劉鐵軍，孫勝斌，陳翔宇，王文鵬，周永妍，姜國(guó)志

（1.河北省中藥注射液工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 051430；2.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；3.中藥注射劑新藥技術(shù)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430）

丹參注射液是由丹參經(jīng)水提、醇沉、酸沉、堿沉制成的無(wú)菌水溶液，因此其主要有效成分為水溶性酚酸類化合物［1-5］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，丹參水溶性有效成分均具有酚酸性結(jié)構(gòu)，如丹酚酸A（Salvianolic acid A，Sal A）、丹酚酸 B（Salvianolic acid B，Sal B）、丹酚酸C（Salvianolic acid C，Sal C）、迷迭香酸（Rosmarinic Acid），均是由不同分子的丹參素與咖啡酸縮合而成，而丹參素是丹酚酸類化合物的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，其化學(xué)名為 β-3，4-二羥基苯乳酸（3，4-hydroxybenyl lactic acid）。其他還包括丹酚酸 D、E、F、G等［6-12］。酚酸類成分在藥理實(shí)驗(yàn)中已被證明是丹參活血、祛瘀、止痛的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有抗血小板聚集、抗血酸形成，促進(jìn)纖維蛋白降解，防治動(dòng)脈粥樣硬化及抗心肌缺血的作用［13］。由于酚酸類成分的縮合特性，部分化合物熱穩(wěn)定性不好，因此，丹參提取精制過(guò)程中濃縮方法的選擇會(huì)不同程度地影響丹參水溶性酚酸類成分。本文采用不同的濃縮方法考察對(duì)丹參提取液有效成分的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CPA225D電子天平（德國(guó)賽多利斯）；Agilent 1260型液相色譜儀。

1.2 試藥

丹參素鈉對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110855-201614，含量98.1%）；原兒茶醛對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110810-201007，含量98.2%）；咖啡酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110885-200101）；迷迭香酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111871-201505，含量98.8%）；丹酚酸B對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111562-201615，含量96.2%）；乙腈為色譜級(jí)；水為重蒸餾水。

樣品為神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

2 方法

2.1 不同濃縮條件樣品的制備

2.1.1 常壓濃縮 取丹參提取液于95～100℃下常壓蒸發(fā)濃縮，分別于濃縮至原體積的1／2、1／5、1／10、1／20時(shí)，即相當(dāng)于原體積濃縮了2倍、5倍、10倍、20倍時(shí)取樣。

2.1.2 減壓濃縮 取丹參提取液于55～65℃，真空度0.08～0.09 MPa下減壓濃縮，分別于濃縮至5、10、15、20倍體積時(shí)取樣。

2.1.3 納濾膜濃縮 取丹參提取液于過(guò)濾壓力1.5～2.0 MPa下過(guò)濾濃縮，分別于濃縮至5、10、15、20倍體積時(shí)取樣。

2.2 丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.03%的三氟乙酸水；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加0.2%冰醋酸的10%甲醇溶液制成含0.2 mg·mL-1丹參素鈉、0.1 mg·mL-1咖啡酸、0.05 mg·mL-1原兒茶醛、0.5 mg·mL-1迷迭香酸、0.5 mg·mL-1丹酚酸 B的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取適量提取濃縮液，加0.2%冰醋酸的10%甲醇溶液稀釋，既得。見(jiàn)圖1～2。

圖1 對(duì)照品色譜圖

2.3 總酚酸測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取丹參素鈉對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液2、3、4、5、6、7 mL，分別置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在280 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取提取濃縮液，加水稀釋，搖勻，依法測(cè)定吸光度，既得。

圖3 對(duì)照品溶液200～400 nm全波長(zhǎng)掃描圖

圖4 供試品溶液200～400 nm全波長(zhǎng)掃描圖

3 結(jié)果與分析

3.1 含量測(cè)定方法學(xué)考察

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 取上述混合對(duì)照品溶液，按2.2方法，分別進(jìn)樣1、2、5、10、20、30μL，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，樣品峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為：Y丹參素鈉＝57.128X+5.868，r＝0.999 8，Y原兒茶醛＝138.17 X+31.556，r＝0.999 6，Y咖啡酸＝13.136 X+5.427 1，r＝0.999 5，Y迷迭香酸＝87.656 X+2.496 8，r＝0.999 7，Y丹酚酸B＝50.245 X+4.791 2，r＝0.999 8，說(shuō)明丹參素鈉進(jìn)樣量在0.20～6.0μg、咖啡酸進(jìn)樣量在0.1～3.0μg，原兒茶醛、迷迭香酸進(jìn)樣量在0.050～1.50μg、丹酚酸B進(jìn)樣量在0.5～15.0μg線性關(guān)系良好。

3.1.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B的峰面積 RSD分別為0.65%、1.82%、1.21%、081%、1.35%，表明精密度良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)：16052811），分別于0、2、4、8、12、24、48 h時(shí)進(jìn)樣檢測(cè)，丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B峰面積RSD分別為1.95%、0.74%、1.12%、1.25%、0.83%，說(shuō)明被測(cè)溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按供試品溶液制備方法，取同一批樣品（批號(hào)：160528A1），共6份，依法測(cè)定。丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B含量 RSD分別為 1.73%、1.28%、0.86%、1.21%、1.98%，說(shuō)明本測(cè)定方法重復(fù)性良好。

3.1.5 加樣回收試驗(yàn) 精密量取2 mL提取液稀釋至10 mL，取1.0 mL，平行6份，分別加入0.4 mg·mL-1丹參素鈉、0.05 mg·mL-1原兒茶醛、0.1 mg·mL-1咖啡酸、0.05 mg·mL-1迷迭香酸、1.0 mg·mL-1丹酚酸B的混合對(duì)照品溶液0.8、0.8、1.0、1.0、1.2、1.2 mL，混勻后進(jìn)樣檢測(cè)。以峰面積計(jì)算回收率，丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B的加樣回收率分別為 98.62%、99.21%、99.76%、98.96%和 100.06%，RSD分別為1.13%、1.21%、0.86%、1.63和1.52%，均符合要求。

3.2 不同的濃縮方法對(duì)丹參提取液有效成分的影響

3.2.1 丹參提取液不同濃縮方法各含量結(jié)果 見(jiàn)表2。

3.2.2 不同方法濃縮過(guò)程各含量的變化 隨濃縮時(shí)間的延長(zhǎng)，常壓濃縮、減壓濃縮過(guò)程丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、總酚酸含量逐步增加，增幅逐漸減小，常壓濃縮含量增幅較減壓濃縮大；丹酚酸B含量逐步減小，降幅逐漸減小，常壓濃縮含量降幅較減壓濃縮大；迷迭香酸較穩(wěn)定，3種濃縮方法對(duì)該含量均無(wú)顯著影響。膜濃縮過(guò)程對(duì)各含量均無(wú)顯著影響。見(jiàn)圖5～10。

表2 丹參提取液不同濃縮方法各成分含量

圖5 濃縮過(guò)程丹參素鈉含量的變化

圖6 濃縮過(guò)程原兒茶醛含量的變化

圖7 濃縮過(guò)程咖啡酸含量的變化

圖8 濃縮過(guò)程迷迭香酸含量的變化

圖9 濃縮過(guò)程丹酚酸B含量的變化

圖10 濃縮過(guò)程總酚酯含量的變化

3.2.3 丹酚酸B降解規(guī)律分析 基于以上數(shù)據(jù)，進(jìn)一步分析了解丹酚酸B的降解規(guī)律。由于丹酚酸B的降解是由于酯鍵的裂解產(chǎn)生，一般酯鍵的水解符合一級(jí)反應(yīng)的特點(diǎn)，因此，以樣品丹酚酸B濃度的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，受熱時(shí)間為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。丹酚酸B常壓濃縮降解回歸方程為L(zhǎng)n（C）＝-0.114 t+2.947 6，減壓濃縮降解回歸方程為L(zhǎng)n（C）＝-0.083 t+2.947 6。說(shuō)明提取后丹參提取液在pH值一定的條件受熱濃縮，其過(guò)程完全符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，隨溫度由55～65℃變?yōu)?5～100℃，其反應(yīng)速率常數(shù)由-0.081 3變?yōu)?0.114。見(jiàn)圖11。

圖11 濃縮過(guò)程丹酚酸B降解趨勢(shì)

4 結(jié)論與討論

為減少實(shí)驗(yàn)誤差，過(guò)程中嚴(yán)格控制了加熱溫度、濃縮時(shí)間、真空度等參數(shù)，盡可能保證整個(gè)濃縮過(guò)程的速度，為后續(xù)物質(zhì)降解規(guī)律的初步探索做準(zhǔn)備。

在受熱條件下，丹參提取液中酚酸類成分發(fā)生了降解與轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)了丹酚酸B顯著降低，丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、總酚酸含量顯著增加的現(xiàn)象，這是由于丹酚酸B是由3分子的丹參素和1分子的咖啡酸縮合形成的，具有兩個(gè)羧基，在受熱和不同pH環(huán)境條件可發(fā)生降解，降解可產(chǎn)生丹參素、咖啡酸，在酸性條件下受熱甚至進(jìn)一步降解為迷迭香酸，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［14-15］。而實(shí)驗(yàn)中迷迭香酸未見(jiàn)明顯變化，可能是由于在該藥液pH值環(huán)境下較穩(wěn)定未發(fā)生降解。

丹參提取液濃縮過(guò)程中丹酚酸B的降解主要是由于酯鍵的裂解產(chǎn)生的，其降解規(guī)律符合一級(jí)反應(yīng)的特點(diǎn)。

丹參提取液中存在熱不穩(wěn)定性成分，采用不同的濃縮方法會(huì)對(duì)其酚酸類成分產(chǎn)生明顯影響，因此，生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度、真空度、時(shí)間等參數(shù)，以保證批間的一致穩(wěn)定。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出，納濾膜濃縮的優(yōu)點(diǎn)在于防止了熱敏性成分的降解，最大程度地保持與藥液物質(zhì)基礎(chǔ)一致，因此，應(yīng)采用納濾膜濃縮方法對(duì)丹參提取液進(jìn)行濃縮。

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