于曼曼，夏光華，李 川，申鉉日,*

（1.海南大學食品學院，海南 海口 570228；2.海南大學 熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南 ?？?570228）

羅非魚，又稱非洲鯽魚，由于其生長迅速、肉質(zhì)鮮嫩，富含蛋白質(zhì)和多種不飽和脂肪酸，成為世界上水產(chǎn)業(yè)重點培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚類[1-2]。我國是羅非魚生產(chǎn)大國，生產(chǎn)的成品多為冷凍羅非魚片，其加工過程中產(chǎn)生大量的魚頭廢棄物。因此本研究以羅非魚頭為原料進行羅非魚頭長鏈堿（tilapia head long chain bases，TH-LCB）的制備，不僅可以增加羅非魚廢棄物的附加值，還可以減少廢棄物對環(huán)境的污染。

長鏈堿又稱鞘氨醇堿基、鞘氨基醇，為長鏈多羥基脂肪胺，是鞘脂類的特征性結(jié)構(gòu)[3]。1876年首次在大腦中發(fā)現(xiàn)了腦苷脂，并且發(fā)現(xiàn)它含有一個脂肪鏈的堿基，即“sphingosines”，但鞘氨醇類化合物的作用機理至今仍是一個難解的謎。長鏈堿的結(jié)構(gòu)隨著生物進化，在不同物種之間存在較大的差異，這些差異主要包括長鏈堿的碳骨架長短、支鏈位置和雙鍵數(shù)目及位置。天然存在的長鏈堿鏈長為12～22 個碳，以18 個碳居多。植物和真菌的長鏈堿以t18∶0為主要成分，主要以植物鞘氨醇（phytosphingosine）為主；哺乳動物以d18∶1和d18∶0為主要成分，哺乳動物體內(nèi)最常見的長鏈堿是神經(jīng)鞘氨醇（sphingosine，d18∶1），又稱鞘氨醇[4]；而水產(chǎn)類的長鏈堿組成比植物、真菌和哺乳動物復雜，主要成分是雙不飽和的d18∶2長鏈堿[4,8]，還發(fā)現(xiàn)有特殊的多不飽和d18∶3和d19∶3長鏈堿。長鏈堿的相對分子質(zhì)量范圍為238.4～320.5[5]。長鏈堿屬于強效的生長抑制劑，外源性長鏈堿可誘導多種腫瘤細胞系周期阻滯和凋亡，如人白血病HL-60細胞[6]、人大腸癌HT-29細胞和HCT-116細胞[7-8]、人肝癌HepG2細胞[9]等。長鏈堿還可以使細胞內(nèi)溶酶體快速破裂，釋放出組織蛋白酶D、B和L，激活Caspases酶系，誘導細胞凋亡[10]。這一過程可能伴隨著線粒體釋放細胞色素c，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-7等，以及抑制AKT激酶通路和絲氨酸/蘇氨酸激酶通路等抗凋亡途徑[11]。

本研究以羅非魚頭為原料，制備純化的TH-LCB，以人白血病K562細胞為細胞模型，初步探討了不同質(zhì)量濃度TH-LCB對K562細胞的增殖活性、細胞周期、細胞凋亡率及Caspse-3蛋白表達量的影響，為開發(fā)靶向治療白血病的天然抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人慢性髓源白血病癌細胞系K562細胞株 中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。

羅非魚頭 海南泉溢食品有限公司；胎牛血清、青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）和RPMI1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜和鹽酸阿霉素 美國Sigma公司；細胞培養(yǎng)皿 美國Thermo Scientif i c公司；細胞周期試劑盒、Annexin V細胞凋亡試劑盒 德國Merck Millipore公司；Caspase-3抗體美國Cell Signaling公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所；GAPDH抗體 杭州賢至科技公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；MuseTM細胞分析儀 德國Merck Millipore公司；多功能酶標儀、細胞計數(shù)器、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀 美國伯樂公司；低溫離心機 美國Sigma公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientif i c公司。

1.3 方法

1.3.1 TH-LCB的分離純化

1.3.1.1 羅非魚頭總脂的提取

羅非魚頭用組織搗碎機打漿，真空凍干。稱取100 g干燥樣品，剪碎加入1 000 mL無水乙醇超聲提取1.5 h，重復提取3 次，超濾取濾液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏狀（45 ℃）；以氯仿-甲醇-水（8∶4∶3，V/V）混懸，渦旋混合1 min，25 ℃、4 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集下層有機相；有機相中加入20%體積的質(zhì)量分數(shù)0.9% NaCl溶液，渦旋混合1 min，離心（條件同上）棄上清液，將下層有機相真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干[12-13]。

1.3.1.2 羅非魚頭總脂的硅膠柱層析分離

羅非魚頭脂質(zhì)經(jīng)中壓純化與制備系統(tǒng)硅膠柱層析進行分離?？傊芙庥谏倭柯确?，連接到中壓純化與制備系統(tǒng)硅膠柱，用不同極性的有機溶劑進行洗脫，得到不同極性的洗脫組分。洗脫條件：進樣量2 mL，進樣質(zhì)量濃度20～30 mg/mL，流速10 mL/min，檢測波長205 nm，監(jiān)測波長210 nm。分別用氯仿、丙酮和甲醇進行洗脫，得到氯仿（組分1）、丙酮（組分2）和甲醇洗脫物（組分3），真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。

1.3.1.3 羅非魚頭不同極性脂質(zhì)的薄層層析

羅非魚頭脂質(zhì)的分布：展開系統(tǒng)：正己烷、乙醚、甲醇、乙酸混合液（90∶20∶5∶2，V/V）；顯色劑：碘蒸氣。將1.3.1.2節(jié)洗脫得到的氯仿洗脫物、丙酮洗脫物、甲醇洗脫物和羅非魚頭總脂分別進行展開。將樣品點樣在薄層硅膠板上，點樣量約10 μL，將薄層板放入密閉的展開系統(tǒng)中，待溶劑遷移至硅膠板距上邊沿1 cm處，取出硅膠板揮干溶劑，放入碘蒸氣中顯色數(shù)秒，取出拍照。

丙酮洗脫物的檢識：展開系統(tǒng)：氯仿、甲醇、乙酸混合液（65∶15∶2，V/V）；顯色劑：莫氏試劑（15%α-萘酚、乙醇、硫酸、乙醇、水混合液，10.5∶6.5∶40.5∶4，V/V）。具體操作同上，丙酮洗脫物在展開溶劑中展開后，將薄層板浸沒在莫氏試劑中數(shù)秒，110 ℃烘箱中加熱顯色5 min，觀察顯色情況[14-15]。

1.3.2 TH-LCB的制備

1.3.2.1 糖脂的皂化

將濃縮的糖脂粗提物溶解于100 mL 0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液，37 ℃水浴2 h；冷卻后加入100 mL水，在冰浴中用1 mol/L HCl溶液將pH值調(diào)至6。然后用100 mL氯仿萃取3 次，收集下層有機相。合并有機相減壓濃縮至干。

1.3.2.2 糖脂的水解

皂化后的糖脂中加入100 mL 10% HCl-CH3OH溶液，密封置于70 ℃水浴反應(yīng)18 h；用100 mL正己烷萃取3 次，收集下層甲醇相，用氨水將pH值調(diào)至7，減壓濃縮至干；用100 mL蒸餾水混懸，并用100 mL乙酸乙酯萃取3 次，將乙酸乙酯相減壓濃縮至干即得TH-LCB粗品（淡黃色粉末）。

1.3.3 TH-LCB的純化

1.3.3.1 HP-20大孔樹脂吸附

將大孔樹脂裝入層析柱（1.8 cm×30 cm）中，制備的TH-LCB粗品溶解于1 mL甲醇，濕法上樣；首先用甲醇（1 mL/min）洗脫2 個柱體積；接著用丙酮洗脫，以除去色素和未水解的脂質(zhì)；收集丙酮洗脫液，減壓濃縮至干。

1.3.3.2 TH-LCB的硅膠柱層析

將吸附后的甲醇洗脫物溶解于少量氯仿，用氯仿和甲醇以一定體積比進行線性洗脫。洗脫條件：流速10 mL/min，檢測波長210 nm，檢測波長230 nm，使用氯仿-甲醇（體積比由22∶1變?yōu)?8∶1）進行線性洗脫，根據(jù)紫外檢測器下的洗脫峰進行收集[16]。

1.3.4 TH-LCB的薄層層析

展開系統(tǒng)：氯仿、甲醇、氨水混合液（40∶10∶1，V/V）；顯色劑：2%茚三酮-乙醇溶液（0.1 g茚三酮溶解于50 mL乙醇）。當溶劑遷移到硅膠板9 cm處時，取出薄層板，待溶劑揮干，浸沒入顯色劑中數(shù)秒，110℃烘箱中顯色5 min，觀察顯色情況[17]。

1.3.5 TH-LCB對K562細胞增殖的影響

收集對數(shù)生長期的K562細胞，吸取10 μL細胞懸液加入細胞檢測板，用細胞計數(shù)器計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至6×104個/mL，接種于96 孔板，每孔90 μL，培養(yǎng)24 h；實驗設(shè)置對照組、TH-LCB組和鹽酸阿霉素對照組，每孔給相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥物10 μL，使TH-LCB終質(zhì)量濃度為25、50、100、200 μg/mL，每個濃度設(shè)置6 個重復。分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔加入三聯(lián)溶解液100 μL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，在酶標儀上于570 nm波長處測定各孔的吸光度A570nm。按照下式計算細胞存活率。同時TH-LCB對K562細胞增殖抑制作用也可用半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）表示。TH-LCB的IC50通過SPSS 20.0軟件計算。

式中：A實驗組、A對照組分別表示給藥組、對照組的吸光度。

1.3.6 TH-LCB對K562細胞凋亡率的影響

對數(shù)生長期的K562細胞經(jīng)過不同濃度的TH-LCB處理后，冰上收集細胞，4℃、1 000 r/min離心5 min棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2 遍，離心，加培養(yǎng)基重懸，使細胞濃度達到5×105個/mL；在新的EP管中加100 μL細胞懸液，再加100 μL細胞凋亡試劑，在室溫下培養(yǎng)20 min；渦旋振蕩，用MuseTM細胞分析儀進行檢測，重復3 次。

1.3.7 TH-LCB對K562細胞周期的影響

將900 μL細胞懸液（6×104個/mL）接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同質(zhì)量濃度TH-LCB處理細胞24 h，每孔100 μL，TH-LCB的終質(zhì)量濃度為25、50、100、200 μg/mL。根據(jù)細胞周期試劑盒的說明書，冰上收集TH-LCB處理后的細胞，4℃、1 000 r/min離心5 min，吸棄培養(yǎng)液；用預冷的PBS洗滌2 遍，離心去上清液；分別加入冰的70%乙醇混懸細胞，使細胞濃度達到5×105個/mL；在-20 ℃下固定至少3 h，在1.5 mL EP管中加入200 μL固定的細胞，離心后去上清液，用預冷的PBS洗滌2 遍，離心；每個EP管中加入200 μL細胞周期試劑，在室溫下黑暗培養(yǎng)30 min，用MuseTM細胞分析儀進行檢測，重復3 次。

1.3.8 TH-LCB對K562細胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達量的影響

對數(shù)生長期的K562細胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度的TH-LCB處理后，冰上收集細胞；用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，通過BCA試劑盒測定各組的蛋白質(zhì)量濃度，將細胞濃度調(diào)整一致；蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，然后用含5%的脫脂乳粉的TBST溶液封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST溶液漂洗3 遍，每次15 min，二抗37 ℃孵育1 h，TBST溶液漂洗3 遍，用顯色劑ECL試劑盒顯色。以GAPDH為內(nèi)參計算Caspase-3蛋白的表達量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以的形式表示。各處理組間比較采用單因素方差分析，P＜0.01，兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚頭不同極性脂質(zhì)的分離及薄層檢識結(jié)果

羅非魚頭經(jīng)無水乙醇超聲提取后，通過萃取和鹽析去除水溶性組分和蛋白質(zhì)。由于不同脂質(zhì)在固定相和流動相上吸附與解吸附能力不同，將羅非魚頭總脂進行硅膠柱分離，以硅膠為吸附介質(zhì)，用不同極性的溶劑洗脫，得到不同極性的脂質(zhì)。如圖1A所示，根據(jù)紫外檢測器下的洗脫峰進行收集，氯仿洗脫出現(xiàn)第1個洗脫峰，收集得到極性最小的組分1；丙酮洗脫出現(xiàn)第2個洗脫峰，收集得到極性較大的組分2；甲醇洗脫出現(xiàn)第3個洗脫峰，收集得到組分3。

圖1 羅非魚頭總脂的硅膠柱層析圖譜和不同組分的薄層層析圖Fig.1 Silica gel column chromatography of total lipids from tilapia head and TLC analysis of lipid fractions

在同一展開系統(tǒng)下，不同極性脂質(zhì)在薄層板上的展開距離不同。極性較小的脂質(zhì)，硅膠對其吸附能力弱，展開距離較短。羅非魚頭不同極性脂質(zhì)在碘蒸氣下顯色的結(jié)果如圖1B所示。沿著薄層板，極性大的組分3保留在原點，極性較大的組分2靠近原點，極性小或無極性的組分1遷移距離相對較大。從圖1B可以看出，經(jīng)過硅膠柱層析，不同極性的羅非魚頭脂質(zhì)分離效果較好。組分2的檢識結(jié)果如圖1C所示，組分2在莫氏試劑顯色下呈紅紫色斑點。因為糖基在濃硫酸作用下，脫水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能與α-萘酚（莫氏試劑）生成紫紅色物質(zhì)。因此可以判斷組分2是糖脂，可以用于后續(xù)的研究。

2.2 TH-LCB的硅膠柱層析及薄層色譜檢識結(jié)果

糖脂的水解方式主要有酸水解和堿水解，二者的水解產(chǎn)物有較大差別，堿水解的水解程度較低，所得的長鏈堿含量少，但其他非長鏈堿雜質(zhì)含量少；酸水解對糖脂的水解比較完全，所得含量較高，組成復雜，為了保證TH-LCB的得率，使用10% HCl-CH3OH溶液對羅非魚頭糖脂進行酸水解，從而得到TH-LCB；TH-LCB經(jīng)過大孔樹脂吸附，去除色素等雜質(zhì)；然后將TH-LCB經(jīng)過硅膠柱層析進行純化。硅膠柱層析圖譜（圖2A）表明，洗脫時間為10 min，出峰時間為1.0～4.5 min。收集紫外檢測器下的洗脫峰即脫除部分雜質(zhì)的TH-LCB組分。洗脫的雜質(zhì)可能是腦苷脂水解不完全而產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺以及TH-LCB與糖結(jié)合產(chǎn)生的產(chǎn)物。

圖2 TH-LCB的硅膠柱層析譜圖（A）及薄層層析圖（B）Fig.2 Silica gel column chromatography (A) and TLC (B)analysis of TH-LCB

如圖2B所示，TH-LCB采用薄層層析檢識，顯色結(jié)果為紫紅色斑點，其比移值為0.32。特征顯色結(jié)果表明TH-LCB為鞘氨醇類化合物。這一結(jié)果與馮婷玉[17]的結(jié)果相似，可初步判斷皂化水解得到的組分是TH-LCB。另外，茚三酮顯色結(jié)果表明，紫紅色斑點清晰，無其他斑點，說明制備TH-LCB純度較高，雜質(zhì)較少，糖脂水解完全。

2.3 TH-LCB對K562細胞形態(tài)的影響

圖3 TH-LCB對K562細胞形態(tài)的影響（200×）Fig.3 Morphological change of K562 cells after treatment with different concentrations of TH-LCB (200 ×)

如圖3所示，正常對照組K562細胞生長狀態(tài)良好，邊緣光滑清晰，細胞透明、大小均一，細胞核完整均勻；細胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度TH-LCB作用24 h后，K562的生長增殖受到抑制，細胞密度明顯減少，細胞形態(tài)大小不一，發(fā)生了明顯的形態(tài)改變，細胞碎片增多，碎片呈小片狀。當TH-LCB的質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，細胞生長增殖被顯著抑制，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化。Sugawara等[7,18]的研究表明，小麥粉長鏈堿和海參長鏈堿可使細胞核凝聚，染色質(zhì)碎片化，從而引起人結(jié)腸癌DLD-1細胞形態(tài)的變化。

2.4 TH-LCB對K562細胞增殖的抑制作用

圖4 TH-LCB對K562細胞存活率的影響Fig.4 Viability of K562 cells after treatment with various concentrations of TH-LCB

由圖4可知，隨著TH-LCB質(zhì)量濃度的增加，細胞增殖受到顯著抑制，呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。TH-LCB作用于K562細胞24 h和48 h后的IC50分別為42.207、39.494 μg/mL。MTT測定結(jié)果表明，TH-LCB顯著地抑制細胞增殖活性。杜磊[19]發(fā)現(xiàn)了海參和海星長鏈堿顯著抑制S180、HepG2、Caco-2和HGC-27等腫瘤細胞的增殖活性，呈明顯的劑量依賴性。Sugawara等[7]發(fā)現(xiàn)花刺參長鏈堿可以顯著抑制人結(jié)腸癌細胞系DLD-1、WiDr和Caco-2的生長增殖，且呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。還有研究證明海綿長鏈堿可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞（U87）和人神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）的增殖活性[20]。

2.5 TH-LCB誘導K562細胞凋亡

圖5 TH-LCB對K562細胞凋亡率的影響Fig.5 Apoptosis rates of K562 cells after treatment with various concentrations of TH-LCB

由圖5可知，早期凋亡細胞指Annexin-PE（+）和Dead Cell Marker（-）的細胞群；晚期凋亡細胞是指Annexin-PE（+）和Dead Cell Marker（+）的細胞群；總凋亡率為早期凋亡率與晚期凋亡率的總和。結(jié)果表明，TH-LCB顯著增加K562細胞的凋亡率，呈劑量依賴效應(yīng)。當TH-LCB為25 μg/mL時，細胞凋亡主要是早期凋亡，隨著TH-LCB質(zhì)量濃度的增加，晚期凋亡的細胞群也逐漸增加，總凋亡率也逐漸增加。當TH-LCB質(zhì)量濃度達到100 μg/mL時，細胞幾乎全部凋亡。流式細胞儀的結(jié)果表明：TH-LCB抑制K562細胞的增殖是通過誘導細胞凋亡實現(xiàn)的。另外，當TH-LCB質(zhì)量濃度高時，K562細胞存活率較低，細胞碎片化程度高，會影響流式細胞儀的檢測結(jié)果。Aida等[8]的研究表明，植物和真菌長鏈堿能誘導人類結(jié)腸癌細胞Caco-2細胞凋亡。Hossain等[9]發(fā)現(xiàn)從海參中提取的長鏈堿可以通過提高DR5和降低p-AKT的蛋白表達，來誘導人肝癌細胞HepG2的凋亡。Hung等[21]研究了鞘氨醇和其他長鏈堿通過激活Caspases來誘導人肝癌Hep3B細胞凋亡。本研究進一步證明了TH-LCB能通過誘導腫瘤細胞凋亡來抑制細胞的增殖活性。

2.6 TH-LCB對K562細胞周期的影響

圖6 不同質(zhì)量濃度TH-LCB對K562細胞周期影響的流式細胞儀檢測結(jié)果Fig.6 Flow cytometric cell cycle analysis of K562 cells after treatment with various concentrations of TH-LCB

表1 不同質(zhì)量濃度TH-LCB對K562細胞周期的影響Table1 Effect of TH-LCB on cell cycle of K562 cells

細胞周期的調(diào)控在細胞增殖和凋亡過程中起著重要的作用。細胞周期可分為G0/G1、S、G2/M 3 個階段，其中G0/G1期是細胞進行大量物質(zhì)合成的時期，為DNA的合成做準備，在S期細胞完成DNA的復制及合成組蛋白，G2/M期是指DNA復制結(jié)束和開始有絲分裂的間隙[22-23]。在正常G0/G1期前出現(xiàn)一個DNA低染細胞群，稱為“sub-G0/G1”，即凋亡峰，該凋亡峰的大小代表凋亡細胞的多少。K562細胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度TH-LCB處理24 h后，檢測結(jié)果如圖6和表1所示，隨著TH-LCB質(zhì)量濃度的增加，sub-G0/G1（凋亡峰）呈上升趨勢，且S期的細胞群逐漸減少。細胞周期結(jié)果表明TH-LCB可以誘導K562細胞的凋亡。Ahn等[24]通過流式細胞儀測定鞘氨醇堿作用結(jié)腸癌細胞后，sub-G0/G1期的細胞群逐漸增多，且將細胞周期阻滯在G2/M期。

2.7 TH-LCB對Caspase-3蛋白表達量的影響

圖7 TH-LCB對K562細胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達的影響Fig.7 Effect of TH-LCB on expression of caspase-3 in K562 cells

Western blot實驗結(jié)果（圖7）表明，0、25、50、100、200 μg/mL TH-LCB處理K562細胞24 h后，細胞內(nèi)促凋亡蛋白Caspase-3的表達量極顯著升高（P＜0.01），呈劑量依賴性。進一步證明TH-LCB對K562細胞具有凋亡誘導作用。Caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者，處于細胞凋亡的下游[25]。經(jīng)典凋亡通路主要有：Bcl-2家族成員介導的線粒體凋亡通路和死亡受體通路，兩者都是通過激活下游的Caspase-3促進細胞凋亡。在死亡受體通路中，死亡信號的傳導依賴于靶細胞表面的死亡配體與攜帶凋亡信號的受體的專一性結(jié)合，并迅速將凋亡信號轉(zhuǎn)導到細胞內(nèi)，激活下游的Caspase-3，從而誘導細胞凋亡[26-27]。在線粒體途徑中，細胞受到凋亡刺激后，線粒體膜通透性增加，細胞色素c迅速從線粒體釋放到胞漿，細胞色素c、Apaf-1、dATP和Caspase-9酶原結(jié)合形成凋亡多聚復合物[28]，激活Caspase-9，接著激活下游的Caspase-3，引起細胞凋亡[29-30]。但TH-LCB對K562細胞的凋亡誘導是通過死亡受體通路還是通過線粒體凋亡通路？還有待于進一步的研究。

3 結(jié) 論

本實驗采用有機溶劑提取法，從羅非魚頭中提取總脂，除雜后經(jīng)硅膠柱分離得到糖脂；接著進行糖脂的皂化、酸水解，得到TH-LCB；最終經(jīng)過硅膠柱線性洗脫和大孔樹脂脫色，得到純化后的TH-LCB。純化后的TH-LCB經(jīng)薄層層析檢識，得到清晰單一的紅紫色斑點。細胞實驗研究了TH-LCB對K562細胞的形態(tài)、增殖活性、細胞周期、細胞凋亡率、Caspase-3蛋白表達量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當TH-LCB質(zhì)量濃度為50 μg/mL時細胞形態(tài)已發(fā)生明顯的變化；TH-LCB作用于K562細胞24 h和48 h后的IC50分別為42.207、39.494 μg/mL；經(jīng)流式細胞儀分析的結(jié)果顯示，隨著TH-LCB質(zhì)量濃度的升高，K562細胞凋亡率逐漸上升，其sub-G0/G1（凋亡峰）也逐漸升高；Western blot結(jié)果顯示，TH-LCB處理K562細胞后細胞內(nèi)Caspase-3的蛋白表達量上升，呈劑量依賴效應(yīng)。

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