，2個(gè)品種的過氧化物酶活性基本達(dá)到同一水平見圖4。

4個(gè)存儲(chǔ)地點(diǎn)的K326和紅大品種片煙中的多酚氧化酶的酶活性變化動(dòng)態(tài)基本一致，陳化0～6個(gè)月時(shí)呈現(xiàn)降低，6～9個(gè)月時(shí)降幅減少，9～15個(gè)月時(shí)多酚氧化酶活性逐漸升高，其中K326的變化幅度比紅大品種更大見圖4。

圖3 4個(gè)存儲(chǔ)地點(diǎn)的K326和紅大烤煙蛋白酶、淀粉酶活性變化動(dòng)態(tài)Fig.3 Dynamic changes of protease and amylase activities in two tobacco cultivars of four storage area

圖4 4個(gè)存儲(chǔ)地點(diǎn)的K326和紅大品種的過氧化物酶、多酚氧化酶活性變化動(dòng)態(tài)Fig.4 Dynamic changes of peroxidase and polyphenol oxidase activities in two tobacco cultivars of four storage area

3 討 論

自然陳化也叫自然醇化或自然發(fā)酵，主要借助自然氣候變化進(jìn)行發(fā)酵，也叫季節(jié)性發(fā)酵[17]，它的主要特點(diǎn)是在煙葉存儲(chǔ)期間，利用一年一度的春季溫度上升促進(jìn)煙葉內(nèi)酶的活動(dòng)，使煙葉經(jīng)過緩慢的發(fā)酵過程，以達(dá)到改善煙葉品質(zhì)的目的[18]。本研究表明不同存儲(chǔ)地點(diǎn)、烤煙品種、陳化時(shí)間對陳化過程中酶活性變化均有影響，不同倉儲(chǔ)地點(diǎn)的溫濕度不同，其中元江屬于高溫中濕倉儲(chǔ)區(qū)，彌勒屬于中溫高濕倉儲(chǔ)區(qū)，楚雄屬于中溫中濕倉儲(chǔ)區(qū)，曲靖屬于低溫低濕倉儲(chǔ)區(qū)，不同倉儲(chǔ)區(qū)的自然環(huán)境與烤煙品種差異使4種酶的酶活性呈現(xiàn)復(fù)雜性變化。

4個(gè)存儲(chǔ)地點(diǎn)的K326和紅大品種的蛋白酶活性隨著陳化時(shí)間的推進(jìn)呈現(xiàn)逐漸升高，在第9個(gè)月時(shí)達(dá)到最大，這與張西仲[19]等研究結(jié)論一致。初始蛋白酶活性較低可能原因是片煙在打葉復(fù)烤時(shí)，在高溫和脫水作用下蛋白酶鈍化，開始陳化后，由于溫度逐漸升高，鈍化的酶開始恢復(fù)活性；淀粉酶活性在陳化過程中的總體變化趨勢不明顯，昆明產(chǎn)地與紅河、曲靖變化趨勢不一致，過氧化物酶的酶活性變化因品種不同而有差異，紅大品種陳化過程中逐漸降低，K326品種則先波動(dòng)上升后降低，這可能與實(shí)際存儲(chǔ)情況的復(fù)雜性有關(guān)；多酚氧化酶的酶活性在2個(gè)烤煙品種片煙中的變化趨勢一致，呈現(xiàn)“先降低后升高”的規(guī)律，這與趙銘欽[20]等研究的結(jié)論不一致，可能由于趙銘欽等為室內(nèi)控制的恒定溫濕度條件，而本研究是在自然的存儲(chǔ)條件下，其溫濕度變化情況更復(fù)雜，且煙葉經(jīng)過初烤和復(fù)烤2次高溫處理后，煙葉中的水解酶活性較低，因此在煙葉陳化初期酶活性不高，至陳化9個(gè)月后酶活性才開始迅速上升。

K326品種片煙的蛋白酶、淀粉酶、多酚氧化酶、過氧化物酶4種酶的活性均顯著高于紅大品種，且變化幅度較大，這與陳化過程中觀察到的紅大品種比K326品種煙葉更耐儲(chǔ)存的現(xiàn)象相一致，酶活性的測定結(jié)果也明確了酶活性變化是紅大品種片煙更耐儲(chǔ)存的深層原因。

4 結(jié) 論

自然陳化條件下，存儲(chǔ)地點(diǎn)、烤煙品種、陳化時(shí)間使片煙中的蛋白酶、淀粉酶、多酚氧化酶、過氧化物酶4種酶的活性呈現(xiàn)復(fù)雜性變化，這些變化對煙葉的陳化有重要的影響。本研究探究了自然陳化過程中4種酶的酶活性變化動(dòng)態(tài)，明確了紅大品種片煙比K326品種片煙更耐儲(chǔ)存的深層原因。

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