谷晨晨，李海濤，朱言柱，常彤，苗利光※，劉艷環(huán)※，董昕瑜，劉愛萍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.集安市畜牧獸醫(yī)總站，吉林 集安 134200）

鹿結(jié)核?。―eerTuberculosis）是由牛型結(jié)核分枝桿菌引起的鹿的一種慢性、消耗性傳染病，廣泛流行于世界各地，嚴(yán)重危害著養(yǎng)鹿業(yè)的發(fā)展[1]。牛型結(jié)核分枝菌可感染鹿、牛、豬、人和大象等50余種哺乳動物和20多種禽類[2]。ESAT-6是牛型結(jié)核分枝桿菌的主要免疫優(yōu)勢抗原[3]，是牛型結(jié)核分枝桿菌感染早期分泌表達的一種蛋白?？ń槊纾˙acillusCalmette-Guérin，BCG）是用于防治結(jié)核病的減毒活疫苗，使用活的無毒牛型結(jié)核桿菌（Mycobacteriumbovis）制成，有足夠高的免疫原性，可在一定程度上預(yù)防結(jié)核。但免疫動物后效果不穩(wěn)定，動物機體接種BCG后會對皮內(nèi)結(jié)核菌素反應(yīng)的特異性產(chǎn)生嚴(yán)重干擾[4]，因此，用PPD皮試無法將疫苗接種與自然感染區(qū)分開來。自然感染結(jié)核病的動物血清中有ESAT-6抗體，而卡介苗缺失ESAT-6基因，不能表達該蛋白，不能產(chǎn)生ESAT-6抗體。因此，ESAT-6抗原能區(qū)分疫苗接種與自然感染，在牛型結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的結(jié)核病早期診斷中有良好的應(yīng)用前景。

1 材料

1.1 牛型結(jié)核分枝桿菌

從患結(jié)核病梅花鹿肺臟組織中分離出牛型結(jié)核分枝桿菌，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所經(jīng)濟動物疫病研究室保存。

1.2 載體和菌種

載體pNC-HisE、枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞（TaK-aRa公司）；大腸桿菌C600、pUC載體（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所經(jīng)濟動物疫病研究室保存）。

1.3 主要儀器和試劑

移液器、紫外分光光度計、高速臺式冷凍離心機（5415R、5810R）（Eppendorf公司）；生物二級安全柜（美國Labconco公司）；PCR儀、電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像儀（伯樂公司）；LA Taq聚合酶（TaKaRa公司）；限制性內(nèi)切酶（EcoRI、BamHI）（NEB 公司）；EastepTM質(zhì)粒小提試劑盒、EastepTM凝膠、PCR回收試劑盒、SDSPAGE凝膠配制試劑盒（上海普洛麥格公司）。

2 方法

2.1 DNA提取和擴增

2.1.1 牛型結(jié)核分枝桿菌DNA模版的制備 用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取牛型結(jié)核分枝桿菌DNA。

2.1.2 擴增PCR 設(shè)計引物并帶有相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切位點，PCR擴增在以下條件進行：94℃預(yù)變性10min，94℃30s，55℃1min，72℃1min，30 個循環(huán)，72℃延伸10min。PCR結(jié)束后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.2 ESAT-6基因的克隆與鑒定

擴增的基因產(chǎn)物用膠回收試劑盒進行純化，將純化的ESAT-6基因克隆連接至pUC載體，得到重組質(zhì)粒ESAT6-pUC，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌C600，氨芐抗性平板涂布，挑取白色單菌落，小劑量提取質(zhì)粒，用PCR及酶切鑒定后，選取正確克隆。

2.3 目的片段的重組和表達載體的構(gòu)建

將限制性內(nèi)切酶雙酶切后，回收目的基因片段，連接至載體pNC-HisE，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌C600，氨芐抗性平板涂布，挑取白色單菌落，小劑量提取質(zhì)粒，用PCR及酶切鑒定后，選取正確克隆。

2.4 表達載體的鑒定

培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，小劑量提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI雙酶切，反應(yīng)結(jié)束后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.5 表達載體ESAT6-pNC-HisE的轉(zhuǎn)化和表達

將表達載體ESAT6-pNC-HisE轉(zhuǎn)化到枯草桿菌感受態(tài)細(xì)胞，新霉素抗性平板涂布，挑取陽性克隆，小劑量提取質(zhì)粒，用PCR及酶切鑒定后，選取正確克隆。將含ESAT6-pNC-HisE表達載體的陽性枯草芽孢桿菌的單菌落接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.6，取菌液按1%的比例分別加入LB培養(yǎng)基、TM培養(yǎng)基和2SY培養(yǎng)基中，無需誘導(dǎo)，37℃培養(yǎng)64h，離心取上清，進行SDS-PAGE電泳檢測。

2.6 目的蛋白的純化

3 結(jié)果

3.1 目的基因的擴增

擴增出的ESAT-6基因片段大小與預(yù)期相符，分子量約為300bp。見圖1。

圖1 ESAT-6擴增PCR產(chǎn)物的核酸電泳Fig.1 Nucleic Acid Electrophoresis of ESAT-6 PCR production

3.2 中間載體ESAT6-pUC的酶切鑒定

篩選出的陽性質(zhì)粒雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切出約3000bp和300bp的目的片段，說明得到正確的重組質(zhì)粒。見圖2。

圖2 ESAT6-pUC的酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme identification of ESAT6-pUC

3.3 表達載體ESAT-6-pNC-HisE的酶切鑒定

篩選出的陽性質(zhì)粒雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切出約5000和300bp的目的片段，說明得到正確的重組質(zhì)粒。見圖3。

圖3 ESAT-6-pNC-HisE的酶切鑒定Fig.3 RestrictionenzymeidentificationofESAT-6-pNC-HisE

3.4 目的蛋白的表達

凝膠成像顯示，在分子量為12ku處有明顯的目的條帶，說明目的蛋白在這3種培養(yǎng)基中均能表達，且TM培養(yǎng)基和2SY培養(yǎng)基表達產(chǎn)物濃度較高。見圖4。

圖4 目的蛋白在LB培養(yǎng)基、TM培養(yǎng)基和2SY培養(yǎng)基中的表達情況Fig.4 The expression of target protein in LB medium，TM medium and 2SY medium

3.5 目的蛋白的純化

圖5 KTA蛋白純化結(jié)果曲線圖Fig.5 The curves of protein purification byKTA system

圖6 純化蛋白SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE of purified protein

4 討論

本研究根據(jù)GenBank上收錄的牛型結(jié)核分枝桿菌ESAT-6基因序列，使用分子生物學(xué)軟件設(shè)計了1對引物，用PCR的方法進行克隆，將擴增片段插入到中間載體，經(jīng)PCR檢測、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測序分析，確定得到了正確的重組質(zhì)粒，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建原核表達載體 ESAT6-pNC-HisE。將構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過培養(yǎng)得到表達產(chǎn)物后，對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE和蛋白純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化的蛋白分子量大小為12ku，與預(yù)測的蛋白分子量大小一致，證實構(gòu)建了正確的表達載體并建立了可靠的純化方法。本實驗通過枯草芽孢桿菌分泌性表達ESAT-6蛋白以及KTA系統(tǒng)蛋白純化，建立了一種可快速、簡便獲得ESAT-6蛋白的方法，為鹿結(jié)核病的早期診斷技術(shù)的研發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

[1]馬廣福.家畜傳染病[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社，1989:17-20.

[2]Cousins DV.Mycobacterium bovis infection and control in domestic livestock[J].Reviewof Science and Technology，2001，(20):71-85

[3]Buddle BM，Wards BJ，Aldwell FE，et al.Influence of sensitisation to environmental mycobacteria on subsequent vaccination against bovine tuberculosis[J].Vaccine，2002，20(15):1126-1133

[4]肖建華，高利，易美麗，等.鹿結(jié)核病診斷與預(yù)防的研究現(xiàn)狀[J].特產(chǎn)研究，2005，(3):44-46