任廷遠，闞建全*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）是蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）植物，其果實是我國傳統(tǒng)的“八大調(diào)味品”之一，也是我國傳統(tǒng)中藥?；ń吩谌澜缂s有250 種，主要分布在非洲、亞洲、美洲及大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]?，F(xiàn)在研究報道的花椒麻素主要有山椒素等14 種[2]，主要包括α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素以及它們在氨基部分含有一個羥基的同系物[3-4]。

目前關(guān)于花椒麻素對機體功能的研究主要集中在減肥、降脂、抗氧化、降血糖等方面[5-7]。其中關(guān)于花椒麻素促進體內(nèi)脂肪的氧化，減少脂肪沉積和血漿中甘油三酯濃度的效果的研究較多。2014年，陳朝軍等[8]發(fā)現(xiàn)灌胃不同配比的花椒麻素與辣椒素能延緩大鼠的體質(zhì)量增加，降低大鼠的血脂和肝脂水平，減輕大鼠的脂肪肝癥狀，對膽固醇代謝循環(huán)有較好效果；2014年，呂嬌[9]研究表明，麻味麻素可升高高脂血癥大鼠回腸膽汁酸代謝基因表達和降低高脂血癥大鼠肝臟內(nèi)膽固醇代謝基因表達，降低其體內(nèi)血脂、肝脂含量，從而調(diào)節(jié)膽固醇在體內(nèi)的代謝循環(huán)作用；2014年，任文瑾[10]研究表明，花椒精、花椒揮發(fā)油和花椒麻素均有調(diào)節(jié)血脂的作用，作用效果花椒麻素＞花椒精＞花椒揮發(fā)油，花椒麻素與花椒精調(diào)節(jié)肝臟膽固醇代謝的效果相近，但花椒麻素降低甘油三酯的效果優(yōu)于花椒精。然而花椒麻素降脂過程中如何促進蛋白沉積并不明確，嚴重防礙了花椒麻素生理功能的全面評價，因此有必要研究花椒麻素對機體蛋白質(zhì)代謝的影響及機理，為花椒麻素在醫(yī)藥上的應(yīng)用提供科學(xué)的理論參考。肝臟是哺乳動物蛋白質(zhì)代謝最活躍的器官，蛋白質(zhì)代謝的許多重要反應(yīng)都是在肝臟中進行的；肌肉是貯存氨基酸的主要場所，其氨基酸含量占氨基酸代謝庫的50%～75%[11]?，F(xiàn)已研究證實，胰島素樣生長因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）是主要由肝臟分泌的調(diào)控動物生長發(fā)育的關(guān)鍵因子，對蛋白質(zhì)代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[12]。肌肉質(zhì)量的增長是蛋白質(zhì)沉積的最直觀表現(xiàn)之一，而肌肉的發(fā)育受到肌細胞生成素（myogenin，MyoG）等肌肉生長調(diào)控因子的調(diào)節(jié)[13]。前期的實驗發(fā)現(xiàn)花椒麻素可以增加SD大鼠相對骨骼肌的質(zhì)量，但具體機理十分不清楚。因此，本實驗以健康SD雄性大鼠為動物模型，采用熒光實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）方法，研究花椒麻素對機體蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因的影響，初步探討花椒麻素對SD大鼠蛋白質(zhì)代謝的機理。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SD雄性大鼠（動物許可證號：SCXK（渝）20120008，體質(zhì)量120～140 g，40 只） 重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。

花椒麻素由實驗室自制，純度為95.7%。

大鼠基礎(chǔ)飼料 重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司；總蛋白質(zhì)（total protein，TP）、血尿素氮（blood urine nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）等指標測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；IGF-Ⅰ的測定試劑盒美國ADL公司；[14C]-苯丙氨酸 中國原子能科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

3-18K冷凍離心機 德國Sigma公司；7020全自動生化分析儀、L-8800全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；H1MG酶標儀 美國基因有限公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；NanoDrop 1000微量紫外分光光度計 美國Thermo公司；S1000梯度PCR儀美國Bio-Rad公司；Light Cycler Nano qPCR儀 美國羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養(yǎng)與樣品采集

動物實驗過程遵循現(xiàn)行的經(jīng)西南大學(xué)動物保護委員會批準的動物保護法。將40 只SD雄性大鼠按體質(zhì)量隨機分為空白對照組、花椒麻素高劑量組（8 mg/（kg·d））、中劑量組（4 mg/（kg·d））和低劑量組（2 mg/（kg·d）），各組10 只。每只大鼠分別飼養(yǎng)在不銹鋼籠里（25 cm×15 cm×15 cm），控制恒溫恒濕的房間，溫度保持在（25±1）℃，相對濕度55%，從早上7點開始12 h為周期循環(huán)晝夜。每天15：00對實驗組灌胃花椒麻素，花椒麻素需溶于大豆油中配成溶液。灌胃劑量均為0.1 mL/100 g（以體質(zhì)量計），空白對照組灌胃等劑量的大豆油。飼養(yǎng)期間自由采食基礎(chǔ)飼料和飲水，每3 d稱量一次大鼠體質(zhì)量，同時調(diào)整灌胃量，每天記錄大鼠采食量。喂養(yǎng)28 d，禁食12 h后稱體質(zhì)量。頸椎脫臼法處死大鼠。采集大鼠的血液于離心管中進行離心后采集血清。取肝臟、左側(cè)骨骼肌、腎臟等，樣品稱質(zhì)量后用液氮冷凍于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3天后，王敬凱等開車去山上查看情況。他們看到第一棵松樹下土面上的記號沒被破壞，說明瓶子沒動，第二棵松樹下的土壤變松，表面記號已不在。王敬凱從土中摳出了一個小瓶。

1.3.2 腹脂率、組織相對質(zhì)量和飼料效率的測定

腹脂率、組織相對質(zhì)量和飼料效率分別根據(jù)公式（1）～（3）計算。

1.3.3 生理生化指標分析

飼料和糞便TP的測定采用凱氏定氮法測定。血清和骨骼肌中TP、BUN、Cr水平采用試劑盒測定，血清中胰島素和IGF-Ⅰ的含量根據(jù)試劑盒，采用酶聯(lián)免疫法測定，血清及組織中氨基酸分析采用全自動氨基酸分析儀進行。

1.3.4 花椒麻素對大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝與分解代謝的分析

蛋白質(zhì)合成代謝采用離體培養(yǎng)骨骼肌肉，檢測單位時間內(nèi)摻入[14C]-苯丙氨酸（0.05 μCi/mL）的放射性含量[14]。新鮮的左測骨骼肌稱質(zhì)量后，置于5 mL DMEM細胞培養(yǎng)基中37 ℃充氧孵育30 min，然后在含有[14C]-苯丙氨酸的DMEM中繼續(xù)孵育1 h。磷酸鹽緩沖液洗3 次，肌肉進行勻漿，加入10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）沉淀蛋白質(zhì)，吸棄上清液，加入0.5 mol/L NaOH溶解沉淀的蛋白，取90%加入閃爍液進行液閃計數(shù)據(jù)，取10%采用BCA法測蛋白質(zhì)量濃度。

采用檢測量培養(yǎng)液中酪氨酸釋放率分析骨骼蛋白質(zhì)分解代謝[15]。左則骨骼肌稱質(zhì)量后，浸沒在Basal-Krebs-Ringer緩沖液中，37 ℃充氧孵育2 h，取培養(yǎng)液用TCA沉淀后，取0.5 mL上清液于2 mL離心管中，然后加入1.0 mL 5% TCA混勻后，依次加入0.75 mL硝酸、0.75 mL 1-亞硝基-2-萘酚，混勻，55 ℃溫育30 min，加入二氯乙烷萃取，提取上清液200 μL進行測定。

1.3.5 肝臟和骨骼肌中關(guān)鍵基因qPCR的分析

利用試劑盒提取和反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度（OD260nm/OD280nm）。采用qPCR分析肝臟和骨骼肌中關(guān)鍵基因；內(nèi)參基因為β-肌動蛋白基因（β-actin）；qPCR引物序列見表1。10 μL qPCR反應(yīng)體系包含：4.2 μL SYBR Green Supermix，4.2 μL DEPC水，100 ng/μL cDNA模板1.0 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.3 μL。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 5 s，40 次循環(huán)；95 ℃ 5 s。每個樣品均設(shè)置3 次重復(fù)。

表1 qPCR引物序列Table1 Primers used for qPCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒麻素對SD大鼠生長的影響

表2 花椒麻素對大鼠生長率的影響Table2 Effect of alkylamides on the growth rate of rats

由表2可知，與空白對照組相比，3 個劑量花椒麻素均顯著降低實驗大鼠體質(zhì)量（P＜0.05）；花椒麻素顯著增加大鼠飼料效率（P＜0.05）；花椒麻素對大鼠的氮表觀消化率均沒有顯著影響?；ń仿樗刂锌娠@著提高大鼠骨骼肌相對質(zhì)量（P＜0.05），對其他臟器的相對質(zhì)量沒有明顯影響?；ń仿樗赜薪档透怪实内厔?，但未達到統(tǒng)計學(xué)的顯著水平。

2.2 生理生化指標

表3 花椒麻素對大鼠血清生理生化及組織氨基酸的影響Table3 Effect of alkylamides on plasma parameters in serum and amino acids in muscle

由表3可知，與空白對照組相比，花椒麻素顯著升高血清和骨骼肌中TP水平（P＜0.05）；顯著升高血清中IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度（P＜0.05）；顯著降低BUN濃度（P＜0.05）；對實驗大鼠血清Cr濃度影響不顯著。推測花椒麻素有降低機體蛋白分解，增加蛋白質(zhì)沉積的可能。

另外與空白對照組比，花椒麻素顯著上調(diào)血清中天冬酰胺（Asn）和丙氨酸（Ala）濃度，顯著下調(diào)谷氨酰胺（Gln）的濃度（P＜0.05）；顯著上調(diào)大鼠骨骼肌中多數(shù)生糖氨基酸含量，其中，高劑量顯著上調(diào)天冬氨酸（Asp）、Asn、色氨酸（Ser）、Ala、Gln、谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）的含量（P＜0.05）；中劑量顯著上調(diào)Asp、Glu、Sre、Tyr、Arg、Ala、Asn、Thr、Gln的含量（P＜0.05）；低劑量顯著上調(diào)Glu、Asp、Asn、Sre、Ala、Thr、Tyr、Arg、Gln的含量（P＜0.05）；3 個劑量花椒麻素均顯著降低甲硫氨酸（Met）的含量（P＜0.05）。與生糖氨基酸有所不同，灌胃花椒麻素對大鼠骨骼肌中兼生氨基酸、生酮氨基酸和支鏈氨基酸的影響主要表現(xiàn)在下調(diào)其含量。對大鼠血清和骨骼肌中其他各種檢測到的氨基酸含量無顯著影響。

2.3 花椒麻素對骨骼蛋白質(zhì)合成與分解代謝的影響

圖1 花椒麻素對骨骼蛋白質(zhì)合成（A）與分解代謝（B）的影響（n＝ 10）Fig.1 Effect of alkylamides on protein synthesis (A) and degradation (B) (n = 10)

由圖1可知，與空白對照組相比，經(jīng)過28 d花椒麻素灌胃后，高劑量組、中劑量組、低劑量組大鼠骨骼肌中蛋白質(zhì)合成率分別增加了23.06%、26.39%、13.41%（P＜0.05）；而蛋白質(zhì)分解代謝分別降低了10.44%、10.99%、3.46%。體外實驗同樣說明花椒麻素使大鼠骨骼肌中蛋白質(zhì)合成代謝增加，分解代謝降低。

2.4 花椒麻素對肝臟及骨骼中IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR mRNA相對表達量的影響

圖2 花椒麻素對肝臟（A）及骨骼組織（B）中IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR的mRNA相對表達量的影響Fig.2 Effect of alkylamides on mRNA expression of IGF-I and IGF-IR in liver (A) and muscle (B) of healthy SD rats

與空白對照組比較，3 個劑量的花椒麻素顯著上調(diào)大鼠肝臟中IGF-Ⅰ基因mRNA的相對表達量（P＜0.05）；花椒麻素對大鼠肝臟胰島素樣生長因子受體-Ⅰ（insulin growth factor receptor，IGF-ⅠR）基因mRNA相對表達量有上調(diào)趨勢，但不顯著（圖2A）。另外花椒麻素顯著上調(diào)大鼠骨骼肌中的IGF-Ⅰ mRNA相對表達量（P＜0.05）；高劑量的花椒麻素顯著上調(diào)大鼠骨骼肌中IGF-ⅠR mRNA相對表達量（P＜0.05），中劑量和低劑量影響不顯著（圖2B）。

2.5 花椒麻素對健康SD大鼠骨骼肌中關(guān)鍵生長因子基因mRNA相對表達量的影響

圖3 花椒麻素對健康SD大鼠骨骼肌中關(guān)鍵生長因子mRNA表達量的影響Fig.3 Effect of alkylamides on mRNA expression of critical growth factor genes in skeletal muscle tissue of healthy SD rats

由圖3可知，3 個劑量的花椒麻素顯著上調(diào)大鼠骨骼肌中MyoG和鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin，CAST）mRNA相對表達量（P＜0.05）；顯著下調(diào)大鼠骨骼肌中肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）mRNA相對表達量（P＜0.05）；3 個劑量的花椒麻素均上調(diào)鈣蛋白酶-1（μ-calpain，CAPN-1）基因mRNA表達量，其中，高劑量組和中劑量組上調(diào)顯著（P＜0.05），低劑量組有上調(diào)趨勢，但不顯著。

3 討 論

花椒麻素對大鼠生長性能的影響主要體現(xiàn)在兩個方面：一是能夠降低大鼠體內(nèi)脂肪的沉積；二是顯著地提高實驗組大鼠骨骼肌相對質(zhì)量。大鼠體質(zhì)量的降低可能是由于脂肪沉積的減少所致，說明花椒麻素具有降低脂肪含量、增強蛋白質(zhì)沉積作用。另外灌胃花椒麻素對大鼠主要臟器相對質(zhì)量沒有顯著影響（表2），這也間接說明實驗設(shè)計的花椒麻素劑量不影響大鼠正常的生理機能。該結(jié)果從表觀水平上說明花椒麻素對大鼠蛋白質(zhì)代謝具有積極的調(diào)節(jié)作用。

BUN的水平可反映動物蛋白質(zhì)代謝狀況，并可作為機體氮利用和蛋白質(zhì)沉積的指標，BUN水平降低可增加氮沉積，提高蛋白質(zhì)合成量[17]。本實驗結(jié)果表明，3 個劑量的花椒麻素對實驗大鼠BUN水平均有顯著降低的影響（P＜0.05）（表3）；Cr是肌細胞中磷酸肌酸的代謝終產(chǎn)物，正常情況下，機體內(nèi)血清Cr水平保持基本穩(wěn)定[18]。實驗結(jié)果表明，3 個劑量的花椒麻素對實驗大鼠血清Cr水平影響不顯著（表3），表明實驗設(shè)計劑量不影響大鼠的腎小球排泄。血清TP作為動物重要的生化指標，其水平在一定程度上反映了體內(nèi)蛋白沉積的水平[19]。以上結(jié)果表明，花椒麻素可以顯著升高大鼠血清TP水平，說明其蛋白質(zhì)沉積增強（表3）。

灌胃花椒麻素可顯著升高大鼠血清中（Asn、Ala）濃度和骨骼肌中（Asp、Glu、Ser、Tyr、Arg、Ala、Asn、Thr、Gln）的含量，這些氨基酸多為非必需性氨基酸，其來源主要是機體蛋白質(zhì)的分解或者利用相應(yīng)α-酮酸自身合成，結(jié)合表觀水平的蛋白質(zhì)合成增加，推測花椒麻素對實驗大鼠生糖氨基酸含量的升高主要是由于自身合成增加。α-酮酸是機體糖代謝的中間產(chǎn)物，是機體供能充足的情況下，氨基酸通常不參與或很少參與供能[20]，而是作為合成蛋白質(zhì)的原料，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成增加。同時實驗組大鼠血清中Gln含量顯著降低、骨骼肌中Gln含量顯著升高，提示蛋白質(zhì)分解減弱、在骨骼肌中沉積增強，最終表現(xiàn)為骨骼肌相對質(zhì)量的增加。另外，體外實驗同樣說明花椒麻素可顯著增加大鼠蛋白質(zhì)合成代謝，降低蛋白質(zhì)分解代謝（圖2A、B）。

血清中的IGF-Ⅰ主要由肝臟產(chǎn)生，之后分泌進入血液，與血液中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白結(jié)合后，被運輸?shù)街苓吔M織發(fā)揮作用[21-22]。IGF-Ⅰ能促進骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成，刺激衛(wèi)星細胞分化與增殖，有增強骨骼肌創(chuàng)傷后再生的作用[23]。IGF-Ⅰ能增進鳥氨酸脫羧酶的活性，促進DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成，最終導(dǎo)致細胞增殖[24]?；ń仿樗乜娠@著上調(diào)肝臟和骨骼肌中IGF-ⅠmRNA的表達量，并對肝臟和骨骼肌IGF-ⅠR mRNA表達量有上調(diào)趨勢（圖2A、B）。結(jié)合血清中IGF-Ⅰ的含量顯著增加（表3），由此推測，花椒麻素生物作用的發(fā)揮可能由IGF-Ⅰ介導(dǎo)。

MyoG在肌肉的萎縮、生長發(fā)育以及肌肉的再生中起作重要作用，并在肌肉分化過程中起中心調(diào)節(jié)作用[25-26]。由圖3可知，與空白對照組比較，3 個劑量的花椒麻素顯著（P＜0.05）上調(diào)大鼠骨骼肌中MyoG mRNA表達量。說明花椒麻素對肌細胞的生長具有一定的促進作用。而MSTN具有抑制肌肉生長的功能，其表達量與肌肉質(zhì)量呈負相關(guān)[27]。花椒麻素對大鼠骨骼肌中MSTN mRNA表達量有顯著（P＜0.05）下調(diào)作用。MyoG的上調(diào)有利于肌肉的生長發(fā)育，而MSTN的下調(diào)有利于MyoG作用的發(fā)揮。因此，花椒麻素促進大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)沉積的作用與MyoG/MSTN系統(tǒng)有關(guān)。

CAPN-1對骨骼肌蛋白沉積有重要的調(diào)節(jié)作用，它能降解大量的肌原纖維和細胞的骨架蛋白，這一特性對肌肉蛋白質(zhì)代謝更新起重要的作用[28]。由圖3可知，花椒麻素均上調(diào)CAPN-1基因mRNA表達量，其中高劑量組和中劑量組上調(diào)顯著（P＜0.05），低劑量組有上調(diào)趨勢，但不顯著。CAST可調(diào)節(jié)骨骼肌中鈣蛋白酶系統(tǒng)的活性[29]。CAST大量表達會抑制肌細胞的分解，減慢蛋白質(zhì)的降解速率，有利于骨骼肌的生長[30]。從圖3可知，與空白對照組相比較，3 個劑量組的花椒麻素均顯著上調(diào)節(jié)CAST基因mRNA表達量（P＜0.05）。CAPN-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平提示高、中劑量組大鼠的蛋白質(zhì)代謝更新旺盛，CAST的顯著上調(diào)說明對肌細胞分解減弱，蛋白質(zhì)沉積作用加強，與骨骼肌相對質(zhì)量的增加相吻合。因此，花椒麻素可能由CAPN-1/CAST系統(tǒng)加強骨骼肌蛋白質(zhì)的更新，促進蛋白質(zhì)的沉積。

4 結(jié) 論

灌胃花椒麻素可顯著增加實驗大鼠的骨骼肌相對質(zhì)量，減少腹脂的沉積；顯著提高實驗大鼠血清和骨骼肌中TP水平，表明實驗大鼠骨骼肌相對質(zhì)量的增加是由蛋白質(zhì)沉積所致。另外，花椒麻素可增加大鼠機體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成速率，減少蛋白質(zhì)的分解速率，骨骼肌蛋白質(zhì)的增加是機體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解的綜合結(jié)果。花椒麻素促進實驗大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)沉積的機理是由IGF-Ⅰ介導(dǎo)的，MyoG/MSTN系統(tǒng)和CAPN-1/CAST系統(tǒng)參與的最終結(jié)果。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)花椒麻素對大鼠血清和骨骼肌中氨基酸組成有一定的影響，花椒麻素以何種細胞刺激信號來影響蛋白質(zhì)合成與分解的機理還有待進一步研究。

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