尹連紅，許有威

(大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116044)

肝損傷是由病毒性、寄生蟲性、化學(xué)中毒性(包括酒精性、醫(yī)源性)以及營養(yǎng)不良或高脂食物等引起的肝臟病理生理改變?，F(xiàn)有的上市藥物不能有效預(yù)防治療肝臟損傷和促進(jìn)肝細(xì)胞的再生，尋找和開發(fā)研制新型的保肝、護(hù)肝產(chǎn)品吸引了人們的關(guān)注，尤其是近年來，許多學(xué)者在我國傳統(tǒng)的中草藥的研究中發(fā)現(xiàn)一些天然植物具有一定的保肝作用。

四氯化碳(CCl4)是制備化學(xué)性肝損傷動物模型的經(jīng)典肝毒性物質(zhì)，其誘導(dǎo)急性肝損傷的主要機(jī)制目前認(rèn)為與其自身及自由基代謝產(chǎn)物有關(guān)。CYP450是CCl4的主要代謝酶。CCl4被CYP450激活和代謝，產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物三氯甲基自由基(-CCl3)和過氧化三氯甲基自由基(-CCl3O2)，刺激產(chǎn)生活性中間產(chǎn)物(ROI)，這些高毒性、高反應(yīng)活性的中間體能引起肝微粒體脂質(zhì)的過氧化，攻擊位于肝細(xì)胞膜上的磷脂分子，引起細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜氯烷化和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并且還能與膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)大分子共價結(jié)合，直接損傷細(xì)胞膜并破壞其完整性，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死或凋亡[1-2]。脂質(zhì)在過氧化過程中會產(chǎn)生丙二醛(malondialdehyde, MDA)，它能與膜蛋白酶結(jié)合變性，同時增加膜通透性，改變細(xì)胞膜代謝、功能和結(jié)構(gòu)，對機(jī)體造成進(jìn)一步損害[3]。在肝組織中，MDA的含量不僅反映了肝細(xì)胞生物膜脂質(zhì)過氧化的嚴(yán)重程度，還反映了肝臟疾病的嚴(yán)重程度。過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等抗氧化酶以及有抗氧化性的小分子有機(jī)物如維生素C、GSH及維生素E等能清除或淬滅(reactive oxygen species, ROS)，而減輕由ROS引起的損傷。肝臟受到氧化應(yīng)激后，肝細(xì)胞中的GSH-PX和SOD等抗氧化酶的活性會降低。肝臟是谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)的主要分布場所。在正常肝細(xì)胞內(nèi)，ALT和AST主要以非錨定形式存在于胞漿及線粒體，不會擴(kuò)散進(jìn)入血液循環(huán)。當(dāng)肝細(xì)胞受到破壞時，肝細(xì)胞膜通透性升高，引發(fā)ALT和AST大量外泄，進(jìn)而導(dǎo)致血清ALT和AST水平陡增。

金櫻子膠囊以金櫻子提取物、枳椇子提取物、牛磺酸(每400 mg膠囊分別含有222 mg金櫻子提取物、60 mg枳椇子提取物和83 mg?；撬?、微晶纖維素、硬脂酸鎂為主要原輔料，經(jīng)過篩、混合、制粒、干燥、整粒、總混、填充膠囊、拋光、包裝等工藝制成的。人體推薦日服用量為2.4 g/d，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金櫻子果實可作利尿劑、鎮(zhèn)咳劑，也可用于皮膚腫瘤、燒燙傷、神經(jīng)衰弱、高血壓、神經(jīng)性頭痛、慢性腎炎等的治療[4-5]；枳椇子有顯著的解酒、保肝、抗肝纖維化及抗衰老、抗疲勞等作用[6]；?；撬崾钦{(diào)節(jié)機(jī)體正常生理活動的活性物質(zhì)，具有維持正常視覺功能、維持機(jī)體滲透壓平衡、調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣平衡，與細(xì)胞膜的流動性有關(guān)，降血糖、調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)、參與內(nèi)分泌活動、調(diào)節(jié)脂類消化與吸收、增加心臟收縮能力、提高機(jī)體免疫能力、增強(qiáng)細(xì)胞膜抗氧化能力、保護(hù)心肌細(xì)胞等廣泛生物學(xué)作用[7]。而金櫻子、枳椇子、?；撬崛吲湮閷瘜W(xué)性肝損傷的保護(hù)作用未見報道。

本實驗通過建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，進(jìn)行金櫻子膠囊對化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用研究，為保護(hù)肝臟的保健品及藥品的研究提供一個新方向。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物

昆明小鼠(SPF級，雄性)60只，體重(20±2)g，由大連醫(yī)科大學(xué)SPF動物實驗中心提供[合格證號：SCXK(遼)2013-0008]，自由飲食與攝水。

1.1.2 藥品和試劑

CCl4分析純購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；NaCl、無水乙醇、冰乙酸、羧甲基纖維素鈉均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；金櫻子膠囊由大連醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室自制；BCA蛋白濃度試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；AST、ALT、T-SOD、MDA、GSH和GSH-PX測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究。

1.2 方 法

1.2.1 金櫻子膠囊混懸液的制備

用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液將本膠囊分別制成低劑量(10 mg/mL)、中劑量(20 mg/mL)和高劑量(40 mg/mL)的混懸液。

1.2.2 分 組

60只昆明小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)2天。隨機(jī)分為6組，分別是空白對照組(Control)、模型組(Model)、膠囊低劑量組(Low)、中劑量組(Middle)和高劑量組(High)，每組10只。根據(jù)既往研究報道[8-9]和我們長期的研究開發(fā)經(jīng)驗，金櫻子膠囊低、中和高劑量組分別定為100、200和400 mg/(kg·d)。

1.2.3 CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型的建立

將低劑量、中劑量和高劑量給藥組小鼠分別灌胃給予對應(yīng)的金櫻子膠囊混懸液(0.1 mL/10 g)，每天1次，連續(xù)7 d；空白對照組和模型組則灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉(0.1 mL/10 g)，每天1次，連續(xù)7 d。在最后一次給藥2 h后，模型組和給藥組小鼠一次性腹腔注射0.4%CCl4大豆油溶液(0.1 mL/10 g)，禁食不禁水，12 h后稱重，眼眶靜脈采血，分離血清，-80 ℃保存，脫椎處死小鼠，分離出肝組織并稱重，-80 ℃保存。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查

將固定于10%甲醛溶液中的肝臟組織包埋入石蠟中，切成5 μm的組織薄片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，制成切片，經(jīng)蘇木精和伊紅染色后于200倍鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.2.5 肝生化指標(biāo)檢測

(1)血清AST活性測定：本實驗所用試劑盒采用速率法測定AST的活力?？瞻坠芎蜏y定管各加入AST檢測試劑900 μL，37 ℃孵育3 min?？瞻坠芗尤腚p蒸水45 μL，測定管加入45 μL血清，混勻，37 ℃孵育90 s，0.5 cm比色光徑，雙蒸水調(diào)零，340 nm連續(xù)監(jiān)測1～3 min各管吸光度值變化。按下列公式計算AST的活力：

AST活力(U/L) = (△A測定/min-△A空白/min) × F (3376)

(2)血清ALT活性測定：本實驗所用試劑盒采用速率法測定ALT的活力?？瞻坠芎蜏y定管各加入ALT檢測試劑900 μL，37 ℃孵育3 min。空白管加入雙蒸水45 μL，測定管加入45 μL血清，混勻，37 ℃孵育60 s，0.5 cm比色光徑，雙蒸水調(diào)零，340 nm下連續(xù)監(jiān)測1～3 min各管吸光度值變化。按下列公式計算AST的活力：

AST活力(U/L) = (△A測定/min-△A空白/min) × F (3376)

1.2.6 各氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測及操作步驟

用分光光度計法測定小鼠肝組織中MDA的含量，以及T-SOD、GSH、GSH-PX的活性，均依照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒說明書測定。

(1)MDA含量的測定：過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。所以本實驗所用試劑盒采用硫代巴比妥酸(TBA)法進(jìn)行測定。取10%肝組織勻漿0.1 mL，嚴(yán)格按照說明書加入準(zhǔn)確量的減半各個試劑后，用渦旋混勻器混勻，標(biāo)記好后，封口膠封口，95 ℃水浴60 min，取出后流水冷卻，然后4000 r/min，離心10 min。取上清液，于532 nm處，0.5 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測各管吸光度值(計算時需×2)。按下述公式進(jìn)行組織勻漿MDA含量計算:

組織中MDA含量(nmol/mgprot) =[(測定管OD值-對照管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)] ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/mL)/待測樣本蛋白濃度(mgprot/mL)

(2) T-SOD活力的測定：本實驗所用試劑盒采用黃嘌呤氧化酶法測定肝組織中SOD活力。實驗前先按照試劑盒說明確定了最佳取樣量是0.25%肝組織勻漿為10 μL，取0.25%肝組織勻漿(10%勻漿稀釋得到)10 μL，嚴(yán)格按照說明書加入準(zhǔn)確量的減半各個試劑，用渦旋混勻器充分混勻，37℃恒溫水浴40 min，然后加入減半顯色劑(現(xiàn)用現(xiàn)配，注意避光)，混勻，室溫放置10 min，于550 nm處，0.5 cm光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度值(計算時需×2)。按下述公式進(jìn)行組織勻漿T-SOD活力計算：

T-SOD活力(U/mgprot) =[(對照OD值-測定OD值)×反應(yīng)液總體積(mL)]/對照OD值/取樣量(mL)/待測樣本蛋白濃度(mgprot/mL)/50%

(3) GSH含量的測定：采用分光光度法測定。二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應(yīng)時能產(chǎn)生一種黃色化合物，可進(jìn)行比色定量測定。取10%肝組織勻漿500 μL，嚴(yán)格按照說明書加入各個試劑，最后混勻，靜置5 min，在420 nm處，1 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測各管吸光度值。按下述公式進(jìn)行組織勻漿GSH含量計算：

GSH含量(gGSH/L)=[測定OD值-空白OD值]/[標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(20×10-6mol/L) ×GSH分子量(307) ×稀釋倍數(shù)(5)

(4)GSH-PX活力的測定：采用分光光度法測定。取0.25%肝組織勻漿200 μL，按說明書先進(jìn)行37 ℃酶促反應(yīng)，之后4000 r/min，離心10 min，吸取上清1 mL進(jìn)行顯色反應(yīng)。按照說明書準(zhǔn)確加入減半各反應(yīng)試劑后渦旋混勻，室溫靜置15 min，波長412 nm，0.5 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測各管吸光度值(計算時需×2)。按照下述公式進(jìn)行組織勻漿GSH-PX 活力計算:

組織GSH-PX酶活力=[(非酶管OD值-酶管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)] ×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20 umol/L) ×稀釋倍數(shù)(5)/反應(yīng)時間/(取樣量×樣本蛋白含量)

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件(SPSS Inc.Chicago，USA)。多組之間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)中的最小顯著性差異法(LSD-ttest)。數(shù)據(jù)以mean±SD表示，P<0.05或P<0.01，則認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)

大鼠肝臟組織的病理學(xué)HE 染色如圖1所示，空白組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞分界清晰，細(xì)胞核呈圓形，而模型組大鼠肝組織出現(xiàn)大量的肝細(xì)胞炎癥和壞死，炎性細(xì)胞浸潤，以及細(xì)胞核濃縮、破碎或消失。與模型組相比，金櫻子膠囊低、中、高劑量組均可縮小壞死區(qū)面積，減少炎癥發(fā)生，維持肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，對CCl4誘導(dǎo)的損傷有明顯的改善作用。

圖1 金櫻子膠囊對小鼠組織病理學(xué)的影響(×200)Fig 1 Effects of Rosa laevigata Michx capsule on the histopathology in liver of mice (×200)

2.2 金櫻子膠囊對小鼠血清AST和ALT活力的影響

如圖2所示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清中AST和ALT活力顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量組能顯著降低CCl4誘導(dǎo)小鼠血清中AST；中劑量和高劑量組能顯著降低CCl4誘導(dǎo)小鼠血清中ALT的活力，結(jié)果顯示金櫻子膠囊能夠減輕CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。

與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01圖2 金櫻子膠囊對小鼠血清AST和ALT活力的影響Fig 2 Effects of Rosa laevigata Michx capsule on AST and ALT levels in serum of mice

2.3 金櫻子膠囊對小鼠肝組織勻漿MDA含量的影響

金櫻子膠囊對小鼠肝組織勻漿MDA含量的影響結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示，CCl4可使模型組小鼠肝組織勻漿中MDA含量明顯升高(P<0.01)，而金櫻子膠囊中劑量和高劑量組均能降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝組織勻漿中的MDA含量；此外，CCl4誘導(dǎo)的小鼠其肝組織勻漿中T-SOD活力顯著降低(P<0.01)，金櫻子膠囊中劑量和高劑量組均能升高CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝組織勻漿中的T-SOD活力。

2.4 金櫻子膠囊對小鼠肝組織勻漿GSH-PX和GSH活力的影響

與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01圖3 金櫻子膠囊提取物對小鼠肝MDA和T-SOD含量的影響Fig 3 Effects of Rosa laevigata Michx capsule on MDA and T-SOD levels in liver of mice

如圖4所示，CCl4誘導(dǎo)小鼠后，模型組小鼠GSH-PX和GSH活力顯著降低(P<0.01)，金櫻子膠囊能顯著升高GSH-PX和GSH活力，結(jié)果表明金櫻子膠囊能夠通過調(diào)節(jié)GSH的生成，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，調(diào)節(jié)CCl4誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程。

與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01圖4 金櫻子膠囊對小鼠肝GSH-PX和GSH活力的影響Fig 4 Effects of Rosa laevigata Michx capsule on GSH-PX and GSH levels in liver of mice

3 討 論

肝損傷是許多嚴(yán)重肝臟疾病的產(chǎn)生、發(fā)展及最終發(fā)展成為肝功能衰竭的初始環(huán)節(jié)和必經(jīng)之路。通過建立實驗性肝損傷動物模型，對篩選保肝藥物，研究肝病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探索保肝作用原理，具有非常重要的現(xiàn)實意義。CCl4誘導(dǎo)急性化學(xué)性肝損傷是一種經(jīng)典的實驗?zāi)Ｐ?。CCl4的肝毒性損傷機(jī)制主要涉及脂質(zhì)過氧化、核酸低甲基化、活性醛類、共價結(jié)合、Ca2+超載等，而起主導(dǎo)作用產(chǎn)生損傷效應(yīng)的是脂質(zhì)過氧化[10]。

游離基又稱為自由基，氧源性自由基及前體自由基稱為活性氧ROS，體內(nèi)ROS生成與清除基本呈平衡狀態(tài)。細(xì)胞或組織的氧化還原處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，稱之為氧化還原穩(wěn)態(tài)平衡。平衡遭到破壞，其原因可能是由于ROS的生成過多，或者是由于一種或多種抗氧化系統(tǒng)的能力降低或喪失，導(dǎo)致氧化還原的信號穩(wěn)態(tài)失去平衡，平衡遭到破壞會引起某些生理功能的變化，稱為氧化應(yīng)激[2]。

如前所述，CCl4被肝細(xì)胞的混合功能氧化酶CYP450代謝產(chǎn)生毒性活性產(chǎn)物-CCl3自由基和過氧化自由基-CCl3O2，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，近而造成細(xì)胞膜損傷，使肝細(xì)胞內(nèi)的ALT、AST酶大量釋出，引起血清中酶的活性及數(shù)量迅速提高。因此，血清AST、ALT的升高是肝損傷的重要標(biāo)志。脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物MDA能與膜蛋白結(jié)合變性，同時增加膜的通透性，改變細(xì)胞膜、代謝及功能，對機(jī)體造成進(jìn)一步損害[3]。MDA的測定廣泛應(yīng)用于氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損傷實驗驗證，在肝組織中，MDA的含量不僅反映了肝細(xì)胞生物膜脂質(zhì)過氧化的嚴(yán)重程度，而且還反映了肝臟疾病的嚴(yán)重程度。

SOD和GSH-PX等抗氧化酶以及有抗氧化性的小分子有機(jī)物谷胱甘肽GSH可以清除或淬滅ROS，從而減輕ROS對細(xì)胞的損傷。T-SOD是生物體內(nèi)特別重要的ROS清除劑[11-12]，SOD能催化自由基進(jìn)行歧化反應(yīng)，與ROS的濃度呈正相關(guān)，SOD活力的高低能反映機(jī)體清除氧自由基的能力；GSH-PX可特異性地催化GSH對氫過氧化物的還原反應(yīng)，將過氧化氫還原成2分子水從而清除脂質(zhì)過氧化物，抑制氧自由基形成，阻止了生物膜結(jié)構(gòu)和功能遭到ROS的破壞，而且可以保護(hù)其他抗氧化酶的活性；機(jī)體清除ROS的能力可通過SOD和GSH-PX活性來反映[13]。GSH是一種細(xì)胞合成的非酶型抗氧化劑，作為一種可逆的供氫體，通過對巰基氧化還原態(tài)的轉(zhuǎn)換來實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)抗氧化保護(hù)。GSH能夠與過氧化物及自由基相結(jié)合，阻止氧化劑對毓基的破壞，從而保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)及含巰基的酶不被其破壞，同時還可對抗自由基對重要臟器的損害，在活體細(xì)胞抗氧化作用中起著重要的保護(hù)作用。GSH水平的降低意味著機(jī)體抗氧化能力的下降并能夠引發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起自由基的大量增加。因此，通過檢測肝組織中MDA、SOD、GSH-PX和GSH的含量，能很好地檢測肝細(xì)胞的損傷程度。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，金櫻子膠囊可顯著降低CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠血清中升高的ALT、AST水平，改善肝組織損傷，還可降低肝組織中升高的MDA水平，提高肝組織中降低的SOD、GSH-PX的活性和GSH的含量。提示金櫻子膠囊對急性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

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