張子洲

(常州市第七人民醫(yī)院呼吸病科，江蘇 常州 213011)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是由肺的彈性減小、氣道和肺泡結(jié)構(gòu)改變所引起的空氣滯留和肺部充氣過(guò)度，具有持續(xù)存在的氣流受限特征〔1，2〕。COPD發(fā)病機(jī)制主要是氣道內(nèi)慢性炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失衡等〔2，3〕，最終引起肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺功能下降。研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解與生成，參與機(jī)體內(nèi)氣道重構(gòu)和血管重塑〔4，5〕。肺上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接(TJ)在維持肺泡的上皮機(jī)械屏障和通透性發(fā)揮關(guān)鍵作用〔6〕。Occludin蛋白是被首次發(fā)現(xiàn)組成TJ結(jié)構(gòu)蛋白，其C、N末端與閉鎖小帶蛋白(ZO-1、ZO-2和ZO-3)連接并相互作用，是保持肺泡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和通透性的關(guān)鍵部分〔7〕。本實(shí)驗(yàn)研究MMP-9和TJ蛋白Occludin在COPD大鼠肺部的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1一般資料 Wistar大鼠30只(昆明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄各半，體重(180±20)g，鼠齡10 w。試劑：脂多糖、內(nèi)毒素1 mg/ml(美國(guó)Sigma公司)；哈德門牌過(guò)濾嘴香煙(山東中煙工業(yè))；一抗：多克隆兔抗Occludin抗體(美國(guó)Sigma公司)；二抗：山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔抗人多克隆MMP-9抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；MMP-9酶聯(lián)免疫分析試劑盒、免疫組化染色(SABC)法試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；OLYMPUS CX22顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；HMIAS-2000H病理圖文分析系統(tǒng)，北京鼎永華泰科技有限公司。

1.2動(dòng)物模型的制備 大鼠隨機(jī)分為COPD組和對(duì)照組各15只。兩組均使用同種方式飼養(yǎng)，對(duì)照組給予正?？諝?，COPD組置于煙箱內(nèi)，被動(dòng)吸煙(3次/d，30 min/次，第1天每次5支，第2、3天每次10支，以后每次15支)完成COPD模型的建立。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，兩組大鼠均飼養(yǎng)造模14 w后處死。

1.3標(biāo)本采集 造模結(jié)束后，使用4%的水合氯醛腹腔注射將大鼠麻痹，打開(kāi)胸腔，夾閉右主支氣管，在氣管下橫行切口處置入硅膠管，緩慢注射生理鹽水灌洗左肺，重復(fù)3次，回收灌洗液，過(guò)濾、4℃離心、上清液凍存-70℃冰箱中，用于MMP-9的測(cè)定。灌洗后剖開(kāi)腹腔，下腔靜脈采血5 ml、4℃離心、分離出的血清-70℃凍存，用于MMP-9測(cè)定。取大鼠左肺組織浸泡固定于4%的多聚甲醛溶液中，常規(guī)包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，用于病理形態(tài)學(xué)分析。

1.4MMP-9的測(cè)定 支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清中MMP-9的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5Occludin的測(cè)定 肺組織蠟塊切成4 μm切片后采用SABC法進(jìn)行染色，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行作。以0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對(duì)照，置于光鏡下觀察。SABC染色結(jié)果通過(guò)圖像分析，測(cè)出Occludin表達(dá)的平均灰度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肺組織形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組雙肺結(jié)構(gòu)正常、無(wú)明顯病理變化、無(wú)明顯出血點(diǎn)、彈性較好、表面光滑，肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰、大小均勻。COPD組肺泡明顯腫大、顏色灰白，肺泡間隔水腫增寬，肺泡壁斷裂，肺泡結(jié)構(gòu)異常，出血嚴(yán)重。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肺組織形態(tài)(HE)

2.2兩組血清及BALF MMP-9水平比較 COPD組血清及BALF MMP-9水平〔(490.21±25.97)μg/L、(495.52±9.45)μg/L)〕均顯著高于對(duì)照組血清中MMP-9水平〔(381.93±19.35)μg/L，P<0.05〕；COPD組BALF與COPD組血清中MMP-9水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；COPD組BALF MMP-9水平顯著高于對(duì)照組BALF中MMP-9水平〔(399.29±20.03)μg/L,P<0.05〕。

2.3Occludin在肺組織中的表達(dá) Occludin在對(duì)照組大鼠肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)較多，呈棕褐色；Occludin在COPD組大鼠肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)較少，并且COPD組表達(dá)的平均灰度(96.68±11.86)明顯少于對(duì)照組〔(121.87±13.55),t=5.848，P=0.000〕。見(jiàn)圖2。

圖2 各組肺組織Occludin表達(dá)(SABC法，×100)

3 討 論

COPD是由于氣流阻塞導(dǎo)致的慢性氣道疾病，嚴(yán)重吸煙者的發(fā)病率較高。目前認(rèn)為MMPs是COPD患者肺部ECM降解最重要的酶類〔8〕。目前認(rèn)為MMP-9是MMPs中最重要的酶類之一，且與吸煙關(guān)系密切，MMP-9能分解氣道和肺組織的ECM和基底膜，參與氣道和肺組織的重塑〔9〕。MMP-9在COPD患者中表達(dá)水平上調(diào)較為顯著，加之其表達(dá)細(xì)胞眾多，作用底物廣泛，近年來(lái)備受關(guān)注，成為國(guó)內(nèi)外內(nèi)研究的焦點(diǎn)之一。本研究表明COPD組的大鼠通過(guò)大量吸煙導(dǎo)致肺部產(chǎn)生慢性炎癥，使MMP-9表達(dá)過(guò)多，使ECM的降解產(chǎn)物增多，造成堆積，最終導(dǎo)致氣道組織受到破壞和肺氣腫，與鐘曉芃等〔10〕研究結(jié)果一致。Russell等〔11〕研究表明MMP-9過(guò)度表達(dá)在肺氣腫的形成過(guò)程中起重要作用，MMP-9通過(guò)破壞肺泡基質(zhì)成分，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集導(dǎo)致氣流阻塞等參與COPD發(fā)病過(guò)程。

肺泡上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的TJ，是保證肺泡結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的主要組成部分。在維持肺泡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和通透性上TJ蛋白發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。TJ蛋白可以隔離溶液中的分子滲入體內(nèi)，保持體內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，維持細(xì)胞的極性。Occludin是緊密蛋白中的跨膜整合蛋白，保持正常的肺泡上皮屏障的主要組成部分〔12，13〕。Occludin蛋白的表達(dá)數(shù)量及蛋白活性發(fā)生改變，會(huì)影響肺泡上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的TJ，導(dǎo)致肺部細(xì)胞的通透性增加，間隙擴(kuò)大，一些外部物質(zhì)容易進(jìn)入肺部引起肺部的炎癥感染。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD組大鼠肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)功能改變可能與Occludin的數(shù)量及活性變化具有一定的關(guān)系。COPD組TJ Occludin數(shù)量明顯減少，從而使肺泡上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的TJ受到破壞，從而導(dǎo)致肺泡膜的完整性、通透性受到影響，最終引起肺部損傷及水腫，與Lee等〔14〕發(fā)現(xiàn)Occludin和ZO-1的在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)和分布與其通透性密切相關(guān)的表述基本一致。

綜上，MMP-9參與了COPD的發(fā)病過(guò)程，MMP-9在COPD大鼠模型中明顯增加。COPD大鼠肺泡上皮屏障功能與Occludin蛋白表達(dá)的數(shù)量及改變的一系列變化有關(guān)?？梢酝ㄟ^(guò)改變肺泡中MMP-9和Occludin蛋白的表達(dá)，阻止COPD病情進(jìn)一步發(fā)展。

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