馬艷君，阿比克哈莫，湯承，岳華

（西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041）

2017年4月，四川省某肉牛場從外省購回32頭3～4月齡的西門塔爾?；蛭麟s牛，24頭在運回后7～10d發(fā)病，主要臨床癥狀為精神沉郁、食欲下降，鼻鏡干燥、流出黃白色膿性鼻液，呼吸困難、體溫升高，部分病牛結(jié)膜發(fā)炎、流淚等。本試驗采集患病牛的深部鼻腔棉拭子，對病原進行了分離鑒定，并對分離株的敏感性藥物進行了篩選。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 患呼吸道疾病的牛鼻腔棉拭子24份，編號1～24。

1.2 菌株和引物 臨床樣本檢測參照文獻[1]特異性檢測牛支原體的PCR方法，設(shè)置引物靶基因為oppD/F，擴增片段大小為448bp；采用文獻[2]報道的PCR方法進行分離菌株的鑒定，引物為靶向支原體屬16S rRNA的通用引物，擴增片段為1021bp。以上兩條引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。用于質(zhì)控的牛支原體菌株由本實驗室分離保存。

1.3 主要試劑 支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基、支原體瓊脂培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司，Taq酶、DNA MakerⅡ均購自TAKARA公司，馬血清購自Hyclone公司，Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司，土霉素、鏈霉素、氟苯尼考、慶大霉素等藥物購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所或Sigma公司。

1.4 牛支原體的PCR檢測 用1mL PBS充分洗滌臨床樣本，經(jīng)12000r/min 4℃離心30min后，運用常規(guī)酚-氯仿法提取沉淀中的DNA作為模板，參照文獻[1]報道的方法進行檢測，同時以牛支原體為陽性對照，以無模板對照為陰性對照，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。

1.5 牛支原體的分離培養(yǎng) 將浸泡有鼻腔棉拭子的支原體液體培養(yǎng)基（1mL）經(jīng)渦旋混勻后，吸取液體經(jīng)4000r/min 4℃離心5min，上清用0.45μm細菌濾器過濾，取0.2mL濾液接種至1.8mL支原體液體培養(yǎng)基中，并進行10倍梯度稀釋，稀釋到10-7，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，每天觀察，當培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)槌赛S色且澄清透亮時，再涂布于支原體固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5d，光學顯微鏡下低倍觀察菌落形態(tài)，同時挑取單菌落接種于支原體液體培養(yǎng)基，經(jīng)三次純化后凍干保存。

1.6 基于16S rRNA序列的支原體種鑒定和系統(tǒng)進化分析 用酚-氯仿法提取支原體液體純培養(yǎng)物的DNA作為PCR檢測的模板，采用文獻[2]的方法進行檢測，以無模板對照為陰性對照，以牛支原體為陽性對照，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用Gel Extraction Kit對目的片段進行純化回收，送上海生工生物工程股份有限公司測序。

用DNAman對測序結(jié)果進行同源性比對，選取GenBank數(shù)據(jù)庫中不同國家不同地域的牛支原體株的16S rRNA基因序列，運用Mega5.0軟件構(gòu)建進化樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.7 藥敏試驗 隨機選取4株分離株，參考文獻[3]的微量稀釋法對泰樂菌素、慶大霉素等8種藥物的最低抑菌濃度（MIC）進行測定。

圖1 部分樣本PCR擴增電泳圖

2 結(jié)果

2.1 牛支原體的PCR檢測結(jié)果 凝膠電泳結(jié)果顯示，有23份臨床樣本擴增出目的條帶，如圖1所示。

2.2 牛支原體的分離培養(yǎng) 將23份陽性樣本接種于支原體液體培養(yǎng)基，其中10份樣本在培養(yǎng)3～4d時培養(yǎng)基澄清且變成了橙黃色，將變色的培養(yǎng)基涂布于支原體固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5d，結(jié)果出現(xiàn)了針尖大小的菌落，用普通光學顯微鏡觀察可見菌落呈現(xiàn)中間凸起的“煎蛋樣”。將分離到的10株牛支原體編號為SC-1～SC-10。

2.3 支原體種鑒定和系統(tǒng)進化分析

2.3.1 基于16S rRNA序列的支原體種鑒定 對分離的10株菌進行了基于16S rRNA序列的菌種鑒定，電泳結(jié)果顯示，PCR擴增在1000bp左右出現(xiàn)特異性條帶，如圖2所示，與預期目的片段相符。將膠回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序，并運用DNAman對測序結(jié)果進行比對分析，結(jié)果顯示與牛支原體的同源性為99.7%～100%。

圖2 分離菌株16S rRNA基因PCR擴增電泳圖

2.3.2 基于16S rRNA序列的系統(tǒng)進化分析 分析牛支原體分離株的進化樹，發(fā)現(xiàn)10株牛支原體聚為5大支，表明分離株的遺傳多樣性比較豐富；其中2株牛支原體分離株（SC-10、SC-1）聚為一支，與我國湖北株（CP007591.1）、廣東株（KM576849.1）、福建株（KX230478.1）遺傳關(guān)系最近；3株牛支原體分離株（SC-3、SC-7、SC-9）聚為一支，與我國湖北株（CP002513.1）遺傳關(guān)系最近；分離株SC-6、SC-2、SC-4聚為一支，與匈牙利株（KX462435.1）的遺傳關(guān)系最近；分離株SC-5和SC-8單獨聚為一支，且與重慶株（CP005933.1）的遺傳關(guān)系最近。

2.4 藥敏試驗結(jié)果 運用臨床常用的8種抗菌類藥物對隨機挑選的4株分離株進行MIC測定，結(jié)果見表1。敏感、耐藥的判定標準參考CLSI[4]。從表1可知，這4株牛支原體對泰樂菌素、氧氟沙星、土霉素、慶大霉素、頭孢喹諾、氟苯尼考敏感，而對恩諾沙星和頭孢噻呋具有耐藥性。

表1 8種抗生素對4株牛支原體的最小抑菌濃度（MIC）μg/mL

3 討論

牛支原體不僅引發(fā)牛肺炎、乳腺炎，還可導致關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎和母牛流產(chǎn)等多種疾病[5]。國內(nèi)自2008年證實牛支原體與牛呼吸道疾病緊密相關(guān)以來，關(guān)于該菌的研究已經(jīng)有很多報道[6]。運輸應激是導致牛支原體病發(fā)生的一個主要原因[7]。因此，長途運輸時進行抗應激處理是減少牛支原體病的重要手段[8]。本試驗從24個臨床樣本中檢測到23個牛支原體陽性樣本，其感染率高達95.83%，說明牛支原體是該肉牛場重要的病原菌之一。由于引起呼吸道疾病的病因復雜，有必要進一步對其他病原菌（如病毒、細菌等）進行調(diào)查，以便更加全面地了解該場的混合感染情況。

抗生素治療是控制和治療牛支原體病的主要手段。由于支原體結(jié)構(gòu)和功能的特點使其對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥和磺胺類藥物具有內(nèi)在的抗性，但是對影響蛋白質(zhì)或核酸合成的抗生素敏感[9]。近年來，牛支原體耐藥的報道逐漸增多，從比利時、德國和意大利3個國家分離的牛支原體對替米考星、泰樂菌素等常用藥具有嚴重的耐藥性[10]。張利等[3]研究表明，牛支原體對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等藥物的抵抗性增強。本試驗對分離出的牛支原體進行藥敏試驗，結(jié)果表明泰樂菌素、氧氟沙星、土霉素、慶大霉素、頭孢喹諾、氟苯尼考為敏感藥物，恩諾沙星和頭孢噻呋有耐藥。這一結(jié)果為該牛場的疫病治療提供了用藥參考。

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