阮海華，胡雙艷，張春晨，余 龍，張 真

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，是EGFR Her家族成員之一，該家族包括EGFR（ErbB-1）、HER2/c-neu（ErbB-2）、Her 3（ErbB-3）和Her 4（ErbB-4）[1]。表皮生長(zhǎng)因子是一個(gè)分子質(zhì)量約為170 kDa的跨膜糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性。在表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）或者轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α（transforming growth factor α，TGFα）等的激活下，受體發(fā)生二聚化，從而改變了受體的構(gòu)象，激活酪氨酸激酶活性，催化EGFR的磷酸化激活[2]。EGFR廣泛分布在許多正常和惡性上皮細(xì)胞中，其過度表達(dá)和自我激活可能與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[3]。研究表明，頭頸部腫瘤[4]、乳腺癌[5]、陰莖鱗狀細(xì)胞癌[6]以及肺癌[7]等均被發(fā)現(xiàn)EGFR的高水平表達(dá)。與EGFR蛋白的高表達(dá)相比，EGFR的過度磷酸化激活也是導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變的關(guān)鍵因素之一?；诖?，目前針對(duì)EGFR的抗癌藥物研發(fā)主要從2 個(gè)方面出發(fā)：一方面是專一性識(shí)別EGFR的單克隆抗體，這類抗體能夠與EGFR專一性結(jié)合，封閉EGFR的胞外配體識(shí)別表位，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制EGF等配體與EGFR結(jié)合以及由此導(dǎo)致的磷酸化激活[8]；另一方面是EGFR酪氨酸激酶抑制劑，其通過抑制酪氨酸激酶活性抑制EGFR的磷酸化，進(jìn)而調(diào)控受EGFR磷酸化控制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制癌細(xì)胞的增殖[9]。

單寧酸（tannic acid，TA），又稱中國(guó)單寧、鞣酸、五棓子單寧酸，化學(xué)式為C76H52O46，結(jié)構(gòu)如圖1所示。一般認(rèn)為其結(jié)構(gòu)是由葡萄糖的5 個(gè)羥基和沒食子?；Y(jié)合而成的酯，屬于水解類單寧，可水解為葡萄糖和沒食子酸。單寧酸屬于易溶于水的植物多酚類化合物，在紅葡萄酒、茶葉、水果中均含量較多，具有抗突變[10]、抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、抗菌[13]等生物學(xué)活性。近年來，除了自由基清除和抗氧化功能，單寧酸在抗腫瘤方面的功能愈加獲得人們的關(guān)注[14]。然而，基于單寧酸的結(jié)構(gòu)，其難以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，迄今為止，單寧酸實(shí)現(xiàn)跨膜信號(hào)傳遞的分子機(jī)制仍不清楚。最新的研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸能夠作用于乳腺癌細(xì)胞EGFR，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。已知EGFR的過表達(dá)和過度激活是調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的重要因素。例如，接近40%～50%的膠質(zhì)瘤細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)EGFR的表達(dá)增加和過度激活[16]。因此，本研究以人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞為研究對(duì)象，探究單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，為深入挖掘單寧酸抗腫瘤的藥理作用，闡述食品中單寧酸的抗癌功效提供理論依據(jù)。

圖1 單寧酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of tannic acid

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

單寧酸（CAS號(hào)1401-55-4，相對(duì)分子質(zhì)量為1 701.20） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞由東京大學(xué)醫(yī)學(xué)院Inoue教授提供；Gibco胎牛血清 美國(guó)Thermo Fisher公司；HyClone? DMEM高糖培養(yǎng)基 美國(guó)GE Healthcare公司；EGF 北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；PathScan?磷酸化EGFR panTyr三明治酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、磷酸化EGFR（Tyr845）抗體、磷酸化EGFR（Tyr1068）抗體、磷酸化EGFR（Tyr1045）抗體、磷酸化EGFR（Tyr992）抗體、EGFR抗體、磷酸化胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）抗體、ERK抗體、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator transcription，STAT）1 pY705抗體、STAT3抗體、STAT1抗體 美國(guó)Cell Signaling Technology公司；微管蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白、Bcl-2相關(guān)X（Bcl-2 associated X，Bax）蛋白、線粒體電壓依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）蛋白、細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)二抗 美國(guó)Santa Cruz Technology公司；電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒 威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司；G3850 3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS）細(xì)胞增殖試劑盒 美國(guó)Promega公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)皿等細(xì)胞培養(yǎng)耗材 美國(guó)Corning公司；HERACELL 150iCO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Fisher公司；SpectraMax M5多功能讀板機(jī) 美國(guó)Molecular Device公司；Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)印槽、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；AlphaImager Mini凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Protein Simple公司；5430R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）中，并置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25 g/100 mL胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)單層細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行單寧酸處理。處理培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基內(nèi)含相應(yīng)濃度單寧酸（40、80、120 μmol/L），每組3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，并收集至離心管中。

1.3.2 人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖能力的測(cè)定

人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞以6×104個(gè)/mL的濃度接種于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL培養(yǎng)基。24 h后吸棄培養(yǎng)基，分別加入100 μL含不同濃度單寧酸（40、80、120 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，每組3 個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。采用MTS細(xì)胞增殖試劑盒根據(jù)OD490nm測(cè)定細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞存活率按下式計(jì)算。

1.3.3 人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR酪氨酸位點(diǎn)磷酸化水平的測(cè)定

獲取引發(fā)式語(yǔ)料的方法主要有口頭報(bào)告、角色扮演、話語(yǔ)補(bǔ)全任務(wù)、多項(xiàng)選擇任務(wù)、分級(jí)任務(wù)、訪談和日記等。下面逐一介紹這些方法，重在講明它們各自的適用范圍和所針對(duì)的目標(biāo)語(yǔ)料，因?yàn)橹挥忻鞔_了每種方法能做什么和不能做什么，善做什么和不善做什么，才能根據(jù)具體研究問題選擇具體研究工具，才能發(fā)揮每種工具的最大效用，做到對(duì)癥下藥，有的放矢。

將單寧酸處理后的細(xì)胞按照PathScan?磷酸化EGFR（panTyr）三明治ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行總酪氨酸磷酸化水平的檢測(cè)。

1.3.4 亞細(xì)胞組分（線粒體、細(xì)胞胞漿）的分離

經(jīng)單寧酸處理后人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的亞細(xì)胞組分的分離參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。

1.3.5 蛋白質(zhì)印記法

檢測(cè)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR Y884、Y992、Y1068以及Y1172位點(diǎn)的磷酸化水平，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2以及Cyt c等均采用蛋白質(zhì)印記法。細(xì)胞處理方法同1.3.1節(jié)，收集細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[18]的方法制備蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂乳粉封閉。將一抗按照體積比1∶1 000稀釋后于4 ℃孵育過夜。以TBST（tris buffered saline with Tween）溶液洗滌3 次后加入體積比1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h。采用ECL試劑顯影曝光后洗X光片，利用Alpha Imager Mini凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定條帶的灰度值，利用灰度值表征條帶的強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS V18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)通過the Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3 次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖活性的影響

圖2 單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of tannic acid on the proliferation of human glioma U87 cells

通過MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖2所示。與未處理的對(duì)照組細(xì)胞相比，40 μmol/L的單寧酸處理24 h后，顯著誘導(dǎo)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的死亡（P＜0.05），并且細(xì)胞死亡的比率隨著單寧酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)（48～72 h）以及單寧酸濃度的升高（80～120 μmol/L）而升高，呈現(xiàn)顯著的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。即單寧酸的濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)，人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的死亡率越高，這與Darvin等[15]發(fā)現(xiàn)單寧酸能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的結(jié)果類似。結(jié)果表明，單寧酸能夠抑制人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，抗腫瘤效果顯著。

圖3 單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白的影響Fig.3 Effect of tannic acid on apoptosis-related proteins in human glioma U87

由圖3可知，與對(duì)照組相比，80 μmol/L單寧酸處理顯著促進(jìn)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)2 種蛋白的條帶灰度進(jìn)行掃描后計(jì)算Bax/Bcl-2的比值，結(jié)果如圖4所示。

80 μmol/L單寧酸處理24～72 h后，提高了Bax/Bcl-2的比值，與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）。單寧酸處理48 h，Bax/Bcl-2比值被提高接近至7.3 倍。Bax/Bcl-2比值是表征細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)之一，當(dāng)Bax/Bcl-2比值升高時(shí)，暗示細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。同時(shí)，進(jìn)一步分離細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞胞漿2 個(gè)組分發(fā)現(xiàn)，單寧酸處理提高了線粒體Bax蛋白的水平，同時(shí)促進(jìn)了Cyt c向細(xì)胞胞漿中分泌[20]。因此推測(cè)，單寧酸抑制人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖可能與單寧酸處理誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。

圖4 單寧酸處理對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞總Bax/Bcl-2比值的影響Fig.4 Effect of tannic acid on Bax/Bcl-2 ratio in human glioma U87 cells

2.2 單寧酸選擇性抑制人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR特定位點(diǎn)的磷酸化

與EGFR蛋白的高表達(dá)相比，EGFR的磷酸化激活是導(dǎo)致細(xì)胞癌變、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的重要因素[21]。為了研究單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR磷酸化的調(diào)控作用，本研究利用通路掃描磷酸化EGFR三明治ELISA試劑盒檢測(cè)了EGFR總磷酸化水平，結(jié)果如圖5所示。

圖5 單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR總磷酸化水平的影響Fig.5 Effect of tannic acid on the whole phosphorylation of EGFR in human glioma U87 cells

80 μmol/L單寧酸處理24 h后極顯著降低了經(jīng)表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的EGFR磷酸化水平，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，單寧酸對(duì)EGFR磷酸化的抑制程度更加顯著。結(jié)果表明，單寧酸抑制人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR總酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平。

圖6 單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR特定位點(diǎn)磷酸化的影響Fig.6 Site-specif i c effect of tannic acid on EGFR phosphorylation in human glioma U87 cells

鑒于EGFR不同位點(diǎn)的磷酸化與不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相偶聯(lián)，因此，為了進(jìn)一步深入研究單寧酸的抗腫瘤功能，實(shí)驗(yàn)篩選出EGFR的Y845、Y992、Y1068和Y1045這4 個(gè)具有代表性的位點(diǎn)，并檢測(cè)了單寧酸對(duì)EGFR單一位點(diǎn)磷酸化的影響。

圖7 Western-Blot灰度掃描定量分析單寧酸對(duì)EGFR特定位點(diǎn)磷酸化的影響Fig.7 Quantitative analysis of tannic acid on site-specif i c phosphorylation of EGFR in human glioma U87 cells by western blot

由圖6～7可知，單寧酸處理顯著抑制了EGFR Y1045以及Y1068位點(diǎn)的磷酸化，但是對(duì)EGFR Y845以及Y992位點(diǎn)的磷酸化影響不大。結(jié)果表明，單寧酸抑制人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EGFR的磷酸化具有位點(diǎn)選擇性。

2.3 單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞ERK和STAT1/3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響

已有研究表明，EGFR不同位點(diǎn)的磷酸化與不同的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相偶聯(lián)，例如EGFR Y1045位點(diǎn)的磷酸化介導(dǎo)STAT1/3的磷酸化，進(jìn)而激活受STAT1/3調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[22]；EGFR/ERK信號(hào)通路是控制細(xì)胞增殖的重要途徑，其過量表達(dá)與激活易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[9]。而EGFR Y1068位點(diǎn)的磷酸化能夠招募生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor-bound protein 2，Grb2）蛋白，激活MAPK/ERK的磷酸化[23]。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證單寧酸對(duì)EGFR特定位點(diǎn)的磷酸化調(diào)節(jié)作用，實(shí)驗(yàn)利用單寧酸處理人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后，檢測(cè)STAT1/3以及ERK的磷酸化激活情況。

圖8 單寧酸對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞ERK以及STAT1/3磷酸化的影響Fig.8 Effect of tannic acid on the phosphorylation of ERK and STAT1/3 in human glioma U87 cells

由圖8可知，單寧酸顯著抑制了ERK、STAT1以及STAT3的磷酸化，這與單寧酸抑制EGFR Y1068和Y1045的磷酸化結(jié)果一致。結(jié)果表明，單寧酸通過抑制EGFR特異位點(diǎn)的磷酸化進(jìn)而抑制了由該位點(diǎn)介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化。

3 討 論

植物多酚的抗腫瘤活性己被廣泛認(rèn)可，大量研究證實(shí)，許多植物多酚（如白藜蘆醇、姜黃素、原花青素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素等）[24]可以通過干擾或阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游效應(yīng)分子的表達(dá)，從而加速腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖，達(dá)到抗腫瘤的作用。植物單寧酸也能夠通過多種信號(hào)通路發(fā)揮其抗腫瘤作用[25]。然而，單寧類物質(zhì)如何實(shí)現(xiàn)跨膜的信號(hào)傳遞一直不清楚。雖然，Darvin等[15]的研究表明，單寧酸可能通過調(diào)控EGFR的磷酸化發(fā)揮其抗腫瘤作用。但是，目前已經(jīng)報(bào)道的EGFR發(fā)生磷酸化激活的位點(diǎn)有多個(gè)，主要包括Y845、Y992、Y1045、Y1068、Y1148、Y1173以及Y1086等，且每一個(gè)酪氨酸位點(diǎn)的生物學(xué)功能均不同[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸顯著抑制了由EGF誘導(dǎo)的EGFR全位點(diǎn)的磷酸化水平，但是該抑制作用具有明顯的選擇性，單寧酸能夠選擇性抑制EGFR Y1045和Y1068位點(diǎn)的磷酸化，而對(duì)Y845和Y992的影響不大。

EGFR蛋白主要包括3 個(gè)結(jié)構(gòu)域：從NH2端至第621位氨基酸殘基的胞外區(qū)、從621位至644位氨基酸殘基的跨膜結(jié)構(gòu)域以及從644至C末端共計(jì)542 個(gè)氨基酸殘基的胞內(nèi)區(qū)。TGFα與EGFR結(jié)合后，即EGFR主要以背靠背的方式發(fā)生二聚化（圖9a、b中A和B），而配體TGFα結(jié)合于二聚體的外側(cè)（圖9a、b中C和D）[27]，二聚化的EGFR在其C末端胞內(nèi)區(qū)發(fā)生磷酸化激活，調(diào)控下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Darvin等[15]利用Autodock vina分子模擬軟件，將EGFR胞外區(qū)與單寧酸進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果如圖10所示，單寧酸能夠與EGFR胞外區(qū)結(jié)合，并預(yù)測(cè)單寧酸的結(jié)合位點(diǎn)為EGFR上ATP結(jié)合位點(diǎn)。

圖9 EGFR胞外區(qū)與TGFα結(jié)合后形成二聚體的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)圖（a）和分子互作示意圖（b）[27]Fig.9 Crystal structure of dimerized human EGFR extracellular domain when binding to TGFα ligand (a) and diagram of EGFR and TGFα interaction (b)[27]

圖10 單寧酸與EGFR胞外區(qū)結(jié)合結(jié)構(gòu)圖[15]Fig.10 Schematic of tannic acid binding to EGFR extracellular domain[15]

據(jù)此，推測(cè)單寧酸抑制EGFR的磷酸化可能有兩個(gè)方面的原因：一方面，單寧酸競(jìng)爭(zhēng)性地與EGFR結(jié)合改變EGFR的構(gòu)象，單寧酸屬于多酚類物質(zhì)，多酚可通過疏水鍵向蛋白質(zhì)分子表面靠近，多酚分子進(jìn)入疏水袋，然后發(fā)生多點(diǎn)氫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，促使蛋白質(zhì)被凝固[14]，改變其在細(xì)胞膜上的流動(dòng)性，進(jìn)而抑制了EGFR的生物學(xué)活性，例如EGFR胞內(nèi)區(qū)的磷酸化，這解釋了單寧酸對(duì)EGFR總磷酸化水平的抑制作用；另一方面，通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，與圖10預(yù)測(cè)的單寧酸與EGFR相互作用類似，治療小細(xì)胞肺癌的藥物吉非替尼[28]和厄洛替尼[29]也是通過與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EGFR酪氨酸激酶區(qū)，阻止EGFR的自磷酸化，從而抑制受EGFR調(diào)控的信號(hào)通路，最終達(dá)到抑制腫瘤增殖的作用。據(jù)此推測(cè)，單寧酸對(duì)STAT1/3信號(hào)通路的抑制作用可能是由于單寧酸與EGFR結(jié)合后，抑制了EGFR的自磷酸化，而該自磷酸化的抑制會(huì)導(dǎo)致Janus酪氨酸激酶（Janus tyrosine kinase，Jak）2活性受到抑制，而Jak2是負(fù)責(zé)STAT蛋白磷酸化的主要蛋白激酶之一[10]。而單寧酸對(duì)MAPK/ERK信號(hào)通路的抑制作用可能是由于單寧酸抑制了EGFR Y1068的磷酸化，導(dǎo)致Y1068位點(diǎn)專一性Grb2蛋白至EGFR的招募受到抑制，與EGFR-Grb2結(jié)合ERK蛋白減少，ERK的磷酸化受到抑制。當(dāng)利用外源單寧酸處理細(xì)胞時(shí)，單寧酸直接作用于EGFR的胞外區(qū)。因此，單寧酸與EGFR胞外區(qū)結(jié)合后有很大的可能性會(huì)引起EGFR特定構(gòu)象變化，該構(gòu)象的變化引起EGFR部分酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生旋轉(zhuǎn)扭曲，進(jìn)而導(dǎo)致該位點(diǎn)的磷酸化受到抑制。而受單寧酸調(diào)控的EGFR的構(gòu)象變化還需要進(jìn)一步深入研究。

除了誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖外，單寧酸已經(jīng)被用于很多疾病的治療中。例如Mori等[30]利用30 mg/kg（以體質(zhì)量計(jì)，下同）的TA能夠阻止阿茲海默癥引起的細(xì)胞損傷；40 mg/kg的TA對(duì)抗癌藥物順鉑引起的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用[31]；25 mg/kg的TA對(duì)對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen）引起的大鼠肝細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用[32]。而本研究中，40 μmol/L單寧酸（相當(dāng)于68 μg/mL血藥濃度）即對(duì)細(xì)胞增殖起到顯著的抑制作用，進(jìn)一步表明單寧酸在抑制腫瘤細(xì)胞增殖中應(yīng)用的可行性，為挖掘植物多酚的抗腫瘤功能，開發(fā)植物多酚類抗腫瘤保健食品或藥物提供理論基礎(chǔ)。

[1] RYU J W, CHOE S, RYU S H, et al. Paradoxical induction of growth arrest and apoptosis by EGF via the up-regulation of PTEN by activating Redox factor-1/Egr-1 in human lung cancer cells[J].Oncotarget, 2016, 8(3): 4181-4195. DOI:10.18632/oncotarget.13809.

[2] WONG A J, RUPPERT J M, BIGNER S H, et al. Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89(7): 2965-2969.

[3] HANAHAN D, WEINBERG R A. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell, 2011, 144(5): 646-674. DOI:10.4161/rna.20481.

[4] LEEMANS C R, BRAAKHUIS B J, BRAKENHOFF R H. The molecular biology of head and neck cancer[J]. Nature Reviews Cancer,2011, 11(1): 9-22. DOI:10.1038/nrc2982.

[5] DAI H, GALLAGHER D, SCHMITT S, et al. Role of miR-139 as a surrogate marker for tumor aggression in breast cancer[J]. Human Pathology, 2017, 61: 68-77. DOI:10.1016/j.humpath.2016.11.001.

[6] PETA E, CAPPELLESSO R, MASI G, et al. Down-regulation of microRNA-146a is associated with high-risk human papillomavirus infection and epidermal growth factor receptor overexpression in penile squamous cell carcinoma[J]. Human Pathology, 2016, 61: 33-40. DOI:10.1016/j.humpath.2016.10.019.

[7] XU C R, ZHONG W Z, ZHOU Q, et al. Heterogeneity of the resistance to gef i tinib treatment in a non-small cell lung cancer patient with active epidermal growth factor receptor mutation[J]. Thoracic Cancer, 2016, 8(1): 51-53. DOI:10.1111/1759-7714.12382.

[8] GUEERRAB A E I, BAMDAD M, BIGNON Y J, et al. Anti-EGFR monoclonal antibodies enhance sensitivity to DNA-damaging agents in BRCA1-mutated and PTEN-wild-type triple-negative breast cancer cells[J]. Molecular Carcinogenesis, 2016, 56(5): 1383-1394.DOI:10.1002/mc.22596.

[9] CHENG L, ZHANG S, ALEXANDER R, et al. The landscape of EGFR pathways and personalized management of non-small-cell lung cancer[J]. Future Oncology, 2011, 7(4): 519-541. DOI:10.2217/fon.11.25.

[10] PARK J H, DARVIN P, LIM E J, et al. Hwanggeumchal sorghum induces cell cycle arrest, and suppresses tumor growth and metastasis through Jak2/STAT pathways in breast cancer xenografts[J]. PLoS ONE, 2012, 7(7): 1-13. DOI:10.1371/journal.pone.0040531.

[11] TOMAS-BARBERAN F A, SELMA M V, ESPíN J C, et al.Interactions of gut microbiota with dietary polyphenols and consequences to human health[J]. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care, 2016, 19(6): 471-476. DOI:10.1097/MCO.0000000000000314.

[12] TATULLO M, SIMONE G M, TARULLO F, et al. Antioxidant and antitumor activity of a bioactive polyphenolic fraction isolated from the brewing process[J]. Scientif i c Reports, 2016, 6: 1-7. DOI:10.1038/srep36042.

[13] TALEB H, MADDOCKS S E, MORRIS R K, et al. The Antibacterial activity of date syrup polyphenols against S. aureus and E. coli[J].Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 1-9. DOI:10.1038/srep36042.

[14] SHIN S Y, YOON H, AHN S, et al. Structural properties of polyphenols causing cell cycle arrest at G1 phase in HCT116 human colorectal cancer cell lines[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(8): 16970-16985. DOI:10.3390/ijms140816970.

[15] DARVIN P, JOUNG Y H, KANG D Y, et al. Tannic acid inhibits EGFR/STAT1/3 and enhances p38/STAT1 signalling axis in breast cancer cells[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2017,21(4): 720-734. DOI:10.1111/jcmm.13015.

[16] NISHIKAWA R, JI X D, HARMON R C, et al. A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994, 91(16): 7727-7731.

[17] WEST A P, BRODSKY I E, RAHNER C, et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS[J]. Nature, 2011, 472: 476-480. DOI:10.1038/nature09973.

[18] RUAN H H, ZHANG Z, TIAN L, et al. The Salmonella effector SopB prevents ROS-induced apoptosis of epithelial cells by retarding TRAF6 recruitment to mitochondria[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 478(2): 618-623. DOI:10.1016/j.bbrc.2016.07.116.

[19] UM H D. Bcl-2 family proteins as regulators of cancer cell invasion and metastasis: a review focusing on mitochondrial respiration and reactive oxygen species[J]. Oncotarget, 2016, 7(5): 5193-5203.DOI:10.18632/oncotarget.6405.

[20] BURRI S H, KIM C N, FANG G, et al. ‘Loop’ domain deletional mutant of Bcl-xL is as effective as p29Bcl-xL in inhibiting radiationinduced cytosolic accumulation of cytochrome c (cyt c), caspase-3 activity, and apoptosis[J]. International Journal of Radiation Oncology,Biology, Physics, 1999, 43(2): 423-430.

[21] TANG N, ZHANG Q Q, FANG S, et al. Anti-tumor activity of highdose EGFR tyrosine kinase inhibitor and sequential docetaxel in wild type EGFR non-small cell lung cancer cell nude mouse xenografts[J].Oncotarget, 2016, 8(6): 9134-9143. DOI:10.18632/oncotarget.13327. 22.

[22] ZULKIFLI A A, TAN F H, PUTOCZKI T L, et al. STAT3 signaling mediates tumour resistance to EGFR targeted therapeutics[J].Molecular and Cellular Endocrinology, 2017, 451: 15-23.DOI:10.1016/j.mce.2017.01.010.

[23] BAUMDICK M, BRGUUEMANN Y, SCHMICK M, et al. EGF-dependent re-routing of vesicular recycling switches spontaneous phosphorylation suppression to EGFR signaling[J]. eLife, 2015, 4:e12223. DOI:10.18632/oncotarget.13809.24.

[24] 石芳, 廖霞, 李瑤, 等. 植物多酚通過PI3K/Akt信號(hào)通路抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(15): 259-264. DOI:10.7506/spk xl002-6630-201615044.201615044.

[25] 張小利, 王慧清, 張?jiān)虑? 等. 植物多酚通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(5): 227-232.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201505042.

[26] MORANDELL S, STASYK T, SKVORTSOV S, et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics reveal novel insights into complexity and dynamics of the EGFR signaling network[J].Proteomics, 2008, 8(21): 4383-4401. DOI:10.1002/pmic.200800204.

[27] GARRETT T P, MCKERN N M, LOU M, et al. Crystal structure of a truncated epidermal growth factor receptor extracellular domain bound to transforming growth factor alpha[J]. Cell, 2002, 110(6): 763-773.

[28] MASSA A, ANTUNES A, VARELA P. Pyogenic granuloma in a patient on gefitinib[J]. Acta Medica Portuguesa, 2016, 29(6): 416.DOI:10.20344/amp.6343.

[29] ZHAO C H, LIN L, LIU J Z, et al. A phase Ⅱ study of concurrent chemoradiotherapy and erlotinib for inoperable esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2016, 7(35): 57310-57316.DOI:10.18632/oncotarget.9809.

[30] MORI T, REZAI-ZADEH K, KOYAMA N, et al. Tannic acid is a natural beta-secretase inhibitor that prevents cognitive impairment and mitigates Alzheimer-like pathology in transgenic mice[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(9): 6912-6927. DOI:10.1074/jbc.M111.294025.

[31] AKOMOLAFE S F, AKINYEMI A J, ANADOZIE S O. Phenolic acids (gallic and tannic acids) modulate antioxidant status and cisplatin induced nephrotoxicity in rats[J]. International Scholarly Research Notices, 2014, 2014: 1-8. DOI:10.1155/2014/984709.

[32] MITTAL D K, JOSHI D, SHUKLA S. Protective effects of Polygonum bistorta (Linn.) and its active principle against acetaminophen induced toxicity in rats[J]. Asian Journal of Biological Sciences, 2010, 1: 951-958. DOI:10.1016/j.toxlet.2011.05.809.