趙 明 易 虎

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，天津 300193)

草酸鈣結(jié)石是泌尿系結(jié)石的主要類型，占泌尿系結(jié)石的60%～80%〔1〕。在腎結(jié)石的形成過程中，腎上皮細(xì)胞(NRK)具有十分重要的作用〔2〕。研究顯示〔3〕，體外鈣刺激大鼠NRK細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞骨橋蛋白(OPN)基因表達(dá)上調(diào)，OPN分泌增加。OPN可能參與了腎結(jié)石的形成過程，但其確切機制尚不清楚，且極少有體內(nèi)實驗報道。本研究通過小干擾RNA技術(shù)(siRNA)沉默OPN基因的表達(dá)，分析OPN在腎結(jié)石大鼠中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及細(xì)胞 雄性SD大鼠30只，體重160～180 g(天津?qū)嶒瀯游镏行奶峁?；293T細(xì)胞(上海復(fù)祥生物科技有限公司)。

1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國sigma公司)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液5×(碧云天生物技術(shù)研究所)；腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeno-X(Clontech公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(Jakson分裝)；內(nèi)參抗體β-actin(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；Western 一抗、二抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)研究所)；DAB 染色試劑盒(北京康為生物科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；其他試劑均為分析純國產(chǎn)試劑。

1.3主要儀器 超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)；BS223S型電子天平(北京賽多利斯儀器系列有限公司)；臺式低溫高速冷凍離心機(太倉市醫(yī)療械廠)；定量 PCR 儀(ABI step one plus，美國)；多功能酶標(biāo)儀(DG-3022，美國)；GeneChip?Scanner (Affymetrix，美國)；NanoDrop超微量分光光度儀(Thermo Fisher Scientific，美國)；電泳儀(GE，美國)。

1.4方法

1.4.1重組RNA干擾腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與包裝 參照文獻(xiàn)〔4〕方法，利用OligoEngine RNAi設(shè)計軟件，設(shè)計出針對OPN siRNA的特異性靶序列，siOPN上游引物5′-CGGTGAAAGTGGCTGAGTTT-3′，siOPN下游引物5′-TTTTCCCTTAGCCTTTATAGCAC-3′。siOPN上、下游引物重組入pSIREN-Shuttle，得到pSIREN-Shuttle-siOPN，經(jīng)酶切得到siRNA單元siOPN，分別重組入腺病毒載體pAdeno-X，得到pAdeno-X-siOPN，DNA測序證實。Pac I酶切重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-X-siOPN，用Lipofectamine2000將線性化的pAdeno-X-siOPN轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)，收獲、純化重組病毒，測定滴度。

1.4.2高草酸尿大鼠模型的建立及分組 30只SD大鼠分為對照組、OPN siRNA組和空載組，每組10只。對照組用單蒸水和標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)，OPN siRNA組和空載組喂飼含1%氯化銨和0.8%乙二醇的飲水(加標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料)，喂飼9 d。

1.4.3腺病毒表達(dá)載體導(dǎo)入大鼠腎臟 建立模型后，飼養(yǎng)6 w，全身麻醉(腹腔注射10%水合氯醛)，連接動物呼吸機，氣管切開，打開胸腔，暴露腎臟，游離出左腎靜脈，使用小兒頭皮針穿刺腎靜脈。OPN siRNA組大鼠腎臟注射rAAV-asOPN 100μl(約6×107IU)，空載組注射等量空載體病毒顆粒。對照組不做處理。術(shù)畢，關(guān)閉胸腔，撤除呼吸機。清潔級環(huán)境、普通飼料飼養(yǎng)6 w后觀察各實驗指標(biāo)。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1RT-PCR檢測OPN基因轉(zhuǎn)錄 取出各組大鼠腎臟，Trizol法分別提取各組大鼠總RNA，目的基因引物序列：GADPH(305 bp)上游引物：5′-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′，下游引物：5′-GGTGGTGAAGAC GCCAGTAG-3′；OPN(245 bp)上游引物：5′-GGCACATTCCGGGACAGAGAGAA-3′，下游引物5′-CGGTTTACCCATGTGGTGCCTC-3′。 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用RT-PCR檢測OPN mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以GADPH作為內(nèi)參照。

1.5.2Western印跡檢測OPN蛋白表達(dá) 取出各組大鼠腎臟，剪刀切碎，用預(yù)冷的組織裂解液提取大鼠腎臟總蛋白，Bradford法測定樣品的蛋白含量，12%凝膠分離蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)膜儀(濕轉(zhuǎn))在100 V、1.5 h的條件下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后與OPN單克隆抗體(1∶1 000)過夜結(jié)合，ECL顯色，凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)收集顯色條帶，運用Quantity One軟件進(jìn)行蛋白條帶數(shù)據(jù)分析。

1.5.3HE染色觀察草酸鈣晶體 參照文獻(xiàn)〔5〕方法，取腎后用預(yù)冷的PBS-草酸鈣溶液清洗腎臟組織，切腎組織成厚2～3 mm的小塊，再用預(yù)冷的PBS-草酸鈣溶液清洗。室溫下10%甲醛固定24 h。結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS-草酸鈣溶液清洗清洗3次，置入20%蔗糖溶液，4℃脫水72 h。再置入20%明膠，室溫下過夜，-80℃保存，制作10 μm冰凍切片。顯微鏡下觀察草酸鈣結(jié)晶形成情況。隨機選取6個視野，結(jié)晶程度計數(shù)用像素值(像素/視野)表示。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1OPN mRNA表達(dá)水平 OPN siRNA組OPN mRNA表達(dá)水平(0.25±0.08)顯著低于空載組(0.95±0.12，P<0.05)，顯著高于對照組(0.05±0.02，P<0.05)。

2.2OPN蛋白表達(dá)水平 OPN siRNA組OPN 蛋白表達(dá)水平(0.33±0.09)顯著低于空載組(0.96±0.15，P<0.05)，顯著高于對照組(0.08±0.02，P<0.05)。

2.3草酸鈣結(jié)石結(jié)石情況 OPN siRNA組大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)草酸鈣結(jié)石均顯著低于空載組(P<0.05)，顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)草酸鈣結(jié)石情況

與空載組比較：1)P<0.05；與對照組比較：2)P<0.05

3 討 論

我國泌尿系結(jié)石發(fā)病率為1%～10%，且呈逐年上升趨勢〔6〕。腎結(jié)石的常見成分為草酸鈣結(jié)石〔1〕。

OPN是一種多功能磷酸化糖蛋白，在骨骼、乳腺、腎臟、NK細(xì)胞及T 細(xì)胞等廣泛分布，具有多種功能。目前，OPN在結(jié)石形成過程中的作用還存在爭議。有學(xué)者認(rèn)為OPN具有抑制草酸鈣結(jié)晶形成的作用；也有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)石形成早期階段OPN可能促進(jìn)RNK細(xì)胞與草酸鈣結(jié)晶體的結(jié)合過程〔7〕。本文結(jié)果表明OPN siRNA病毒能有效抑制腎組織OPN的表達(dá)水平。

在細(xì)胞水平已有大量研究證明了OPN在草酸鈣結(jié)晶形成過程中的重要作用。席啟林等〔4〕采用鈣離子干預(yù)大鼠腎上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示鈣離子刺激后NRKOPN表達(dá)水平上升，通過構(gòu)建有效沉默OPN基因表達(dá)的慢病毒載體并導(dǎo)入大鼠NRK細(xì)胞，可顯著降低OPN表達(dá)水平和一水草酸鈣含量。歐善際〔8〕報道，大鼠腎小管上皮細(xì)胞受一水草酸鈣刺激后OPN 表達(dá)水平上升，但高濃度一水草酸鈣使OPN表達(dá)水平降低，認(rèn)為高濃度一水草酸鈣通過損傷腎小管上皮細(xì)胞導(dǎo)致OPN表達(dá)水平降低，進(jìn)而促進(jìn)形成結(jié)石。Yamate等〔9〕也證實在腎結(jié)石形成的早期階段，OPN具有促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶在細(xì)胞上沉積和黏附的作用，通過沉默OPN可抑制草酸鈣晶體的沉積。因此，結(jié)石形成早期階段，OPN可能促進(jìn)了NRK與草酸鈣結(jié)晶體的結(jié)合過程。

本研究表明，抑制大鼠腎組織OPN表達(dá)可降低草酸鈣晶體在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的沉積，OPN具有促進(jìn)草酸鈣腎結(jié)石形成的作用，與文獻(xiàn)報道一致〔6〕。目前多數(shù)研究認(rèn)為由集合管、遠(yuǎn)曲小管和髓袢等分泌的OPN可抑制尿路結(jié)石形成，主要表現(xiàn)在抑制草酸鈣結(jié)晶的黏附力和成核；同時，尿液中的OPN可促進(jìn)一水草酸鈣向黏附力較低的二水草酸鈣轉(zhuǎn)化，促進(jìn)二水草酸鈣的排泄〔10〕。

1Mohamaden W，Wang H，Guan H，etal.Immunohistochemical localization and mRNA quantification of osteopontin and Tamm-Horsfall protein in canine renal tissue after potassium oxalate injection〔J〕.BMC Vet Res，2014；10(1)：70.

2王 立，李 磊，李 博.雌二醇對草酸鈣結(jié)石造模大鼠腎小管細(xì)胞骨橋蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2012；14(s2)：619-20.

3姚秀瓊，鄧穗平，歐陽健明.HKC細(xì)胞損傷對草酸鈣晶體成核和聚集的促進(jìn)作用〔J〕.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2011；32(2)：236-40.

4席啟林，劉 喆，侯建全，等.骨橋蛋白在高鈣促進(jìn)大鼠腎上皮細(xì)胞與草酸鈣晶體黏附中的作用〔J〕.中華實驗外科雜志，2014；31(8)：1762-5.

5馬 超，席啟林，侯建全，等.沉默高草酸尿大鼠腎臟骨橋蛋白基因的表達(dá)對草酸鈣晶體在腎臟中沉積的影響〔J〕.中華實驗外科雜志，2016；33(12)：2675-7.

6徐 剛，夏 維，鄒曉峰，等.腎特發(fā)性草酸鈣結(jié)石形成與骨橋蛋白的關(guān)系〔J〕.中華實驗外科雜志，2015；32(6)：1252-5.

7甘瓊枝，孫新園，姚秀瓊，等.腎上皮細(xì)胞損傷使草酸鈣晶體黏附增強的分子機制〔J〕.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2016；37(6)：1050-8.

8歐善際.草酸鈣晶體對大鼠腎小管上皮細(xì)胞骨橋蛋白表達(dá)的影響〔D〕.長春：吉林大學(xué)，2011.

9Yamate T，Kohri K，Umekawa T，etal.Osteopontin antisense oligonucleotide inhibits adhesion of calcium oxalate crystals in Madin-Darby canine kidney cell〔J〕.J Urol，1998；160(4)：1506-12.

10夏 維.骨橋蛋白與特發(fā)性草酸鈣結(jié)石的相關(guān)性研究〔D〕.南昌：南昌大學(xué)，2014.