蔡孟軒，周雅涵，張鴻雁，鄧麗莉，姚世響，曾凱芳*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

蘋(píng)果是重要的溫帶水果，由于其生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)，果品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，被世界上很多的國(guó)家列為主要消費(fèi)果品[1-2]。但其在采后貯運(yùn)過(guò)程中會(huì)受到多種真菌侵染而腐爛變質(zhì)，其中由擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是常見(jiàn)的病害之一[3-5]。P. expansum是產(chǎn)展青霉素的主要菌種，主要通過(guò)侵染的方式導(dǎo)致果實(shí)腐爛[6]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，展青霉素具有致畸、致癌和免疫毒性，且能夠引起一系列急、慢性疾病甚至細(xì)胞水平的突變，對(duì)人體具有一定的危害作用[7]。目前，化學(xué)殺菌劑是控制蘋(píng)果采后青霉病的主要方式之一，如多菌靈、甲基托布津、苯來(lái)特、噻苯咪唑等，但化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期使用對(duì)人類健康和環(huán)境造成了一定的危害，且會(huì)導(dǎo)致微生物產(chǎn)生抗藥性，從而降低防治效果[8]；因此尋找一種新型的防治蘋(píng)果采后青霉病的技術(shù)手段尤為必要。

利用拮抗微生物控制果蔬采后病害是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[9]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在果蔬采后病害控制中具有較好效果的酵母大約有20多種，其主要為假絲酵母屬（Candida）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、畢赤酵母屬（Pichia）、黏紅酵母屬（Rhodotorula）和絲孢酵母屬（Trichosporon）等[9-12]。相關(guān)的研究表明，假絲酵母屬能有效抑制蘋(píng)果采后灰霉病[13-14]、柑橘青霉病和綠霉病[15-16]、桃果實(shí)軟腐病[17]等的發(fā)生。其中齊藤假絲酵母（Candida saitoana）[18-19]和假絲酵母菌CWW-4菌株[20]在病害控制和拮抗機(jī)理方面已被研究得較為清楚。Guerrero等[21]研究發(fā)現(xiàn)，橄欖假絲酵母（Candida oleophila）對(duì)蘋(píng)果青霉病具有一定的抑制作用，且這種抑制作用可能與果實(shí)抗性相關(guān)酶活力變化有關(guān)，但目前關(guān)于其對(duì)蘋(píng)果青霉病的生防機(jī)制研究還不夠系統(tǒng)和深入。因此本實(shí)驗(yàn)以蘋(píng)果為實(shí)驗(yàn)材料，采用C. oleophila對(duì)蘋(píng)果果實(shí)進(jìn)行處理，研究不同處理模式下C. oleophila對(duì)蘋(píng)果青霉病的控制效果，并通過(guò)分析離體條件下C. oleophila對(duì)青霉菌的抑制作用、C. oleophila在蘋(píng)果果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)情況以及果實(shí)傷口周圍抗性相關(guān)酶活力的變化，初步探討C. oleophila控制蘋(píng)果P. expansum發(fā)病的機(jī)制，為蘋(píng)果青霉病的生物防治提供一定的理論參考，也為生防酵母的應(yīng)用提供了技術(shù)支持和理論指導(dǎo)，從而減少化學(xué)殺菌劑的使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

P. expansum分離自發(fā)病蘋(píng)果果實(shí)。采用組織分離法從發(fā)病蘋(píng)果果實(shí)上分離病原菌，并根據(jù)致病性檢測(cè)結(jié)果、病原菌菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果鑒定為P. expansum。

C. oleophila分離自重慶北碚歇馬鎮(zhèn)馮家槽柑橘樹(shù)（錦橙447）葉片表面[22]，根據(jù)分子生物學(xué)鑒定結(jié)果鑒定為C. oleophila。

‘紅富士’蘋(píng)果產(chǎn)自甘肅靜寧，取大小均一、無(wú)機(jī)械傷、成熟度基本一致的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料。

葡萄糖、瓊脂粉、酵母浸膏、牛肉膏、次氯酸鈉成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；BS-4G振蕩培養(yǎng)箱 金壇市富華儀器有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、DZF-6000真空干燥箱、HWS-28數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PSX-280手提式高壓殺菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；XB.K.25型血球計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SL602N高精顯電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；S-4800掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、E-1045型離子濺射儀 日本Hitachi公司；PowerPac電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；G:BOX EF凝膠成像儀英國(guó)Syngene公司；SYNERGYH1MG全自動(dòng)酶標(biāo)儀美國(guó)BioTek公司。

1.3 方法。

1.3.1 C. oleophila懸浮液的制備

懸浮液制作：1）活化菌種：28 ℃條件下，在NYDA培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)C. oleophila 48 h；2）液體培養(yǎng)：挑取一環(huán)NYDA培養(yǎng)基上的C. oleophila于NYDB培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃搖床中培養(yǎng)24 h；3）離心濃縮：4 000 r/min、4 ℃離心10 min，用無(wú)菌水洗滌2 次；4）血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后用無(wú)菌水稀釋到1×108CFU/mL和1×107CFU/mL備用。

1.3.2 P. expansum孢子懸浮液的制備

P. expansum接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d后，用接種環(huán)刮取適量P. expansum，4 層紗布過(guò)濾，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用無(wú)菌水調(diào)整濃度至1×104孢子/mL的孢子懸浮液，待用[23]。

1.3.3 C. oleophila對(duì)蘋(píng)果果實(shí)接種發(fā)病率和病斑直徑影響的測(cè)定

同孔接種和異孔接種實(shí)驗(yàn)：將果實(shí)隨機(jī)分為2 組。用無(wú)菌打孔器在果實(shí)赤道部位等距離打孔（直徑3 mm、深度3 mm），每個(gè)蘋(píng)果打3 個(gè)傷口，每個(gè)處理組果實(shí)傷口處分別加入20 μL下述液體：無(wú)菌水（陽(yáng)性對(duì)照）、1×108CFU/mL C. oleophila懸浮液。同孔處理：4 h后，在果實(shí)傷口處接入20 μL的1×104孢子/mL P. expansum孢子懸浮液。異孔處理：24 h后，在每個(gè)傷口右側(cè)5 mm打一個(gè)同樣大小的孔，在新孔中加入20 μL的1×104孢子/mL P. expansum孢子懸浮液。

浸泡接種實(shí)驗(yàn)：將果實(shí)隨機(jī)分成2 組。將果實(shí)浸泡于下述液體：無(wú)菌水（陽(yáng)性對(duì)照）、1×108CFU/mL C. oleophila懸浮液；2 min后自然晾干。用無(wú)菌打孔器在果實(shí)赤道部位等距離地打傷口（直徑3 mm，深度3 mm），每個(gè)蘋(píng)果打3 個(gè)傷口。24 h后，每個(gè)傷口處分別加入20 μL的1×105孢子/mL P. expansum孢子懸浮液。

待菌液吸收后，單果包裝，置于25 ℃、相對(duì)濕度90%～95%條件下貯藏，定期統(tǒng)計(jì)果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑。發(fā)病率的計(jì)算如下式。每組處理5 個(gè)果實(shí)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 離體條件下C. oleophila對(duì)P. expansum的抑菌作用測(cè)定

1.3.4.1 平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

用無(wú)菌打孔器在裝有20 mL PDA培養(yǎng)基的平板（直徑為90 mm）上打兩個(gè)相距40 mm、直徑10 mm的小孔。在兩組培養(yǎng)基的一孔內(nèi)分別加入0.l mL的無(wú)菌水（陽(yáng)性對(duì)照）和1×108CFU/mL C. oleophila懸浮液。在另一孔內(nèi)均加入20 μL濃度為1×106孢子/mL的P. expansum孢子懸浮液，進(jìn)行平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)。每組處理3 個(gè)培養(yǎng)皿，用Parafilm膜密封后置于25 ℃下培養(yǎng)，20 d后觀察拮抗菌與病原菌的生長(zhǎng)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[24]。

1.3.4.2 C. oleophila揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)P. expansum的抑制作用測(cè)定

采用平板對(duì)扣法。吸取100 μL的無(wú)菌水（陽(yáng)性對(duì)照）和1×108CFU/mL C. oleophila懸浮液，分別涂布于NYDA培養(yǎng)基平板上。將平板至于28 ℃培養(yǎng)48 h后，在另一個(gè)PDA平板中央接入1 μL 1×106孢子/mL的P. expansum孢子懸浮液，兩板對(duì)扣用Parafilm膜密封，置于25 ℃下培養(yǎng)20 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每組處理3 個(gè)培養(yǎng)皿，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[25]。

1.3.5 C. oleophila處理后酵母在蘋(píng)果果實(shí)的生長(zhǎng)情況測(cè)定

1.3.5.1 C. oleophila接種處理后酵母在蘋(píng)果果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)測(cè)定

傷口接種處理：將果實(shí)隨機(jī)分成2 組，接種處理方法同1.3.3節(jié)同孔接種法。待菌液吸收后，單果包裝，貯藏在25 ℃、相對(duì)濕度90%～95%環(huán)境下，以接種后1 h測(cè)定的酵母菌數(shù)為起始值，每天取一次樣，用稀釋平板法測(cè)定酵母數(shù)目。取樣時(shí)，用消毒的打孔器取傷口處直徑為10 mm的果肉組織10 份，放入含10 mL無(wú)菌水的消毒研缽內(nèi)研磨至勻漿，25 ℃條件下培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，結(jié)果以每傷口處酵母數(shù)量為單位（lg（cells/wound））表示，每個(gè)重復(fù)5 個(gè)果實(shí)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[26]。

1.3.5.2 C. oleophila懸浮液浸泡處理后酵母在蘋(píng)果果實(shí)表皮生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)測(cè)定

將果實(shí)浸泡于濃度為1×108CFU/mL C. oleophila懸浮液中2 min，自然晾干。單果包裝后，除取樣操作不同外，其他均同1.3.5.1節(jié)。取樣時(shí)，用消毒的削皮刀削取蘋(píng)果果皮，取2 cm×1 cm的果皮5 份放入含10 mL無(wú)菌水的消毒研缽內(nèi)研磨至勻漿。

1.3.5.3 C. oleophila接種處理后酵母在蘋(píng)果果實(shí)傷口處的定殖情況觀察

傷口接種處理：將果實(shí)隨機(jī)分成2 組，接種處理方法同1.3.3節(jié)同孔接種法。待果實(shí)晾干后單果包裝，置于25 ℃、相對(duì)濕度90%～95%條件下貯藏24 h。

SEM樣品制備：1）樣品取材：每組取3 個(gè)果實(shí)，在果實(shí)傷口處切下大小約3 mm×3 mm×3 mm的組織小塊；2）固定：將組織小塊保存在0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的pH 6.8、體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中過(guò)夜固定，固定液置于4 ℃冰箱中；3）清洗：用上述相同的磷酸緩沖液漂洗至少2 次，待脫水；4）脫水：分別用30%、50%、70%、85%、95%乙醇各脫水一次，100%乙醇脫水2 次，每次脫水時(shí)間為10 min；5）置換：叔丁醇濃度由低至高置換，分別用50%、70%、90%、95%叔丁醇置換一次，100%叔丁醇置換2 次，每次10 min；6）干燥：放入真空干燥箱中干燥，溫度65 ℃，真空度大于0.08 kPa。干燥時(shí)間2 h。將干燥的組織塊用雙面膠粘到金屬臺(tái)上，用離子濺射儀對(duì)金屬臺(tái)噴金、鍍膜。7）觀察、照相[27]。

1.3.6 C. oleophila對(duì)蘋(píng)果果實(shí)相關(guān)防御機(jī)制酶活力影響的測(cè)定

1.3.6.1 樣品處理及取樣

將果實(shí)隨機(jī)分成2 組，接種處理方法同1.3.3節(jié)同孔接種法。待液體吸收后，單果包裝，貯藏在25 ℃、相對(duì)濕度90%～95%環(huán)境下。從第0天開(kāi)始取樣，每隔24 h進(jìn)行一次取樣，連續(xù)取樣6 次，取樣部位為蘋(píng)果果實(shí)打孔傷口周圍1 cm直徑的健康果實(shí)組織。每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)30 個(gè)果實(shí)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。1.3.6.2 過(guò)氧化物酶活力的測(cè)定

過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測(cè)定參照曹建康等[28]的方法并作適當(dāng)改進(jìn)。于470 nm波長(zhǎng)處室溫下測(cè)定反應(yīng)3 min的吸光度變化，以每分鐘吸光度變化1為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6.3 多酚氧化酶活力的測(cè)定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的測(cè)定參照Srivastava等[29]的方法并作適當(dāng)改進(jìn)。于420 nm波長(zhǎng)處室溫下測(cè)定反應(yīng)3 min的吸光度變化，以每分鐘吸光度變化1為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6.4 苯丙氨酸解氨酶活力的測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanin ammonia-lyase，PAL）的測(cè)定參照Assis等[30]的方法并作適當(dāng)改進(jìn)。在室溫下測(cè)定保溫（1h）前后290 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，每小時(shí)每克蘋(píng)果吸光度改變0.01定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Excel 2016軟件統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖；應(yīng)用SPSS 22軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA），利用鄧肯氏多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 C. oleophila對(duì)蘋(píng)果果實(shí)青霉病的控病效果

接種處理后蘋(píng)果果實(shí)的發(fā)病情況如圖1所示。同孔接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C. oleophila處理組果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑顯著低于對(duì)照組果實(shí)（P＜0.05），對(duì)照組果實(shí)在貯藏第4天發(fā)病率達(dá)到100%；而在5 d的貯藏期內(nèi)，C. oleophila處理組果實(shí)均未發(fā)病，說(shuō)明C. oleophila可能與P. expansum間存在競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制了霉菌的生長(zhǎng)。異孔接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第3天和第4天C. oleophila處理組果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑均顯著低于對(duì)照組果實(shí)（P＜0.05）；對(duì)照組果實(shí)在貯藏第4天發(fā)病率達(dá)到100%，而C. oleophila處理組果實(shí)在貯藏第5天發(fā)病率達(dá)到100%；貯藏第4天時(shí)，對(duì)照組果實(shí)發(fā)病率是C. oleophila處理組的1.32 倍，對(duì)照組果實(shí)病斑直徑是C. oleophila處理組的1.56 倍；說(shuō)明拮抗酵母對(duì)果實(shí)自身抗病相關(guān)系統(tǒng)有一定的誘導(dǎo)作用。浸泡接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C. oleophila處理組果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑顯著低于對(duì)照組果實(shí)（P＜0.05）；貯藏第4天時(shí)，對(duì)照組果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑分別是C. oleophila處理組的3.53 倍和3.77 倍。

圖1 C. oleophila對(duì)蘋(píng)果果實(shí)青霉病發(fā)病率和病斑直徑的影響Fig.1 Effect of C. oleophila on disease incidence and lesion diameter of apple with P. expansum inoculation

2.2 離體條件下C. oleophila對(duì)P. expansum的抑菌作用

C. oleophila與P. expansum異孔生長(zhǎng)情況如圖2所示。圖2B結(jié)果表明，C. oleophila周圍無(wú)抑菌圈，證明C. oleophila不產(chǎn)生抑菌次生代謝產(chǎn)物。

圖2 離體條件下C. oleophila對(duì)P. expansum的抑菌作用Fig.2 Antibacterial effect of C. oleophila under in vitro culture conditions

2.3 C. oleophila揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)P. expansum的抑制作用

C. oleophila揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)P. expansum的抑制作用如圖3所示。與對(duì)照組相比，C. oleophila的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)P. expansum的生長(zhǎng)無(wú)顯著抑制作用（P＞0.05）。

圖3 C. oleophila揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)P. expansum的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of volatile components from C. oleophila on P. expansum

2.4 C. oleophila在蘋(píng)果果實(shí)上的生長(zhǎng)狀況

2.4.1 C. oleophila在蘋(píng)果果實(shí)上的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

C. oleophila在蘋(píng)果果實(shí)上的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)如圖4所示。損傷接種處理后蘋(píng)果果實(shí)傷口處酵母的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)結(jié)果（圖4A）表明，C. oleophila能在果實(shí)傷口處迅速定殖、擴(kuò)增。在第2天時(shí)，C. oleophila在蘋(píng)果傷口處的活菌數(shù)達(dá)到最高值，比第0天增加了2.24 lg（cells/wound）；4 d后，C. oleophila的活菌數(shù)保持穩(wěn)定。浸泡處理后蘋(píng)果果皮處酵母的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)（圖4B）結(jié)果表明，C. oleophila能在蘋(píng)果果皮定殖、擴(kuò)增。在貯藏第2天時(shí)，C. oleophila在蘋(píng)果果皮處的活菌數(shù)達(dá)到最高值；3 d后，C. oleophila的活菌數(shù)雖略有下降，但基本保持穩(wěn)定。

圖4 C. oleophila在蘋(píng)果果實(shí)傷口處（A）和果皮處（B）的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)Fig.4 Population dynamics of C. oleophila on apple wounds (A) and apple peel (B) after soaking

2.4.2 果實(shí)傷口處C. oleophila的生長(zhǎng)情況

C. oleophila與病原菌在果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)情況如圖5所示。從圖中可以清晰地看到P. expansum菌絲筆直、粗壯（圖5A）；C. oleophila處理組未能觀察到P. expansum菌絲，C. oleophila在果實(shí)傷口處生長(zhǎng)旺盛、大量繁殖、形態(tài)清晰、結(jié)構(gòu)完整，果實(shí)傷口有大量的酵母附著（圖5B）。

圖5 SEM觀察到的C. oleophila處理組果實(shí)傷口處酵母菌的生長(zhǎng)情況（×4 000）Fig.5 SEM observation of the growth of C. oleophila on apple wounds (× 4 000)

2.5 C. oleophila對(duì)蘋(píng)果果實(shí)抗病相關(guān)酶活力的影響

2.5.1 C. oleophila對(duì)蘋(píng)果果實(shí)POD和PPO活力的影響

C. oleophila對(duì)蘋(píng)果果實(shí)POD和PPO活力的影響如圖6所示，在5 d的貯藏期內(nèi)，兩個(gè)處理組的蘋(píng)果果實(shí)PPO和POD活力均顯著提高（P＜0.05），總體大致呈先上升后下降的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，C. oleophila處理組果實(shí)的PPO和POD活力增加更明顯，且在接種第2天時(shí)，C. oleophila處理組果實(shí)的PPO活力約為對(duì)照組的1.84 倍，POD活力約是對(duì)照組的3.45 倍。

圖6 C. oleophila對(duì)果實(shí)POD（A）和PPO（B）活力的影響Fig.6 Effect of C. oleophila inoculation on POD (A) and PPO (B)activities in apple fruits

2.5.2 C. oleophila對(duì)蘋(píng)果果實(shí)PAL活力的影響

圖7 C. oleophila對(duì)蘋(píng)果果實(shí)PAL活力的影響Fig.7 Effect of C. oleophila inoculation on PAL activity in apple fruits

圖7表明，在5 d的貯藏期內(nèi)，蘋(píng)果果實(shí)的PAL活力總體大致呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)。C. oleophila處理組蘋(píng)果果實(shí)的PAL活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且在接種第2天時(shí)，C. oleophila處理組果實(shí)的PAL活力約為對(duì)照組的2.44 倍。

3 討 論

酵母對(duì)果蔬病害的控制機(jī)制有多種，酵母可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)，分泌抗生素、揮發(fā)性物質(zhì)等方式來(lái)抑制病原菌生長(zhǎng)[31-33]，本研究所使用C. oleophila對(duì)蘋(píng)果青霉病的控制機(jī)制也包括多個(gè)方面。C. oleophila的抑菌機(jī)制主要表現(xiàn)在與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間，其揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)青霉菌的生長(zhǎng)無(wú)顯著抑制作用。本研究中C. oleophila在果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)情況與同孔接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)是酵母抑菌的主要機(jī)制之一。通過(guò)觀察C. oleophila在蘋(píng)果果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)發(fā)現(xiàn)，C. oleophila能在蘋(píng)果果實(shí)傷口處迅速定殖、擴(kuò)增，且在第2天時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最高值，通過(guò)SEM圖可以清晰地看到酵母在果實(shí)傷口處生長(zhǎng)旺盛并大量繁殖，其形態(tài)清晰、結(jié)構(gòu)完整，且果實(shí)傷口處有大量的酵母附著。因此，可初步推斷C. oleophila對(duì)P. expansum的主要抑菌機(jī)制為：C. oleophila在果實(shí)傷口迅速生長(zhǎng)，果實(shí)傷口處的空間被C. oleophila占據(jù)，使P. expansum不能與果實(shí)傷口接觸，無(wú)法吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，抑制P. expansum的快速生長(zhǎng)繁殖，從而控制果實(shí)青霉病的發(fā)生。

異孔損傷接種實(shí)驗(yàn)表明，C. oleophila處理對(duì)蘋(píng)果青霉病有著較好的控制效果，經(jīng)C. oleophila處理的果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑顯著低于對(duì)照組果實(shí)（P＜0.05）。誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗性是拮抗酵母控制果實(shí)病害的主要機(jī)制之一[34]。通常拮抗酵母通過(guò)誘導(dǎo)蘋(píng)果POD、PPO活力的升高，以及木質(zhì)素的大量積累，增加果實(shí)抗病性[35]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)用C. oleophila作用于蘋(píng)果果實(shí)時(shí)，在5 d的貯藏期內(nèi)果實(shí)PPO、POD活力顯著提高（P＜0.05），且在貯藏第2天達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的1.84 倍和3.45 倍。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它與植物抗毒素和酚類化合物的形成有著密切的關(guān)系，通過(guò)促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的生成來(lái)提高果實(shí)的誘導(dǎo)抗病性[36]。在本實(shí)驗(yàn)中，C. oleophila能顯著提高果實(shí)的PAL活力（P＜0.05），在貯藏第2天時(shí)為對(duì)照組的2.44 倍，這與Wisniewski等[8]的研究類似。

浸泡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)C. oleophila浸泡處理的蘋(píng)果果實(shí)青霉病的發(fā)病率和病斑直徑都顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還研究了C. oleophila懸浮液浸泡處理后酵母在蘋(píng)果果實(shí)表皮生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，C. oleophila能在蘋(píng)果果皮定殖、擴(kuò)增；因此推測(cè)C. oleophila能夠通過(guò)穩(wěn)定附著于蘋(píng)果果皮抑制果實(shí)青霉病的發(fā)生。

綜上所述，C. oleophila對(duì)于抑制蘋(píng)果果實(shí)青霉病的發(fā)病進(jìn)程具有較好的效果，其控制蘋(píng)果青霉病發(fā)病的機(jī)制包括誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗性，以及與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間。通過(guò)比較不同處理模式下C. oleophila對(duì)蘋(píng)果青霉病的控制效果，發(fā)現(xiàn)C. oleophila在同孔接種處理下比異孔接種處理對(duì)蘋(píng)果青霉病的發(fā)病進(jìn)程具有更好的控制作用，并且C. oleophila不能通過(guò)分泌抗生素、揮發(fā)性物質(zhì)等方式來(lái)抑制P. expansum的生長(zhǎng)；說(shuō)明C. oleophila主要是通過(guò)營(yíng)養(yǎng)與空間競(jìng)爭(zhēng)抑制蘋(píng)果青霉病的發(fā)生。通過(guò)浸泡接種的處理方式，模擬實(shí)際生產(chǎn)中C. oleophila對(duì)蘋(píng)果青霉病發(fā)病進(jìn)程的控制，將蘋(píng)果浸泡于C. oleophila懸浮液中，C. oleophila能穩(wěn)定附著于蘋(píng)果果皮表面，當(dāng)蘋(píng)果受到機(jī)械傷時(shí)，C. oleophila能夠穩(wěn)定附著于蘋(píng)果果皮，從而抑制果實(shí)青霉病的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，C. oleophila作為控制果蔬采后病害的生物拮抗菌，其主要通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)成分和空間、提高果蔬抗病相關(guān)酶活性來(lái)控制果蔬采后病害的發(fā)生。因此，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中可以將C. oleophila與其他物質(zhì)進(jìn)行復(fù)配以增加酵母在蘋(píng)果果皮的數(shù)量，從而增強(qiáng)酵母的生防效果。

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