米 佳，祿 璐，戴國(guó)禮，何昕孺，李曉鶯，閆亞美*，秦 墾*

（國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002）

枸杞是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物資源，含有多種活性物質(zhì)，如黃酮、類胡蘿卜素、多糖等[1-2]。類胡蘿卜素是枸杞中重要的活性成分之一[3]，具有預(yù)防老年黃斑性病變、抗氧化、抗腫瘤、改善視力等作用[4-6]，也被作為色素和抗氧化劑添加在食品中[7]。枸杞中的類胡蘿卜素含量為干果的0.03%～0.50%[8]，約有10多種，除少量的玉米黃素和β-胡蘿卜素外，97%以上的類胡蘿卜素都是以酯化形式存在[5]，其中含量最多的是玉米黃素雙棕櫚酸酯，約占總類胡蘿卜素含量的80%以上，其次為β-隱黃質(zhì)雙棕櫚酸酯及其異構(gòu)體，含量約為4.8%，此外還有玉米黃素雙棕櫚酸酯異構(gòu)體等[9]。

類胡蘿卜素可以呈現(xiàn)出不同的顏色，玉米黃素呈現(xiàn)黃-橙色，β-隱黃質(zhì)呈現(xiàn)橙色，β-胡蘿卜素呈現(xiàn)橙色[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，紅果枸杞和黃果枸杞中含有豐富的類胡蘿卜素[13]，且黃果枸杞中的類胡蘿卜素含量顯著低于紅果枸杞[14]。枸杞類胡蘿卜素的分析目前主要是通過(guò)溶劑（如石油醚、丙酮、四氫呋喃、乙醚、正己烷等）提取后用紫外分光光度計(jì)或高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行含量檢測(cè)[9,15-16]，不僅提取步驟繁瑣，且操作過(guò)程中有機(jī)溶劑對(duì)人體的傷害較大，而色澤的測(cè)定相對(duì)簡(jiǎn)單快速。研究表明，類胡蘿卜素的含量和組成與果實(shí)的色澤有一定的相關(guān)性[17-19]，目前關(guān)于枸杞類胡蘿卜素及其色澤的相關(guān)性研究較少，因此本研究對(duì)不同枸杞的顏色進(jìn)行量化分析，并測(cè)定其類胡蘿卜素的含量和組成，通過(guò)對(duì)枸杞類胡蘿卜素組成與枸杞色澤的相關(guān)性分析，建立一種枸杞類胡蘿卜素含量和組成的快速判斷方法。較便捷地分析評(píng)價(jià)枸杞類胡蘿卜素的含量及組成。本方法具有零有機(jī)溶劑、簡(jiǎn)單、便捷的優(yōu)勢(shì)，可為枸杞優(yōu)質(zhì)選育及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮枸杞采自銀川國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源圃，經(jīng)國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源室鑒定。取樣時(shí)，隨機(jī)選擇樣樹(shù)不同位置，選取果實(shí)大小及成熟度相對(duì)一致的果實(shí)約50 g，一部分樣品用于快速測(cè)定色澤，一部分樣品用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中備用。

玉米黃素（HPLC純度97%）、β-胡蘿卜素（HPLC純度99%）、β-隱黃質(zhì)（HPLC純度97%）、玉米黃素雙棕櫚酸酯（HPLC純度98%） 瑞士CaroteNature公司；甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚（色譜純） 美國(guó)Thermo Fisher Scientif i c公司；二氯甲烷（色譜純） 美國(guó)Mreda Technology公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CM-5分光測(cè)色儀 日本柯尼卡美能達(dá)控股株式會(huì)社；1260 HPLC系統(tǒng)（G1311C四元泵、G1329B 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A TCC監(jiān)測(cè)器、G1315D二極管陣列檢測(cè)器） 美國(guó)安捷倫科技有限公司；YMC-C30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 日本YMC公司；BS 224 S分析天平 德國(guó)賽多利斯公司；TU1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞顏色特征值的測(cè)定

采用CM-5分光測(cè)色儀進(jìn)行枸杞顏色特征分析。測(cè)定時(shí)使用反射模式，每種枸杞樣品選取5 個(gè)果實(shí)，以白色校正瓷磚為背景，測(cè)量枸杞表面亮度（L）、紅度（a）和黃度（b），根據(jù)式（1）、（2）計(jì)算飽和度（c）和色度角（h）。其中L值表示亮度，黑色亮度最低，白色亮度最高，其間分布著不同的灰色；a值表示從紅色到綠色之間的色彩指數(shù)，紅色為正值，綠色為負(fù)值；b值表示從藍(lán)色到黃色之間的色彩指數(shù)，藍(lán)色為負(fù)值，黃色為正值；c值代表色彩飽和度，c值越大則顏色的鮮艷度越高；h值表示色度角，為0°～360°之間的顏色角，0°～90°為紅色、橙色和黃色，90°～180°為黃色、黃綠色和綠色，180°～270°為綠色、青色和藍(lán)色，270°～360°為藍(lán)色、紫色、洋紅色和紅色[20-21]。

1.3.2 類胡蘿卜素的提取及總含量的測(cè)定

稱取鮮果樣品5 g左右，加3 粒二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）后加液氮研磨，用10 mL四氫呋喃超聲提取10 min，過(guò)濾后收集濾液，濾渣用相同提取工藝提取至無(wú)色，合并濾液后，加20 g無(wú)水硫酸鈉脫水過(guò)濾，于35 ℃濃縮蒸干。然后用二氯甲烷溶解并定容至25 mL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

總類胡蘿卜素含量測(cè)定：取提取液0.5 mL，用石油醚定容到5 mL，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在460 nm波長(zhǎng)處的吸光度A[22]。同法制備不同濃度的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝0.019 8x+0.096 4，R2＝0.993 4，x為吸光度，y為類胡蘿卜素含量/（μg/mL），并由此計(jì)算類胡蘿卜素的總含量。

1.3.3 HPLC法檢測(cè)枸杞中的類胡蘿卜素

1.3.3.1 色譜條件

流動(dòng)相A相：V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（水）∶V（三乙胺）＝81∶14∶5∶0.08，B相：V（甲基叔丁基醚）∶V（二氯甲烷）＝1∶1；梯度洗脫，洗脫程序：0 min，84% A，16% B；22 min，83% A，17% B；40 min，45% A，55% B；55 min，25% A，75% B；60 min，84% A，16% B；70 min，84% A，16% B；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3.2 類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取玉米黃素標(biāo)品0.59 mg、β-胡蘿卜素標(biāo)品0.71 mg、β-隱黃質(zhì)標(biāo)品0.36 mg，玉米黃素雙棕櫚酸酯標(biāo)品0.1 mg，以二氯甲烷溶解配制成玉米黃素對(duì)照品2.36 μg/mL、β-隱黃質(zhì)對(duì)照品1.44 μg/mL、β-胡蘿卜素對(duì)照品1.42 μg/mL、玉米黃素雙棕櫚酸酯對(duì)照品2.0 μg/mL的標(biāo)樣。按上述色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量分別為5、10、15、20、25、30 μL，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：玉米黃素y＝4 412.5x-10.344，R2＝0.998 3，在0.011 8～0.070 8 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；β-隱黃質(zhì)y＝10 299x-16.889，R2＝0.998 8，在0.007 2～0.043 2 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；β-胡蘿卜素y＝7 927.4x-19.833，R2＝0.996 0，在0.007 1～0.042 6 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；玉米黃素雙棕櫚酸酯y＝5 717.2x-58.705，R2＝0.999 9，在0.002 0～0.400 0 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和簡(jiǎn)單相關(guān)性分析；用SIMCA-P 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞色澤

表1 不同枸杞顏色特征值Table1 Color values of different varieties of wolfberry

表1為不同種質(zhì)枸杞顏色特征值，由表1可知，黃果枸杞（S8和S9）的L值顯著高于紅果枸杞（S1～S7）；h值顯著高于紅果枸杞，即黃果枸杞更黃一些，這與我們?nèi)庋鬯吹降念伾嗤?；紅果枸杞的a值較黃果枸杞高，平均為36.18，顯著高于黃果枸杞的平均值16.21；紅果枸杞和黃果枸杞的b值差異不顯著，但是不同種質(zhì)間存在差異；黃果枸杞較紅果枸杞的c值低，即黃果枸杞的鮮艷度顯著低于紅果枸杞[23]。

2.2 枸杞類胡蘿卜素含量和組成

圖1 不同枸杞類胡蘿卜素的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of carotenoids in different varieties of wolfberry

不同種質(zhì)枸杞類胡蘿卜素的HPLC圖如圖1所示，枸杞中主要的類胡蘿卜素有玉米黃素、β-隱黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和玉米黃素雙棕櫚酸酯，其含量見(jiàn)表2，其中S1～S7 7 個(gè)枸杞樣品中均未檢測(cè)到玉米黃素，S8和S9中有少量的玉米黃素，S5和S6的β-胡蘿卜素的含量顯著高于其他種質(zhì)。S7和S8的β-隱黃質(zhì)含量顯著高于其他種質(zhì)的枸杞。黃果枸杞（S8和S9）的玉米黃素雙棕櫚酸酯和總類胡蘿卜素含量顯著低于紅果枸杞（S1～S7）。

表2 不同枸杞類胡蘿卜素組成及其含量Table2 Carotenoids contents and constituents of different varieties of wolfberry

2.3 枸杞顏色特征值與類胡蘿卜素含量和組成的簡(jiǎn)單相關(guān)性分析

枸杞顏色特征值與類胡蘿卜素含量、組成的簡(jiǎn)單相關(guān)性分析結(jié)果如表3所示，其中玉米黃素含量和L值、h值呈顯著性正相關(guān)，即枸杞中玉米黃素含量越高，枸杞的亮度越高，色度角也越高。a值、c值和玉米黃素的含量呈顯著負(fù)相關(guān)，即玉米黃素含量越高，紅度越低，黃度也越低。a值和c值與玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量呈顯著性正相關(guān)；a值和總類胡蘿卜素的含量呈顯著性正相關(guān)，h值和總類胡蘿卜素的含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；b值和類胡蘿卜素各組分的含量沒(méi)有顯著的相關(guān)性。類胡蘿卜素顯示出的不同顏色與其結(jié)構(gòu)中共軛雙鍵的數(shù)量有很大的關(guān)系，如黃色類胡蘿卜素的a值會(huì)隨著共軛雙鍵數(shù)目的降低而降低[24]，而枸杞所含的玉米黃素（雙棕櫚酸酯）、β-胡蘿卜素和β-隱黃質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中的共軛雙鍵數(shù)目相同[25]，這說(shuō)明枸杞類胡蘿卜素造成枸杞表皮顏色的差異不是因?yàn)楦鹘M分的結(jié)構(gòu)差異引起的，可能是因?yàn)殍坭街蓄惡}卜素的組成和含量差異造成的[26]。

表3 枸杞類胡蘿卜素含量和顏色特征值的簡(jiǎn)單相關(guān)性分析Table3 Correlation analysis between color values and carotenoids in wolfberry

2.4 枸杞類胡蘿卜素組成對(duì)不同顏色特征值的影響

2.4.1 亮度L值

圖2 枸杞表皮L值的類胡蘿卜素含量回歸系數(shù)（A）及變量投影重要性指標(biāo)（B）Fig.2 Regression coeff i cient (A) and variable importance value (B) of L value against carotenoid contents in wolfberry

由圖2A可知，枸杞β-胡蘿卜素的含量與L值的負(fù)回歸系數(shù)絕對(duì)值最大，其次是β-隱黃質(zhì)，相關(guān)度的排序?yàn)棣?胡蘿卜素＞β-隱黃質(zhì)＞玉米黃素雙棕櫚酸酯＞玉米黃素＞總類胡蘿卜素，其中玉米黃素的含量和L值呈正相關(guān)。圖2B的重要性指標(biāo)直方圖中，權(quán)重系數(shù)依次為玉米黃素雙棕櫚酸酯＞β-胡蘿卜素＞玉米黃素＞總類胡蘿卜素＞β-隱黃質(zhì)，與2.3節(jié)中簡(jiǎn)單相關(guān)性分析的排序略有不同，但正負(fù)相關(guān)性結(jié)果一致。綜合圖2A、B可知，玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量和L值呈較大的負(fù)相關(guān)，玉米黃素含量與L值是正相關(guān)的。

2.4.2 紅度a值

由圖3A可知，枸杞玉米黃素的含量與a值的負(fù)回歸系數(shù)絕對(duì)值最大，玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量和a值正回歸系數(shù)最大，其次是總類胡蘿卜素含量。圖3B的重要性指標(biāo)直方圖中，權(quán)重系數(shù)依次為玉米黃素雙棕櫚酸酯＞玉米黃素＞總類胡蘿卜素＞β-胡蘿卜素＞β-隱黃質(zhì)，綜合圖3A、B可知，玉米黃素雙棕櫚酸酯、玉米黃素以及總類胡蘿卜素含量對(duì)枸杞a值影響最大，且玉米黃素的含量與a值為負(fù)相關(guān)，與2.3節(jié)中簡(jiǎn)單相關(guān)性分析一致。枸杞果皮a值和總類胡蘿卜素含量呈顯著性正相關(guān)，與Jamal等[27]的研究結(jié)果及周丹蓉等[28]報(bào)道的果皮肉眼色澤為紅色系的品種其類胡蘿卜素含量明顯高于黃色系品種的研究結(jié)果一致。

圖3 枸杞表皮a值的類胡蘿卜素含量回歸系數(shù)（A）及變量投影重要性指標(biāo)（B）Fig.3 Regression coeff i cient (A) and variable importance value (B) of a value against carotenoid contents in wolfberry

2.4.3 黃度b值

由圖4A可知，β-胡蘿卜素的含量與b值呈負(fù)相關(guān)，其他幾種組分以及總類胡蘿卜素的含量與b值呈正相關(guān)，但回歸系數(shù)均較小。圖4B的重要性指標(biāo)直方圖中，權(quán)重系數(shù)依次為β-胡蘿卜素＞玉米黃素雙棕櫚酸酯＞玉米黃素＞總類胡蘿卜素＞β-隱黃質(zhì)，這與2.3節(jié)中的簡(jiǎn)單相關(guān)性分析結(jié)果一致；但與Lu Wenhe等[29]報(bào)道的馬鈴薯中類胡蘿卜素含量和黃度值密切相關(guān)的結(jié)論不一致，這可能是由于兩個(gè)被試材料的類胡蘿卜素組成不同造成的。

圖4 枸杞表皮b值的類胡蘿卜素含量回歸系數(shù)（A）及變量投影重要性指標(biāo)（B）Fig.4 Regression coeff i cient (A) and variable importance value (B) of b value against carotenoid contents in wolfberry

2.4.4 飽和度c

圖5 枸杞表皮c值的類胡蘿卜素含量回歸系數(shù)（A）及變量投影重要性指標(biāo)（B）Fig.5 Regression coeff i cient (A) and variable importance value (B) of c value against carotenoid contents in wolfberry

由圖5A可知，枸杞玉米黃素和β-隱黃質(zhì)的含量與c值的回歸系數(shù)為負(fù)值。β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯和總類胡蘿卜素的含量與c值的回歸系數(shù)為正值。圖5B的重要性指標(biāo)直方圖顯示，權(quán)重系數(shù)依次為玉米黃素雙棕櫚酸酯＞總類胡蘿卜素＞玉米黃素＞β-胡蘿卜素＞β-隱黃質(zhì)，綜合圖5A、B可知，玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量對(duì)c值的影響最大，且為正相關(guān)，這與2.3節(jié)中的簡(jiǎn)單相關(guān)性分析結(jié)果一致。

2.4.5 色度角h

圖6 枸杞表皮h值的類胡蘿卜素含量的回歸系數(shù)（A）及變量投影重要性指標(biāo)（B）Fig.6 Regression coeff i cient (A) and variable importance value (B) of h value against carotenoid contents in wolfberry

由圖6A可知，枸杞玉米黃素的含量與h值的回歸系數(shù)為正值。其他幾個(gè)組分和h值的回歸系數(shù)為負(fù)值。圖6B的重要性指標(biāo)直方圖顯示，權(quán)重系數(shù)依次為玉米黃素雙棕櫚酸酯＞玉米黃素＞總類胡蘿卜素＞β-胡蘿卜素＞β-隱黃質(zhì)，與2.3節(jié)中的簡(jiǎn)單相關(guān)性分析的正負(fù)相關(guān)性結(jié)果一致，但重要度排序略有不同，綜合圖6A、B可知，玉米黃素雙棕櫚酸酯含量和h值呈負(fù)相關(guān)，玉米黃素含量和h值呈正相關(guān)，與Ruiz等[30]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，枸杞果實(shí)的顏色與其類胡蘿卜素的種類和含量有關(guān)。枸杞表皮色度角與總類胡蘿卜素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，黃果枸杞的色度角顯著高于紅果枸杞，而總類胡蘿卜素含量顯著低于紅果枸杞。枸杞紅度越高，其總類胡蘿卜素含量越高。對(duì)枸杞色澤和類胡蘿卜素組分含量的相關(guān)性分析表明亮度和色度角越高，玉米黃素的含量越高；紅度和飽和度越高，玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量越高。枸杞類胡蘿卜素的組分測(cè)定方法繁瑣復(fù)雜，而色澤的測(cè)定則相對(duì)簡(jiǎn)單快速，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究枸杞表皮色澤和類胡蘿卜素及其組分含量之間的關(guān)系，探索了通過(guò)檢測(cè)枸杞表皮的顏色值快速分析枸杞類胡蘿卜素及其組分含量的方法，為枸杞優(yōu)質(zhì)育種和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供技術(shù)參考。

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