張巍，孟慶彬，郭興，李金禹

0 引言

寬葉藍(lán)靛果忍冬（Lonicera edulis var.turczaninowii（Pojark.））為忍冬科忍冬屬植物［1］。筆者于2010年開始對(duì)小興安嶺伊春林區(qū)的寬葉藍(lán)靛果種源進(jìn)行調(diào)查［2-3］，共確定三處野生分布。三個(gè)種源地均為伊春林區(qū)海拔較高地區(qū)，平均海拔分布高度約為550～1 400m左右［3-5］。為揭示寬葉藍(lán)靛果不同種源間的遺傳差異，運(yùn)用ISSR-PCR分子標(biāo)記分析方法對(duì)高海拔地區(qū)寬葉藍(lán)靛果各野生分布種群的遺傳多樣性水平和遺傳距離進(jìn)行標(biāo)記分析，希望可以為寬葉藍(lán)靛果不同種源的綜合評(píng)價(jià)及利用提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣本

所用供試藍(lán)靛果分別來(lái)自帶嶺大菁山、南岔黃花山、桃山平頂山三個(gè)種源地。其中，帶嶺大菁山選取2個(gè)種源地，每個(gè)種源各采集10個(gè)樣本，南岔黃花山選取1個(gè)種源地共采集10個(gè)樣本，桃山平頂山選擇2個(gè)種源地各采集6個(gè)樣本。樣本收集后馬上置于-20℃低溫保存。各樣本的名稱和采集地參見表1。

表1 供試樣本及采集地Tab.1 Sample and collection site

1.2 引物篩選

試驗(yàn)用引物編號(hào)及其核酸序列（上海生工生物工程公司，Sangon）見表2。

表2 供試引物Tab.2 Test primers

1.3 藍(lán)靛果總DNA提取

試驗(yàn)參考霍俊偉等的試驗(yàn)方法［6-10］。采用CTAB提取寬葉藍(lán)靛果葉片總DNA，從上清液中獲取的DNA得率高，DNA電泳條帶清晰［11-12］。

1.4 ISSR-PCR

反應(yīng)體系為20 μL，包括1×Buffer，2.0 mmol/L MgCl2，引物1.5 ng/μL，dNTP的濃度為0.2 mmol/L，TaqDNA聚合酶的用量為1U，模板DNA的用量為20～40 ng，TaqDNA聚合酶、引物、dNTP由上海生工生物工程（Sangon）公司提供。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性4 min，94℃變性1 min ，36℃退火 40s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min；4℃保存。

1.5 電泳檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理

PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠于不超過(guò)5 V/cm的電壓下電泳，電極緩沖液為1×TAE，在含有0.5 ug/mlEB中染色30 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。將瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)DNA片段的計(jì)為1，不出現(xiàn)的為0，各數(shù)據(jù)計(jì)算公式如下：

（1）遺傳相似系數(shù)（genetic similarity，GS）公式［6］：

式中：Nij為基因型間共有帶數(shù)目；Ni和Nj為兩基因型各自的條帶數(shù)目。

（2）遺傳距離（genetic distance，GD）公式：

（3）有效等位基因數(shù)公式:

式中：fi2為第i個(gè)等位基因的頻率。

（4）Nei’s基因多樣性指數(shù)He（Nei，1978）［11-13］

式中：Pi為單個(gè)位點(diǎn)上的等位基因的頻率。

（5）Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳指數(shù)公式［8］：

式中：Nxy為材料X、Y公共帶數(shù)；Nx為材料X的帶數(shù)；Ny為材料Y的帶數(shù)。

以上數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)后輸入電腦，用NTSYS聚類分析軟件進(jìn)行UPGMA法聚類分析并構(gòu)建聚類圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 種源間的ISSR多態(tài)性分析

某個(gè)位點(diǎn)有兩個(gè)以上等位基因，該位點(diǎn)就稱為多態(tài)性位點(diǎn)。多態(tài)性位點(diǎn)占同工酶分析的總位點(diǎn)數(shù)的百分比即為多態(tài)性位點(diǎn)百分率［8-10］。對(duì)采自不同海拔區(qū)域野生群落的42個(gè)寬葉藍(lán)靛果單株進(jìn)行分子標(biāo)記分析。結(jié)果表明，試驗(yàn)所選用的10個(gè)引物所擴(kuò)增出的條帶穩(wěn)定性及可重復(fù)性均表現(xiàn)顯著。試驗(yàn)共擴(kuò)增出68個(gè)條帶，特異性位點(diǎn)百分率54.41%，其中特異性條帶數(shù)37個(gè)，平均每個(gè)引物共產(chǎn)生3.7個(gè)特異性條帶（表3）。

表3 ISSR分析的10條引物及其擴(kuò)增產(chǎn)物Tab.3 ISSR analysis of 10 primers and their amplification products

圖1 ISSR電泳圖譜（引物OPA-02）Fig.1 ISSR electrophoresis pattern (primer OPA-02)

圖2 ISSR電泳圖譜（引物OPF-08）Fig.2 ISSR electrophoresis pattern (primer OPF-08)

由表3可知，10個(gè)引物中，OPA-02引物擴(kuò)增的條帶數(shù)最多（圖1），但多態(tài)位點(diǎn)比率相對(duì)較少。而OPB-08和OPF-08兩個(gè)引物多態(tài)位點(diǎn)比率均達(dá)到71.43%，表明上述兩個(gè)引物可以檢測(cè)到更為豐富的多態(tài)性（圖2）。同時(shí)，以上數(shù)據(jù)也表明，寬葉藍(lán)靛果種間在分子水平上的多態(tài)性是豐富的，這為今后藍(lán)靛果ISSR引物的定向開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2.2 遺傳多態(tài)位點(diǎn)分析

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，也是生物多樣性最重要的部分［11-13］。通過(guò)對(duì)大菁山、黃花山和平頂山三處種源地的遺傳多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明，平頂山種源區(qū)遺傳豐富度最高，共檢測(cè)出遺傳多態(tài)性位點(diǎn)24個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率達(dá)到35.29%。而黃花山和大菁山兩處種源地檢測(cè)出的遺傳多態(tài)性位點(diǎn)同為19個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率同為27.94%（表4）。

表4 各種群多態(tài)位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistical analysis of polymorphic loci

從表4可知，不同種群的多態(tài)位點(diǎn)比率在16.18%～30.88%。通過(guò)對(duì)三個(gè)種源區(qū)劃的5個(gè)寬葉藍(lán)靛果天然群落的檢測(cè)表明，大菁山和黃花山的遺傳豐富度相近，平頂山遺傳豐富度相對(duì)較高。在本次試驗(yàn)中，出現(xiàn)了同一種源區(qū)劃的兩個(gè)采集樣方多態(tài)位點(diǎn)比率相差較大的情況，這可能因?yàn)閷捜~藍(lán)靛果種群受高海拔自然因子局限，導(dǎo)致不同樣區(qū)遺傳豐富度產(chǎn)生差異。

通過(guò)GPS定位測(cè)距表明，黃花山種源帶與大菁山種源帶地理位置直線距離為27 km，大菁山種源帶與平頂山種源帶的地理直線距離為53 km，而黃花山種源帶與平頂山種源帶地理直線距離為76.9 km。衛(wèi)星地圖觀測(cè)，各種源地山系間均有天然地貌阻隔，獨(dú)立成峰未交集。伊春林區(qū)地處小興安嶺南坡的中心地帶，其群落構(gòu)成、山脈走向、成土結(jié)構(gòu)等均具有小興安嶺山脈的典型特征。三處種源地共同處于小興安嶺山脈，屬于同一地理區(qū)劃。經(jīng)計(jì)算，親源關(guān)系也維持在0.83水平。但另一方面，三處種源地海拔高度有所差異，黃花山海拔高度600 m左右，為三個(gè)種源地最低。大菁山種源地海拔1 000 m左右，平頂山種源平均分布在海拔1 400m左右。在對(duì)不同海拔群落多樣性的調(diào)查表明，不同海拔寬葉藍(lán)靛果群落生物多樣性有明顯差異，而海拔1 000m為寬葉藍(lán)靛果林型過(guò)渡帶［4］。由此可見，不同群落的遺傳差異有可能是海拔高度差異、群落自身大小及地理距離差異共同作用的結(jié)果。

2.3 遺傳距離和親緣關(guān)系分析

Nei指數(shù)（H）、Shannon指數(shù)（I）和有效等位基因數(shù)（Ne）是衡量種源遺傳多樣性的重要參數(shù)［12-15］。以相似性系數(shù)公式（GS）對(duì)三處種源進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算，結(jié)果表明，大菁山和黃花山兩處種源遺傳相似系數(shù)為0.27，遺傳距離為0.73，表明兩處種源親源關(guān)系較近。而平頂山與大菁山、黃花山種源地的遺傳系數(shù)均為0.5，表明平頂山種源區(qū)與其它兩處種源的親源關(guān)系較遠(yuǎn)。用 Nei指數(shù)（H）對(duì)種群間遺傳距離進(jìn)行測(cè)算表明，大菁山與黃花山種源的親源關(guān)系最近，其測(cè)算值為0.349，與平頂山親源關(guān)系最遠(yuǎn)，其測(cè)算值為0.534。而黃花山與平頂山測(cè)算的遺傳指數(shù)為0.39。

表5 各種源多態(tài)性統(tǒng)計(jì)Tab.5 Various sources of polymorphism statistics

進(jìn)行遺傳多樣性分析結(jié)果表明（表5），Shannon多態(tài)性總體處于0.124 5～0.234 7，總體平均值為0.170 3，其中平頂山多態(tài)性最為豐富。Nei指數(shù)總體分布于0.062 5～0.065 3，總體平均值為0.126 1。Nei指數(shù)測(cè)算得到的結(jié)果與Shannon指數(shù)所得到的測(cè)算結(jié)果基本一致。

對(duì)42個(gè)單株進(jìn)行聚類分析并建立樹狀圖（圖3），結(jié)果表明各單株的遺傳距離總體分布在0.80～0.99。其中A4、A5單株，B7、B9單株，C9、C10單株及E3、E5單株等遺傳距離都達(dá)到了0.99，表明具有效高的親源關(guān)系，而D4、D5單株在此次分析中與其它單株的遺傳距離最遠(yuǎn)。總體分析，各單株的遺傳距離分布基本與種源分布密切相關(guān)。其中，大菁山A和B兩處分布單株親源關(guān)系較為集中，達(dá)到0.92水平。而黃花山各單株組內(nèi)相對(duì)集中，組間的遺傳距離與大菁山更為接近，這也與之前筆者對(duì)各種源進(jìn)行遺傳系數(shù)測(cè)算的結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

（1）利用所篩選出來(lái)的10個(gè)引物運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記手段對(duì)寬葉藍(lán)靛果不同海拔種源進(jìn)行分析，共檢測(cè)到68個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)比率在20%～71.43%。其中，平頂山群落多態(tài)位點(diǎn)比率最高為30.88，最低為16.18，表明組內(nèi)遺傳差異較大。而大菁山和黃花山組內(nèi)差異相對(duì)較小。

圖3 寬葉藍(lán)靛果42個(gè)品種聚類分析樹狀圖Fig.3 The broad leaf of Lonicera edulis 42 varieties of the dendrogram of cluster analysis

（2）通過(guò)本次檢測(cè)證明，寬葉藍(lán)靛果不同種源間存在一定差異性。其中大菁山與黃花山親源關(guān)系更為接近，而平頂山親源關(guān)系較遠(yuǎn)。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與地理距離及海拔高度有關(guān)。

（3）對(duì)3個(gè)種源分布的遺傳距離進(jìn)行測(cè)算表明，平頂山遺傳豐富度明顯高于其它種源，證明種群內(nèi)基因流較強(qiáng)，種群總體處于活躍狀態(tài)。同時(shí)也證明寬葉藍(lán)靛果種群在長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)完成了對(duì)高海拔地區(qū)環(huán)境因子的適應(yīng)。

［1］周以良, 董世林, 聶紹荃.黑龍江樹木志［M］.哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社, 1986.

［2］張巍, 王洪學(xué), 王洪剛, 等.伊春林區(qū)藍(lán)靛果種質(zhì)資源調(diào)查研究 ［J］.森林工程 , 2014, 30(1)：46-48.

［3］李紅莉, 龍作義, 逄宏揚(yáng).東北地區(qū)野生藍(lán)靛果忍冬果實(shí)形態(tài)變異研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42(30) : 10705 -10707.

［4］張巍, 孟慶彬, 王洪剛, 等.寬葉藍(lán)靛果在不同海拔分布的生物多樣性分析［J］.森林工程, 2017, 33(3): 28-32.

［5］蘭士波.藍(lán)靛果忍冬生態(tài)耦合性分析與遺傳效應(yīng)評(píng)價(jià)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(33)：12843-1284.

［6］霍俊偉.藍(lán)靛果忍冬(Lonicera L.subsect.Caeruleae)生物學(xué)特性及種質(zhì)資源的RADP研究 ［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

［7］劉萬(wàn)勃, 宋明, 劉富中, 等.RAPD和ISSR標(biāo)記對(duì)甜瓜種質(zhì)遺傳多樣性的研究［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2002, 10(3): 231-236.

［8］趙雷, 張繼蘭.云南松ISSR-PCR反應(yīng)體系建立及優(yōu)化［J］.北方園藝, 2012(12)：130-133.

［9］霍俊偉, 睢薇.藍(lán)果忍冬種間遺傳多樣性及親緣關(guān)系的ISSR研究 ［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 31(5)：516-520.

［10］孫岳, 李景鵬, 金元昌, 等.南、北五味子ISSR鑒別研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2003, 31(1)：29-31.

［11］劉萬(wàn)勃, 宋 明, 劉富中, 等.GAPD和ISSR標(biāo)記對(duì)甜瓜種質(zhì)遺傳多樣性的研究［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2002,10(3): 231-236.

［12］徐娜, 夏秀英, 徐大可, 等.越橘基因組DNA的快速提取及分析［J］.果樹學(xué)報(bào)2007, 24(5)：714-717.

［13］謝運(yùn)海.東北地區(qū)水曲柳地理種源遺傳多樣性分析及優(yōu)良種源選擇 ［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué), 2005.

［14］ 周延清, 楊清香, 張改娜.生物遺傳標(biāo)記與應(yīng)用 ［M］.北京,化學(xué)工業(yè)出版社, 2008.

［15］張巍, 王清君, 郭興.紅松不同種源的遺傳多樣性分析［J］.森林工程, 2017, 33(2): 17-21.

［16］顏承云, 楊治偉, 劉娟.黑龍江省藍(lán)靛果忍冬的資源調(diào)查［J］.中國(guó)野生植物資源, 2002, 21(2)：18-19.