崔慶艷，劉敏，倪樹玲，肖瑤，周艷，王永生

（吉林大學藥學院，長春 130021）

哈蟆油（Oviductus ranae）是中國林蛙（Ranatemporaria chensinensis David）雌蛙的干燥輸卵管，具有補腎益精、養(yǎng)陰潤肺之功效，常用于病后體弱、神疲乏力、心悸失眠、盜汗、癆嗽咳血[1]。哈蟆油主產于吉林、遼寧、黑龍江三省，而吉林省哈蟆油以其量大、質優(yōu)而聞名遐邇[2]。膽甾-5-烯-3--醇是哈蟆油中一種重要的甾體類成分[3]，本實驗通過建立測定哈蟆油中膽甾-5-烯-3--醇含量的方法，可以為哈蟆油的質量控制提供依據，進一步完善哈蟆油的質量控制體系。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Sartorious天平（1/100000，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ-400KDB型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-5299旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；F2100高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

哈蟆油樣品，購自吉林省延吉市、通化市、白山市、樺甸市，經長春中醫(yī)學院姜大成教授鑒定為蛙科動物中國林蛙（Rana temporaria chensinensis David）的輸卵管干制品。膽甾-5-烯-3--醇對照品（批號：111618-200301，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、二氯甲烷均為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水。

2 方法[4]

2.1 色譜條件[5]

色 譜 柱：COSMOSIL Packed Column Choleste（4.6mm 250.0mm，5m）；流動相：乙腈-水，采用梯度洗脫（0min～28min，V乙腈∶V水＝ 85∶15；28.01min～70min，乙腈比例為 100%）；流速：2.0mL/min；檢測波長：205nm；柱溫：35℃；進樣量：20L。采用此方法分離保留時間適宜，分離度大于1.5，理論板數均在7 000以上，且陰性無干擾。膽甾-5-烯-3--醇對照品色譜圖見圖1，哈蟆油樣品色譜圖見圖2。

圖1 膽甾-5-烯-3-醇對照品色譜圖Fig.1 Cholest-5-ene-3--ol reference substance chromatogram

圖2 哈蟆油樣品色譜圖Fig.2 Oviductus Ranae samples chromatogram

2.2 對照品溶液的制備

取膽甾-5-烯-3--醇對照品適量，加甲醇配制成4.12 103g/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取哈蟆油樣品粉末（過60目篩）2.0g，精密稱定，加入二氯甲烷 40mL，超聲（400W 40KHz）提取30min，濾過，重復提取3次，合并濾液，減壓蒸干溶劑。加入甲醇定容至2mL量瓶中，混勻，過0.22m濾膜，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

3 結果

3.1 線性關系考察

圖3 膽甾-5-烯-3--醇對照品標準曲線Fig.3 The standard curve of Cholest-5-ene-3-beta-alcohol control

3.2 精密度試驗

3.3 重復性試驗

取同一批次哈蟆油6份，根據“2.3”項下制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20L，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算得RSD值為1.42%，結果表明該方法重復性良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗

3.5 加樣回收試驗

稱取6份已測得膽甾-5-烯-3--醇含量的哈蟆油樣品約0.2g，精密稱定，加入膽甾-5-烯-3--醇對照品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按照上述色譜條件進樣測定，計算回收率，結果平均回收率為103.7%，RSD 值為 3.67%（n=6），結果見表 1。

表1 回收率試驗結果Tab.1 Experimental results of recovery

3.6 樣品的含量測定

分別取不同產地、不同批次的哈蟆油樣品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別將對照品溶液和供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進行測定，根據所測峰面積計算各產地不同批次哈蟆油中膽甾-5-烯-3--醇的含量。結果見表2。

表2樣品含量測定結果Tab.2 Results of sample determination (g/g)

從表中的數據可以發(fā)現，同一產地不同批次的哈蟆油由于干燥方法或儲藏條件不同，樣品中膽甾-5-烯-3--醇的含量有輕微差異。以上地區(qū)是吉林省哈蟆油的主要產地，延吉地區(qū)哈蟆油中膽甾-5-烯-3--醇的含量最高，通化地區(qū)的含量相對較低。

4 討論

4.1 考察了不同提取溶劑和提取方法對提取效率的影響。分別用石油醚、二氯甲烷、乙醚、丙酮為提取溶劑來提取哈蟆油中的膽甾-5-烯-3--醇發(fā)現，以二氯甲烷為提取溶劑時，膽甾-5-烯-3--醇的提取效率最大。分別用超聲提取、加熱回流提取方式提取膽甾-5-烯-3--醇發(fā)現，這2種提取方式對哈蟆油中的膽甾-5-烯-3--醇的提取效率影響不大，故應采用更為簡單的超聲提取法[6]。

4.2 考察了不同比例的流動相乙腈-水（95∶5、90∶10、85∶15、80∶20）發(fā)現，乙腈-水比例為85∶15可以使膽甾-5-烯-3--醇與其他物質完全分離，并且保留時間適宜[7]。紫外檢測發(fā)現，膽甾-5-烯-3--醇在200nm～300nm內均有吸收，且在205nm處有最大吸收，故選擇205nm作為其檢測波長。

4.3 哈蟆油是一種具有“軟黃金”之稱的傳統(tǒng)珍貴藥材[8]，目前市場上哈蟆油質量參差不齊，優(yōu)劣各異[9]。膽甾-5-烯-3--醇是哈蟆油中一種具有重要藥效的物質，通過測定此物質的含量，可作為評價哈蟆油質量的一項重要指標。為進一步完善哈蟆油的質量控制標準提供了可靠的理論依據和可行的檢測方法。

4.4 通過本實驗，建立一種測定哈蟆油中膽甾-5-烯-3--醇含量的方法，且該方法簡單可行，能準確快速地測定樣品中膽甾-5-烯-3--醇的含量。利用該方法比較哈蟆油的質量差異，為哈蟆油的質量鑒別、進一步完善哈蟆油的質量評價體系提供依據。

[1]田春雨.哈蟆油營養(yǎng)保健價值的比較研究[D].長春:長春中醫(yī)藥大學，2007.

[2]李宜平，張晉綱，劉淼，等.哈蟆油動物基原問題探討[J].中國中藥雜志，2003，28(1):19-21.

[3]姜大成，肖井雷.名貴中藥哈蟆油質量評價的初步研究[J]吉林中醫(yī)藥，2010，30(5):429-432.

[4]王永生，徐陽，陳冰，等.HPLC測定哈蟆油中4-膽甾烯-3-酮及膽固醇含量[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20(8):76-78.

[5]徐陽.哈蟆油化學成分的研究[D].長春:吉林大學，2016.

[6]王微，鄭飛，李霞，等.哈蟆油中免疫活性部位的提取工藝與藥效學研究[J].中國藥房，2012，23(27):2516-2519.

[7]王永生，曹玉恒，王哲，等.HPLC測定哈蟆油中膽固醇含量的研究[J].中成藥，2008，30(9):1402-1404.

[8]常樂，劉汶，張琳.哈蟆油的研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2011，28(5):405-409.

[9]陳麗娟，時坤，李健明，等.哈蟆油質量控制體系研究進展[J].中藥材，2011，34(5):820-823.