羅秋蘭，王潮崗，胡章立

1) 深圳大學生命與海洋科學學院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東深圳 518060；2) 深圳大學光電工程學院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室，廣東深圳 518060；3) 深圳大學龍華生物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院，深圳市海洋藻類生物工程技術(shù)研究中心，廣東深圳 518060；4) 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?570100

微藻是一類直徑在2～200 μm，具有光合作用，分布于各種水體(海水和淡水)的生物[1]. 在能源危機和環(huán)境污染日益加劇的今天，微藻被認為是生產(chǎn)生物柴油的理想來源[2]. 由于生產(chǎn)成本居高不下，微藻生物柴油的發(fā)展受到極大的限制[3].篩選和改良獲得優(yōu)良藻株一度成為研究的熱點. 利用基因工程和代謝工程，人工制造工程藻株是最簡單、最直接的方法，可以快速獲得理想的工程藻株以滿足各種生產(chǎn)需求，但是需要對微藻油脂代謝和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)了解清楚.

萊茵衣藻是產(chǎn)油微藻重要的模式生物，基因組序列已知，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫完備，分子生物學和代謝方法日趨成熟[4-5]. 現(xiàn)代分子表達譜技術(shù)和蛋白組學的發(fā)展，也使得深入研究微藻在環(huán)境脅迫下油脂積累的細胞活動成為可能[6]. 萊茵衣藻在缺氮脅迫時，最先響應(yīng)的是應(yīng)激反應(yīng)和碳同化過程酶，隨之油脂生物合成酶的含量增加，用于積累短鏈的游離脂肪酸[7]. 細胞通過代謝調(diào)節(jié)適應(yīng). 萊茵衣藻油脂代謝途徑已經(jīng)闡明，許多關(guān)鍵酶基因已被克隆. 萊茵衣藻中存在著兩條途徑最終生成三酰甘油(triacylglycerols，TAGs)——生物柴油的主要成分，分別是Kennedy途徑和PDAT途徑. 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylgycerol acyltransferase，DGATs)和磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(phospholipids: diacylglycerol acyltransferase，PDATs)是重要的油脂合成關(guān)鍵限速酶[8-9]. 同時，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)和甘油三磷酸脫氫酶(glycerol 3-phosphate dehydrogenase，G3PD)等其他碳代謝相關(guān)酶在微藻TAGs合成中也發(fā)揮著重要的作用[10-11]. 對這些關(guān)鍵酶基因進行調(diào)控表達時，人們發(fā)現(xiàn)無法同時提高微藻油脂含量和生物量[12-13].

如何同時提高油脂含量和生物量是微藻生物柴油生產(chǎn)面臨的重要問題.微藻大多為單細胞生物，進行無性繁殖. 微藻的生物量綜合取決于細胞的數(shù)目和大小，而細胞周期嚴格地控制著細胞的數(shù)量. 細胞周期一般分為親代細胞物質(zhì)準備和細胞分裂形成兩個子代細胞兩個階段，標準的細胞周期劃分為第1間隔期(G1期)、脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)合成期(S期)、第2間隔期(G2期)分裂期(M 期)4 個不同時相[14]. 細胞周期進程受到各級調(diào)控因子精確而嚴密的控制，包括細胞周期依賴的蛋白激酶復(fù)合物(cyclin-dependent kinase complex，CDK)、CDK的正性調(diào)控因子——細胞周期蛋白和CDK的負性調(diào)控因子——CDK的抑制劑(cyclin dependent kinase inhibitor，CKI)[15]. APC/C主要通過泛素化降解細胞周期蛋白CDK、Cyclin和CKI等，來實現(xiàn)對細胞周期的精細調(diào)控.APC/C是一種E3泛素連接酶復(fù)合體，由至少11個不同的蛋白亞基組成[16]，其活性受兩個激活因子(CDH1和CDC20)調(diào)控. 泛素激活酶E1在ATP水解能參與下將泛素Ub激活，激活后的泛素從E1轉(zhuǎn)移至與APC/C結(jié)合的泛素結(jié)合酶E2，共同特異性識別靶蛋白，對靶蛋白的賴氨酸殘基進行泛素化修飾，最后形成一個包含異肽鍵的泛素-蛋白結(jié)合物，被26S蛋白酶體識別降解.CDC20(又稱Sln1，F(xiàn)zy，p55CDC)和CDH1(又稱Hct1，Ste9/SRW1，F(xiàn)ZR)既是APC/C復(fù)合物中重要的輔助因子，又是APC/C復(fù)合物特異性識別并集合底物蛋白質(zhì)的關(guān)鍵所在[17]. 文獻[18]研究表明，細胞中CDC20的表達峰值出現(xiàn)在G2期至M期，而CDH1的表達高峰在M期至G1期. 在微藻中這些APC/C復(fù)合物各個亞基的情況是怎么樣的，目前尚處于未知狀態(tài).

本研究系統(tǒng)地分析了萊茵衣藻中編碼APC/C復(fù)合物的基因家族，并對APC/C復(fù)合物的蛋白質(zhì)特性進行分析，同時，揭示CrCDC20基因在缺氮或缺硫條件下的表達情況，為后期研究微藻細胞周期控制的分子機制奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 藻株及培養(yǎng)條件

萊茵衣藻藻株cc124購自萊茵衣藻資源中心(https://www.chlamycollection.org/).從固體平板上挑取藻株到HSM培養(yǎng)基中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中(培養(yǎng)條件：25 ℃，24 h全光照，光照強度90 μE·m-2·s-1)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期.

1.2 萊茵衣藻APC/C序列信息獲取

萊茵衣藻基因組V5.5版本及蛋白質(zhì)序列下載于植物基因組學網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html). 分析目前NCBI(national center for biotechnology information)中已登錄的APC/C蛋白質(zhì)的氨基酸序列，以保守性區(qū)作為種子序列，運用HMMER3.1b2軟件(http://www.hmmer.org/)對萊茵衣藻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行檢索，去除冗余序列，獲得萊茵衣藻APC/C復(fù)合物蛋白質(zhì)序列. 通過本地Blast程序，獲得萊茵衣藻APC/C編碼基因信息，其基因結(jié)構(gòu)運用GSDS2.0軟件進行分析.

1.3 萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)特性分析

運用ExPASy計算平臺(http://www.expasy.org/)對萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小(1 u=1 D)、等電點、親疏水性和結(jié)構(gòu)域等特性進行分析.通過BLASTp在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性搜索獲得萊茵衣藻APC/C同源蛋白質(zhì)，序列利用MEGA7.0軟件進行ClustalW比對，采用鄰接法則(Neighbour-Joining，NJ)的P-距離模型構(gòu)建進化樹，設(shè)定自展值為1 000.利用WoLF PSORT軟件(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)對萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)進行定位預(yù)測.

1.4 缺氮或缺硫脅迫下CrCDC20表達譜分析

取對數(shù)生長期的萊茵衣藻細胞，按照體積比為1∶2接種，分別進行正常、缺氮或缺硫培養(yǎng)0、2、4、6和8 d，離心收集藻細胞，液氮速凍，用于總RNA提取，設(shè)定3個生物學重復(fù).采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA. 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計CrCDC20定量引物. 使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara Bio Inc. Otsu, Japan)進行實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, rt-RT-qPCR)，分析缺氮或缺氮脅迫下不同時間內(nèi)CrCDC20表達量的變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 萊茵衣藻APC/C基因序列信息的挖掘

本研究以目前NCBI中已登錄的APC/C蛋白質(zhì)保守性區(qū)為種子序列，通過HMMER3.1b2軟件，對萊茵衣藻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索，去除冗余序列，最終獲得13個萊茵衣藻APC/C復(fù)合物氨基酸序列，其中包含了CDC20和CDH1兩個激活因子. 對萊茵衣藻APC/C復(fù)合物的編碼基因進行分析發(fā)現(xiàn)，13個APC/C成員的長度差別很大，基因序列從1 099～20 735堿基對(base pair, bp)，編碼蛋白的氨基酸數(shù)目在66～4 087不等(表1). 萊茵衣藻APC/C編碼基因在13號染色體上呈基因簇出現(xiàn)，包含了CrAPC1、CrAPC6、CrAPC10和CrAPC11， 其他的APC/C基因分別位于第1、3、9、10、12、16和17號染色體上(表1).

表1 萊茵衣藻APC/C基因序列信息

(續(xù)表1)

2.2 萊茵衣藻APC/C基因結(jié)構(gòu)

通過GSDS2.0軟件分析了萊茵衣藻APC/C的基因結(jié)構(gòu)(圖1). 由圖1可知，CrCDC20、CrAPC10和CrAPC11無內(nèi)含子，CrCDC28和CrAPC13分別含有3個和1個內(nèi)含子，其余的萊茵衣藻APC/C基因都具有超過10個以上的內(nèi)含子. 此外，萊茵衣藻APC/C基因均含有長度不等的5′-或3′-非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)，說明萊茵衣藻的APC/C基因編碼方式較為復(fù)雜.

2.3 萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)特性分析

采用Expasy分析萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小、等電點和親疏水性，如表2，表2結(jié)果顯示，CrAPC/C蛋白質(zhì)具有極強的親水性，均為親水性蛋白質(zhì).CrAPC/C的相對分子質(zhì)量大小很不一致，范圍在7.37～390.41 kD，等電點范圍在4.34～9.02.

圖1 萊茵衣藻APC/C基因結(jié)構(gòu)組成Fig.1 The structures of APC/C genes in C. reinhardtii

蛋白相對分子質(zhì)量/kD等電點蛋白相對分子質(zhì)量/kD等電點蛋白相對分子質(zhì)量/kD等電點蛋白相對分子質(zhì)量/kD等電點CrCDC2050．508．54CrAPC2142．075．91CrAPC5103．995．97CrAPC1016．576．18CrCDH145．989．02CrAPC3108．667．70CrAPC690．215．71CrAPC119．926．25CrCDC28103．598．06CrAPC4103．324．78CrAPC885．335．89CrAPC137．374．34CrAPC1390．418．70

對萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進行分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)CrCDC20和CrCDH1具有7個WD40重復(fù)基序；CrAPC3、CrAPC6和CrAPC8包含多個34肽重復(fù)序列基序(tetratricopeptide repeat，TPR)；CrAPC2和CrAPC10含有APC復(fù)合物特定的結(jié)構(gòu)域，其中，CrAPC2包含的APC2結(jié)構(gòu)域與cullin結(jié)構(gòu)域十分類似；APC11含有一個RING結(jié)構(gòu)域；這些結(jié)構(gòu)域可能是萊茵衣藻APC/C復(fù)合物生物活性的關(guān)鍵中心.WoLF PSORT軟件預(yù)測所有的萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)都定位于細胞核中，參與細胞周期控制.

圖2 萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域Fig.2 Domain of APC/C proteins in C. reinhardtii

2.4 萊茵衣藻APC/C進化樹分析

通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析萊茵衣藻(Chlamydomanosreinhardtii，Cr)APC/C蛋白質(zhì)和模式生物擬南芥(Arabidopisisthaliana，At)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，Sc)、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe972h，Sp)、大豆(Glycinemax，Gm)、人(Homosapiens，Hs)、斑馬魚(Daniorerio，Dr)、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，Ce)、小鼠(Musmusculus，Mm)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster，Dm:)、盤基網(wǎng)柄(Dictyosteliumdiscoideum，Dd)和杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani，Ld)來源的APC/C蛋白質(zhì)的進化關(guān)系. 由圖3可以看出，除了CDH1和CDC20與其他物種具有較高保守性外，萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)具有獨特性，CrAPC1、CrAPC3、CrAPC4、CrAPC5、CrAPC6、CrAPC10和CrAPC13聚為一類. CrAPC2與動物來源APC蛋白質(zhì)親緣關(guān)系更近，而CrAPC8和CrCDC28與植物來源APC蛋白質(zhì)相似度更高.

圖3 萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CrAPC/C proteins

2.5 萊茵衣藻CrCDC20基因表達譜分析

缺氮或缺硫培養(yǎng)是常用的誘導萊茵衣藻積累油脂的脅迫條件. CDC20是真核生物APC/C復(fù)合物的核心亞基. 為了闡述CrCDC20在缺氮或缺硫脅迫下的表達規(guī)律，本研究分別提取了缺氮或缺硫0、2、4、6和8 d的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行了rt-RT-qPCR. 結(jié)果顯示，CrCDC20在缺氮培養(yǎng)時呈下調(diào)表達，在第8天表達量最低，下調(diào)了79.7%；缺硫脅迫誘導CrCDC20上調(diào)表達，在缺硫第4天出現(xiàn)了高峰值，上調(diào)了4.5倍(圖4). 由圖4可見，缺硫脅迫誘導CrCDC20表達，缺氮時CrCDC20表達受到抑制.

圖4 缺氮或缺硫脅迫時CrCDC20基因表達譜Fig.4 The expression profiles of CrCDC20 under nitrogen or sulfur deficiency condition

3 討 論

本研究系統(tǒng)比較分析了萊茵衣藻APC/C蛋白質(zhì)以及編碼基因的結(jié)構(gòu)與分子特征，為以后研究細胞周期調(diào)控的APC/C目的基因和蛋白質(zhì)提供了方便. 萊茵衣藻APC/C基因家族共有13個成員，其中，包含兩個激活因子CrCDC20和CrCDH1(表1). APC/C蛋白質(zhì)復(fù)合體是細胞周期控制的重要調(diào)控元件，一般由11個以上的APC蛋白質(zhì)和2個激活因子組成.高等動物中APC2和APC11是APC/C復(fù)合體的主要骨架和基本組成，僅有APC2和APC11即可完成APC/C復(fù)合體的泛素化降解作用[16]. 動物來源的APC2蛋白質(zhì)含有cullin結(jié)構(gòu)域而APC11具有一個RING-H2結(jié)構(gòu)域，本研究發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻APC2和APC11具有類似的結(jié)構(gòu)域(圖2)，且萊茵衣藻APC2與動物的APC2蛋白質(zhì)同源性更高(圖3)，可能萊茵衣藻APC/C復(fù)合體與動物中的APC/C復(fù)合體作用方式相似.

光合微藻可以通過交替的光-暗周期實現(xiàn)同步化培養(yǎng)[19]. 萊茵衣藻在一個光-暗周期內(nèi)可以通過有絲分裂從一個母細胞產(chǎn)生2～32個子細胞．藻細胞在G1期進行增長，體積增大數(shù)倍，再經(jīng)歷n次有絲分裂期，產(chǎn)生2n子細胞. 細胞分裂的次數(shù)取決母細胞的大小，同時受到光照強度、營養(yǎng)供給和溫度的調(diào)節(jié)[20]. 藻細胞中油脂的合成同樣受到細胞周期的調(diào)控，細胞質(zhì)和質(zhì)體膜中的油脂合成發(fā)生在光階段的早期，在之后的細胞周期中維持著一個較穩(wěn)定的水平；TAG的積累模式與膜脂不同，在光階段的2 h內(nèi)急速合成，在2～8 h內(nèi)出現(xiàn)一個降解峰，隨后又逐漸合成，直到進入G0期(16 h)，又出現(xiàn)降解，呈現(xiàn)一種明顯的周期變化[21].

缺氮或缺硫脅迫是常見的萊茵衣藻產(chǎn)油誘導條件. 缺氮下萊茵衣藻的油脂含量可以比在完全培養(yǎng)基(Sueoka’s high salt medium，HSM)中提高十幾倍，但是生物量的積累卻不及HSM中的1/10[22]，缺硫脅迫下，萊茵衣藻油脂上升的同時生物量也在下降[23]. 本研究分析了APC/C復(fù)合物中的激活因子CrCDC20在缺氮或缺硫條件下的表達量，發(fā)現(xiàn)CrCDC20在缺氮或缺硫條件下基因表達正好相反，缺氮時CrCDC20表達受到抑制，而缺硫能顯著誘導其表達(圖4)，這可能是由于缺氮和缺硫下APC/C復(fù)合物對細胞生理活動的調(diào)控方式是不一樣的.

真核細胞中APC/C復(fù)合物除了調(diào)控細胞周期，還具有多種其他的功能，如影響配子發(fā)生、激素信號轉(zhuǎn)導、與雙鏈RNA結(jié)合蛋白4(double stranded RNA binding protein 4，DRB4)結(jié)合控制RNA沉默[24-25]. 目前APC/C復(fù)合物在微藻中的研究還很少見，APC/C復(fù)合物的功能還有待進一步發(fā)現(xiàn)，它們參與細胞生理活動調(diào)控的分子機制尚不清楚，需要深入研究. 微藻除了生產(chǎn)生物柴油，由于它們還可以大量積累各種各樣生物活性物質(zhì)，如葉黃素、蝦青素、胡蘿卜素和藻藍蛋白等，用于食品、化妝品、保健品和藥品等行業(yè)[26]，研究調(diào)控細胞周期的APC/C復(fù)合物的功能，為提高微藻的生物量積累奠定基礎(chǔ)，具有十分重要的理論和經(jīng)濟價值.

結(jié) 語

本研究通過生物信息學方法，對萊茵衣藻APC/C復(fù)合物的蛋白質(zhì)及其編碼基因進行系統(tǒng)比較分析，共發(fā)現(xiàn)了13個萊茵衣藻APC/C復(fù)合物亞基，其中，包括保守的激活因子CDC20和CDH1.發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻APC/C基因在13號染色體上成簇出現(xiàn)，部分萊茵衣藻APC/C復(fù)合物亞基具有物種特有性.同時發(fā)現(xiàn)CrCDC20基因在缺氮下顯著下調(diào)而在缺硫脅迫時上調(diào)，為后期研究微藻細胞周期控制的分子機制奠定了理論基礎(chǔ).

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