任廷遠(yuǎn)，闞建全*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）是蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）植物，其果實(shí)是我國傳統(tǒng)的“八大調(diào)味品”之一，也是我國傳統(tǒng)中藥?；ń吩谌澜缂s有250 種，主要分布在非洲、亞洲、美洲及大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]?，F(xiàn)在研究報(bào)道的花椒麻素主要有山椒素等14 種[2]，主要包括α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素以及它們在氨基部分含有一個羥基的同系物[3-4]。

目前關(guān)于花椒麻素對機(jī)體功能的研究主要集中在減肥、降脂、抗氧化、降血糖等方面[5-7]。其中關(guān)于花椒麻素促進(jìn)體內(nèi)脂肪的氧化，減少脂肪沉積和血漿中甘油三酯濃度的效果的研究較多。2014年，陳朝軍等[8]發(fā)現(xiàn)灌胃不同配比的花椒麻素與辣椒素能延緩大鼠的體質(zhì)量增加，降低大鼠的血脂和肝脂水平，減輕大鼠的脂肪肝癥狀，對膽固醇代謝循環(huán)有較好效果；2014年，呂嬌[9]研究表明，麻味麻素可升高高脂血癥大鼠回腸膽汁酸代謝基因表達(dá)和降低高脂血癥大鼠肝臟內(nèi)膽固醇代謝基因表達(dá)，降低其體內(nèi)血脂、肝脂含量，從而調(diào)節(jié)膽固醇在體內(nèi)的代謝循環(huán)作用；2014年，任文瑾[10]研究表明，花椒精、花椒揮發(fā)油和花椒麻素均有調(diào)節(jié)血脂的作用，作用效果花椒麻素＞花椒精＞花椒揮發(fā)油，花椒麻素與花椒精調(diào)節(jié)肝臟膽固醇代謝的效果相近，但花椒麻素降低甘油三酯的效果優(yōu)于花椒精。然而花椒麻素降脂過程中如何促進(jìn)蛋白沉積并不明確，嚴(yán)重防礙了花椒麻素生理功能的全面評價，因此有必要研究花椒麻素對機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的影響及機(jī)理，為花椒麻素在醫(yī)藥上的應(yīng)用提供科學(xué)的理論參考。肝臟是哺乳動物蛋白質(zhì)代謝最活躍的器官，蛋白質(zhì)代謝的許多重要反應(yīng)都是在肝臟中進(jìn)行的；肌肉是貯存氨基酸的主要場所，其氨基酸含量占氨基酸代謝庫的50%～75%[11]。現(xiàn)已研究證實(shí)，胰島素樣生長因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）是主要由肝臟分泌的調(diào)控動物生長發(fā)育的關(guān)鍵因子，對蛋白質(zhì)代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[12]。肌肉質(zhì)量的增長是蛋白質(zhì)沉積的最直觀表現(xiàn)之一，而肌肉的發(fā)育受到肌細(xì)胞生成素（myogenin，MyoG）等肌肉生長調(diào)控因子的調(diào)節(jié)[13]。前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)花椒麻素可以增加SD大鼠相對骨骼肌的質(zhì)量，但具體機(jī)理十分不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以健康SD雄性大鼠為動物模型，采用熒光實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）方法，研究花椒麻素對機(jī)體蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因的影響，初步探討花椒麻素對SD大鼠蛋白質(zhì)代謝的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SD雄性大鼠（動物許可證號：SCXK（渝）20120008，體質(zhì)量120～140 g，40 只） 重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。

花椒麻素由實(shí)驗(yàn)室自制，純度為95.7%。

大鼠基礎(chǔ)飼料 重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司；總蛋白質(zhì)（total protein，TP）、血尿素氮（blood urine nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）等指標(biāo)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；IGF-Ⅰ的測定試劑盒美國ADL公司；[14C]-苯丙氨酸 中國原子能科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

3-18K冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；7020全自動生化分析儀、L-8800全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；H1MG酶標(biāo)儀 美國基因有限公司；UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；NanoDrop 1000微量紫外分光光度計(jì) 美國Thermo公司；S1000梯度PCR儀美國Bio-Rad公司；Light Cycler Nano qPCR儀 美國羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養(yǎng)與樣品采集

動物實(shí)驗(yàn)過程遵循現(xiàn)行的經(jīng)西南大學(xué)動物保護(hù)委員會批準(zhǔn)的動物保護(hù)法。將40 只SD雄性大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組、花椒麻素高劑量組（8 mg/（kg·d））、中劑量組（4 mg/（kg·d））和低劑量組（2 mg/（kg·d）），各組10 只。每只大鼠分別飼養(yǎng)在不銹鋼籠里（25 cm×15 cm×15 cm），控制恒溫恒濕的房間，溫度保持在（25±1）℃，相對濕度55%，從早上7點(diǎn)開始12 h為周期循環(huán)晝夜。每天15：00對實(shí)驗(yàn)組灌胃花椒麻素，花椒麻素需溶于大豆油中配成溶液。灌胃劑量均為0.1 mL/100 g（以體質(zhì)量計(jì)），空白對照組灌胃等劑量的大豆油。飼養(yǎng)期間自由采食基礎(chǔ)飼料和飲水，每3 d稱量一次大鼠體質(zhì)量，同時調(diào)整灌胃量，每天記錄大鼠采食量。喂養(yǎng)28 d，禁食12 h后稱體質(zhì)量。頸椎脫臼法處死大鼠。采集大鼠的血液于離心管中進(jìn)行離心后采集血清。取肝臟、左側(cè)骨骼肌、腎臟等，樣品稱質(zhì)量后用液氮冷凍于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3天后，王敬凱等開車去山上查看情況。他們看到第一棵松樹下土面上的記號沒被破壞，說明瓶子沒動，第二棵松樹下的土壤變松，表面記號已不在。王敬凱從土中摳出了一個小瓶。

1.3.2 腹脂率、組織相對質(zhì)量和飼料效率的測定

腹脂率、組織相對質(zhì)量和飼料效率分別根據(jù)公式（1）～（3）計(jì)算。

1.3.3 生理生化指標(biāo)分析

飼料和糞便TP的測定采用凱氏定氮法測定。血清和骨骼肌中TP、BUN、Cr水平采用試劑盒測定，血清中胰島素和IGF-Ⅰ的含量根據(jù)試劑盒，采用酶聯(lián)免疫法測定，血清及組織中氨基酸分析采用全自動氨基酸分析儀進(jìn)行。

1.3.4 花椒麻素對大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝與分解代謝的分析

蛋白質(zhì)合成代謝采用離體培養(yǎng)骨骼肌肉，檢測單位時間內(nèi)摻入[14C]-苯丙氨酸（0.05 μCi/mL）的放射性含量[14]。新鮮的左測骨骼肌稱質(zhì)量后，置于5 mL DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中37 ℃充氧孵育30 min，然后在含有[14C]-苯丙氨酸的DMEM中繼續(xù)孵育1 h。磷酸鹽緩沖液洗3 次，肌肉進(jìn)行勻漿，加入10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）沉淀蛋白質(zhì)，吸棄上清液，加入0.5 mol/L NaOH溶解沉淀的蛋白，取90%加入閃爍液進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)據(jù)，取10%采用BCA法測蛋白質(zhì)量濃度。

采用檢測量培養(yǎng)液中酪氨酸釋放率分析骨骼蛋白質(zhì)分解代謝[15]。左則骨骼肌稱質(zhì)量后，浸沒在Basal-Krebs-Ringer緩沖液中，37 ℃充氧孵育2 h，取培養(yǎng)液用TCA沉淀后，取0.5 mL上清液于2 mL離心管中，然后加入1.0 mL 5% TCA混勻后，依次加入0.75 mL硝酸、0.75 mL 1-亞硝基-2-萘酚，混勻，55 ℃溫育30 min，加入二氯乙烷萃取，提取上清液200 μL進(jìn)行測定。

1.3.5 肝臟和骨骼肌中關(guān)鍵基因qPCR的分析

利用試劑盒提取和反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度（OD260nm/OD280nm）。采用qPCR分析肝臟和骨骼肌中關(guān)鍵基因；內(nèi)參基因?yàn)棣?肌動蛋白基因（β-actin）；qPCR引物序列見表1。10 μL qPCR反應(yīng)體系包含：4.2 μL SYBR Green Supermix，4.2 μL DEPC水，100 ng/μL cDNA模板1.0 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.3 μL。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 5 s，40 次循環(huán)；95 ℃ 5 s。每個樣品均設(shè)置3 次重復(fù)。

表1 qPCR引物序列Table1 Primers used for qPCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒麻素對SD大鼠生長的影響

表2 花椒麻素對大鼠生長率的影響Table2 Effect of alkylamides on the growth rate of rats

由表2可知，與空白對照組相比，3 個劑量花椒麻素均顯著降低實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量（P＜0.05）；花椒麻素顯著增加大鼠飼料效率（P＜0.05）；花椒麻素對大鼠的氮表觀消化率均沒有顯著影響。花椒麻素中可顯著提高大鼠骨骼肌相對質(zhì)量（P＜0.05），對其他臟器的相對質(zhì)量沒有明顯影響?；ń仿樗赜薪档透怪实内厔?，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著水平。

2.2 生理生化指標(biāo)

表3 花椒麻素對大鼠血清生理生化及組織氨基酸的影響Table3 Effect of alkylamides on plasma parameters in serum and amino acids in muscle

由表3可知，與空白對照組相比，花椒麻素顯著升高血清和骨骼肌中TP水平（P＜0.05）；顯著升高血清中IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度（P＜0.05）；顯著降低BUN濃度（P＜0.05）；對實(shí)驗(yàn)大鼠血清Cr濃度影響不顯著。推測花椒麻素有降低機(jī)體蛋白分解，增加蛋白質(zhì)沉積的可能。

另外與空白對照組比，花椒麻素顯著上調(diào)血清中天冬酰胺（Asn）和丙氨酸（Ala）濃度，顯著下調(diào)谷氨酰胺（Gln）的濃度（P＜0.05）；顯著上調(diào)大鼠骨骼肌中多數(shù)生糖氨基酸含量，其中，高劑量顯著上調(diào)天冬氨酸（Asp）、Asn、色氨酸（Ser）、Ala、Gln、谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）的含量（P＜0.05）；中劑量顯著上調(diào)Asp、Glu、Sre、Tyr、Arg、Ala、Asn、Thr、Gln的含量（P＜0.05）；低劑量顯著上調(diào)Glu、Asp、Asn、Sre、Ala、Thr、Tyr、Arg、Gln的含量（P＜0.05）；3 個劑量花椒麻素均顯著降低甲硫氨酸（Met）的含量（P＜0.05）。與生糖氨基酸有所不同，灌胃花椒麻素對大鼠骨骼肌中兼生氨基酸、生酮氨基酸和支鏈氨基酸的影響主要表現(xiàn)在下調(diào)其含量。對大鼠血清和骨骼肌中其他各種檢測到的氨基酸含量無顯著影響。

2.3 花椒麻素對骨骼蛋白質(zhì)合成與分解代謝的影響

圖1 花椒麻素對骨骼蛋白質(zhì)合成（A）與分解代謝（B）的影響（n＝ 10）Fig.1 Effect of alkylamides on protein synthesis (A) and degradation (B) (n = 10)

由圖1可知，與空白對照組相比，經(jīng)過28 d花椒麻素灌胃后，高劑量組、中劑量組、低劑量組大鼠骨骼肌中蛋白質(zhì)合成率分別增加了23.06%、26.39%、13.41%（P＜0.05）；而蛋白質(zhì)分解代謝分別降低了10.44%、10.99%、3.46%。體外實(shí)驗(yàn)同樣說明花椒麻素使大鼠骨骼肌中蛋白質(zhì)合成代謝增加，分解代謝降低。

2.4 花椒麻素對肝臟及骨骼中IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR mRNA相對表達(dá)量的影響

圖2 花椒麻素對肝臟（A）及骨骼組織（B）中IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR的mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of alkylamides on mRNA expression of IGF-I and IGF-IR in liver (A) and muscle (B) of healthy SD rats

與空白對照組比較，3 個劑量的花椒麻素顯著上調(diào)大鼠肝臟中IGF-Ⅰ基因mRNA的相對表達(dá)量（P＜0.05）；花椒麻素對大鼠肝臟胰島素樣生長因子受體-Ⅰ（insulin growth factor receptor，IGF-ⅠR）基因mRNA相對表達(dá)量有上調(diào)趨勢，但不顯著（圖2A）。另外花椒麻素顯著上調(diào)大鼠骨骼肌中的IGF-Ⅰ mRNA相對表達(dá)量（P＜0.05）；高劑量的花椒麻素顯著上調(diào)大鼠骨骼肌中IGF-ⅠR mRNA相對表達(dá)量（P＜0.05），中劑量和低劑量影響不顯著（圖2B）。

2.5 花椒麻素對健康SD大鼠骨骼肌中關(guān)鍵生長因子基因mRNA相對表達(dá)量的影響

圖3 花椒麻素對健康SD大鼠骨骼肌中關(guān)鍵生長因子mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of alkylamides on mRNA expression of critical growth factor genes in skeletal muscle tissue of healthy SD rats

由圖3可知，3 個劑量的花椒麻素顯著上調(diào)大鼠骨骼肌中MyoG和鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin，CAST）mRNA相對表達(dá)量（P＜0.05）；顯著下調(diào)大鼠骨骼肌中肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）mRNA相對表達(dá)量（P＜0.05）；3 個劑量的花椒麻素均上調(diào)鈣蛋白酶-1（μ-calpain，CAPN-1）基因mRNA表達(dá)量，其中，高劑量組和中劑量組上調(diào)顯著（P＜0.05），低劑量組有上調(diào)趨勢，但不顯著。

3 討 論

花椒麻素對大鼠生長性能的影響主要體現(xiàn)在兩個方面：一是能夠降低大鼠體內(nèi)脂肪的沉積；二是顯著地提高實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌相對質(zhì)量。大鼠體質(zhì)量的降低可能是由于脂肪沉積的減少所致，說明花椒麻素具有降低脂肪含量、增強(qiáng)蛋白質(zhì)沉積作用。另外灌胃花椒麻素對大鼠主要臟器相對質(zhì)量沒有顯著影響（表2），這也間接說明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的花椒麻素劑量不影響大鼠正常的生理機(jī)能。該結(jié)果從表觀水平上說明花椒麻素對大鼠蛋白質(zhì)代謝具有積極的調(diào)節(jié)作用。

BUN的水平可反映動物蛋白質(zhì)代謝狀況，并可作為機(jī)體氮利用和蛋白質(zhì)沉積的指標(biāo)，BUN水平降低可增加氮沉積，提高蛋白質(zhì)合成量[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 個劑量的花椒麻素對實(shí)驗(yàn)大鼠BUN水平均有顯著降低的影響（P＜0.05）（表3）；Cr是肌細(xì)胞中磷酸肌酸的代謝終產(chǎn)物，正常情況下，機(jī)體內(nèi)血清Cr水平保持基本穩(wěn)定[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 個劑量的花椒麻素對實(shí)驗(yàn)大鼠血清Cr水平影響不顯著（表3），表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量不影響大鼠的腎小球排泄。血清TP作為動物重要的生化指標(biāo)，其水平在一定程度上反映了體內(nèi)蛋白沉積的水平[19]。以上結(jié)果表明，花椒麻素可以顯著升高大鼠血清TP水平，說明其蛋白質(zhì)沉積增強(qiáng)（表3）。

灌胃花椒麻素可顯著升高大鼠血清中（Asn、Ala）濃度和骨骼肌中（Asp、Glu、Ser、Tyr、Arg、Ala、Asn、Thr、Gln）的含量，這些氨基酸多為非必需性氨基酸，其來源主要是機(jī)體蛋白質(zhì)的分解或者利用相應(yīng)α-酮酸自身合成，結(jié)合表觀水平的蛋白質(zhì)合成增加，推測花椒麻素對實(shí)驗(yàn)大鼠生糖氨基酸含量的升高主要是由于自身合成增加。α-酮酸是機(jī)體糖代謝的中間產(chǎn)物，是機(jī)體供能充足的情況下，氨基酸通常不參與或很少參與供能[20]，而是作為合成蛋白質(zhì)的原料，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成增加。同時實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中Gln含量顯著降低、骨骼肌中Gln含量顯著升高，提示蛋白質(zhì)分解減弱、在骨骼肌中沉積增強(qiáng)，最終表現(xiàn)為骨骼肌相對質(zhì)量的增加。另外，體外實(shí)驗(yàn)同樣說明花椒麻素可顯著增加大鼠蛋白質(zhì)合成代謝，降低蛋白質(zhì)分解代謝（圖2A、B）。

血清中的IGF-Ⅰ主要由肝臟產(chǎn)生，之后分泌進(jìn)入血液，與血液中胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白結(jié)合后，被運(yùn)輸?shù)街苓吔M織發(fā)揮作用[21-22]。IGF-Ⅰ能促進(jìn)骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成，刺激衛(wèi)星細(xì)胞分化與增殖，有增強(qiáng)骨骼肌創(chuàng)傷后再生的作用[23]。IGF-Ⅰ能增進(jìn)鳥氨酸脫羧酶的活性，促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖[24]?；ń仿樗乜娠@著上調(diào)肝臟和骨骼肌中IGF-ⅠmRNA的表達(dá)量，并對肝臟和骨骼肌IGF-ⅠR mRNA表達(dá)量有上調(diào)趨勢（圖2A、B）。結(jié)合血清中IGF-Ⅰ的含量顯著增加（表3），由此推測，花椒麻素生物作用的發(fā)揮可能由IGF-Ⅰ介導(dǎo)。

MyoG在肌肉的萎縮、生長發(fā)育以及肌肉的再生中起作重要作用，并在肌肉分化過程中起中心調(diào)節(jié)作用[25-26]。由圖3可知，與空白對照組比較，3 個劑量的花椒麻素顯著（P＜0.05）上調(diào)大鼠骨骼肌中MyoG mRNA表達(dá)量。說明花椒麻素對肌細(xì)胞的生長具有一定的促進(jìn)作用。而MSTN具有抑制肌肉生長的功能，其表達(dá)量與肌肉質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)[27]?；ń仿樗貙Υ笫蠊趋兰≈蠱STN mRNA表達(dá)量有顯著（P＜0.05）下調(diào)作用。MyoG的上調(diào)有利于肌肉的生長發(fā)育，而MSTN的下調(diào)有利于MyoG作用的發(fā)揮。因此，花椒麻素促進(jìn)大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)沉積的作用與MyoG/MSTN系統(tǒng)有關(guān)。

CAPN-1對骨骼肌蛋白沉積有重要的調(diào)節(jié)作用，它能降解大量的肌原纖維和細(xì)胞的骨架蛋白，這一特性對肌肉蛋白質(zhì)代謝更新起重要的作用[28]。由圖3可知，花椒麻素均上調(diào)CAPN-1基因mRNA表達(dá)量，其中高劑量組和中劑量組上調(diào)顯著（P＜0.05），低劑量組有上調(diào)趨勢，但不顯著。CAST可調(diào)節(jié)骨骼肌中鈣蛋白酶系統(tǒng)的活性[29]。CAST大量表達(dá)會抑制肌細(xì)胞的分解，減慢蛋白質(zhì)的降解速率，有利于骨骼肌的生長[30]。從圖3可知，與空白對照組相比較，3 個劑量組的花椒麻素均顯著上調(diào)節(jié)CAST基因mRNA表達(dá)量（P＜0.05）。CAPN-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平提示高、中劑量組大鼠的蛋白質(zhì)代謝更新旺盛，CAST的顯著上調(diào)說明對肌細(xì)胞分解減弱，蛋白質(zhì)沉積作用加強(qiáng)，與骨骼肌相對質(zhì)量的增加相吻合。因此，花椒麻素可能由CAPN-1/CAST系統(tǒng)加強(qiáng)骨骼肌蛋白質(zhì)的更新，促進(jìn)蛋白質(zhì)的沉積。

4 結(jié) 論

灌胃花椒麻素可顯著增加實(shí)驗(yàn)大鼠的骨骼肌相對質(zhì)量，減少腹脂的沉積；顯著提高實(shí)驗(yàn)大鼠血清和骨骼肌中TP水平，表明實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌相對質(zhì)量的增加是由蛋白質(zhì)沉積所致。另外，花椒麻素可增加大鼠機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成速率，減少蛋白質(zhì)的分解速率，骨骼肌蛋白質(zhì)的增加是機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解的綜合結(jié)果。花椒麻素促進(jìn)實(shí)驗(yàn)大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)沉積的機(jī)理是由IGF-Ⅰ介導(dǎo)的，MyoG/MSTN系統(tǒng)和CAPN-1/CAST系統(tǒng)參與的最終結(jié)果。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)花椒麻素對大鼠血清和骨骼肌中氨基酸組成有一定的影響，花椒麻素以何種細(xì)胞刺激信號來影響蛋白質(zhì)合成與分解的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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