沈 雷 沙 峰 孫 權(quán) 張 鵬 孫石柱 張曉東 姚立杰 李靜平

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

糖尿病及其并發(fā)癥已經(jīng)成為影響中國發(fā)展的重要疾病之一〔1～4〕。存在于骨髓、脂肪等組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)具有來源廣泛、免疫低、多分化性等特點(diǎn)，既對組織損傷修復(fù)具有很好的療效，又避免了醫(yī)學(xué)倫理問題，是重要的治療性細(xì)胞〔5〕。但是高血糖環(huán)境會對移植的細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷〔6〕，研究發(fā)現(xiàn)，缺氧能促使宮頸癌細(xì)胞高表達(dá)趨化因子(CXCL)-8，發(fā)揮對抗缺氧、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的效果〔7〕，提示CXCL-8在缺氧環(huán)境下，可以發(fā)揮較強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞歸巢和血管新生的作用。但是在糖尿病性血管病變導(dǎo)致的高糖環(huán)境中，CXCL-8是否也會發(fā)揮抑制MSC損傷、促進(jìn)細(xì)胞增殖等研究卻鮮見報道。本文探討CXCL-8對高糖誘導(dǎo)MSC損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源及實(shí)驗(yàn)分組 人骨髓MSC購于廣州賽業(yè)干細(xì)胞生物公司。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCL-8者為CXCL-8-MSC組、僅轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒者為pcDNA3.1組、無任何刺激者為對照組、若在CXCL-8-MSC組添加100 μmol/L Triciribine則為Akt抑制劑組。

1.2主要試劑和儀器 胎牛血清(FBS，以色列Bioind公司)，青鏈霉素(碧云天生物公司)，L-DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，葡萄糖(美國Sigma公司)，Triciribine(美國Sigma公司)，DH5α大腸桿菌和pcDNA3.1質(zhì)粒由本教研室保存提供，LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)，小鼠抗人CXCL-8(美國Santa公司)，CCK8細(xì)胞增殖試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，小鼠抗人Caspase-3抗體、p-Akt抗體、p-STAT3抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(英國Abcam公司)，β-actin(英國Abcam公司)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國RD公司)，Emax酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，BX50型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清，1 μmol/L青霉素和100 U/ml鏈霉素的L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)MSC；在L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加30 mmol/L葡萄糖為MSC高糖培養(yǎng)基。分別在MSC高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)CXCL-8-MSC組、pcDNA3.1組、對照組、Akt抑制劑組MSC。

1.3.2CXCL-8基因轉(zhuǎn)染MSC及其鑒定 大連寶生物有限公司設(shè)計人CXCL-8基因引物。按5×104/ml MSC添加500 μl 1% LipofectamineTM2000比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，利用G418篩選陽性克隆。37℃，5%CO2孵育48 h，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，使用小鼠抗人CXCL-8(1∶150)抗體孵育，二抗使用TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶250)，鑒定CXCL-8的表達(dá)。

1.3.3CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況 按MSC分組情況，接種2×104MSC于96孔板，用100 μl培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μl CCK8，孵育4 h，使用Emax酶標(biāo)儀，450 nm波長測定每個樣品吸光度(OD值)。

1.3.4Western印跡檢測Caspase-3、p-Akt和p-STAT3蛋白表達(dá) 按照實(shí)驗(yàn)分組情況，培養(yǎng)每組3×106細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，4℃下12 000 r/min，提取蛋白液；取20 μg各組蛋白樣品，SDS-PAGE凝膠電泳70 min；然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜；封閉液中封閉60 min；添加小鼠抗人Caspase-3(1∶250)、p-Akt(1∶200)、p-STAT3(1∶250)等抗體，4℃過夜，使用HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶200)，室溫孵育80 min；電光學(xué)發(fā)光(ECL)試劑等步驟檢測蛋白表達(dá)，Image-Pro Plus軟件分析各帶吸光度值作定量計算，β-actin為內(nèi)參對照〔8〕。

1.3.5ELISA檢測VEGF蛋白含量 按照實(shí)驗(yàn)分組情況，培養(yǎng)5×106各組MSC，0.01 mol/L PBS清洗，然后以含0.1% FBS的各組細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞的上清液，ELISA試劑盒進(jìn)行檢測VEGF含量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t或χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染CXCL-8的表達(dá) MSC內(nèi)轉(zhuǎn)染CXCL-8蛋白呈紅色熒光，見圖1；ELISA法檢測細(xì)胞上清液CXCL-8蛋白含量，發(fā)現(xiàn)CXCL-8-MSC組CXCL-8蛋白含量〔(1.31±0.18)pg/ml〕是pcDNA3.1組〔(0.78±0.21)pg/ml〕的1.68倍(P<0.01)，而Akt抑制劑組CXCL-8蛋白含量〔(0.94±0.14)pg/ml〕是CXCL-8-MSC組的0.71倍(P<0.01)。

2.2高糖環(huán)境下CXCL-8對MSC增殖和凋亡的影響 在高糖環(huán)境下，CXCL-8-MSC組細(xì)胞增殖OD值(1.15±0.17)是pcDNA3.1組(0.81±0.12)的1.43倍(P<0.01)，Akt抑制劑組MSC增殖OD值(0.87±0.15)是CXCL-8-MSC組的0.76倍(P<0.01)；CXCL-8-MSC組Caspase-3蛋白的相對吸光度(0.81±0.04)僅為pcDNA3.1組(1.09±0.06)的0.75倍，而Akt 抑制劑組Caspase-3蛋白相對吸光度(1.10±0.02)是CXCL-8-MSC組的1.37倍(P<0.01)，見圖2。

2.3各組MSC中p-Akt、p-STAT3和VEGF蛋白的變化 Western印跡發(fā)現(xiàn)，高糖條件下CXCL-8-MSC組p-Akt、p-STAT3蛋白分別是pcDNA3.1組的2.03和2.11倍(P<0.01)，而Akt抑制劑組p-Akt、p-STAT3蛋白分別是CXCL-8-MSC組的0.37和0.53倍(P<0.01)，CXCL-8-MSC組p-Akt與Akt、p-STAT3與STAT3分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3，表1。

圖1 MSC內(nèi)轉(zhuǎn)染CXCL-8的鑒定(免疫熒光染色，×100)

1～5：正常培養(yǎng)基組、對照組、pcDNA3.1組、CXCL-8-MSC組、Akt抑制劑組圖2 各組Caspase-3蛋白表達(dá)

1～4：對照組、pcDNA3.1組、CXCL-8-MSC組、Akt抑制劑組圖3 各組MSC中p-Akt/Akt、p-STAT3/STAT3蛋白的表達(dá)

表1 高糖環(huán)境下Caspase-3蛋白的相對吸光度

與pcDNA3.1組比較：1)P<0.01；與CXCL-8-MSC組比較：2)P<0.01;與CXCL-8-MSC組Akt比較：3)P<0.01；與CXCL-8-MSC組STAT3比較：4)P<0.01

2.4各組MSC中VEGF蛋白的變化 CXCL-8-MSC組細(xì)胞上清液中VEGF蛋白〔(1.31±0.11)pg/ml〕是pcDNA3.1組〔(0.62±0.07)pg/ml〕的2.12倍，但是Akt抑制劑組VEGF含量〔(0.79±0.04)pg/ml〕是CXCL-8-MSC組的0.61倍(P<0.01)。

3 討 論

發(fā)生在糖尿病患者下肢的頑固性皮膚潰瘍?yōu)樘悄虿∽?DF)〔9〕。眾多細(xì)胞因子、細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、免疫細(xì)胞等因素的相互作用，參與了正常皮膚傷口的愈合過程〔10〕，然而，糖尿病性神經(jīng)、血管病變、細(xì)胞功能下降是DF潰瘍延遲愈合甚至不愈合的主要病理變化〔9〕。近年出現(xiàn)的高壓氧法、抗感染等各種治療手段被逐漸用于治療DF潰瘍，但是效果不甚理想〔9〕。

MSC屬于多能干細(xì)胞，在骨關(guān)節(jié)、心血管、神經(jīng)等系統(tǒng)的許多疾病有廣泛應(yīng)用〔5〕，雖然對于DF這種兼有血管、神經(jīng)等混合性病變而言，MSC移植療法尤為合適，但是高血糖環(huán)境會導(dǎo)致MSC等細(xì)胞活性降低，組織修復(fù)功能減弱〔6〕。Liu等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌腫瘤組織，隨著瘤體不斷增大，腫瘤組織血管新生減弱，形成局部缺氧環(huán)境，持續(xù)的缺氧會刺激HeLa、SiHa細(xì)胞產(chǎn)生大量CXCL-8等趨化因子，致使HeLa和SiHa等腫瘤細(xì)胞凋亡降低，加速腫瘤組織血管新生，改善缺氧條件，腫瘤呈現(xiàn)增生或轉(zhuǎn)移等趨勢，表明CXCL-8具有對抗缺氧、招募細(xì)胞歸巢、促進(jìn)血管新生作用〔11〕。

Eming等〔12〕在正常皮膚傷口愈合的過程中研究發(fā)現(xiàn)，CXCL-8可以與細(xì)胞表面的細(xì)胞超化因子受體(CXCR)1結(jié)合，招募脂肪組織、血液中的MSC、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞趨化到傷口區(qū)域，參與損傷修復(fù)，并對動員血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，加速血管新生有重要效果，然而在DF區(qū)域，巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞分泌的CXCL-8等細(xì)胞因子大量減少，宿主細(xì)胞歸巢能力降低，傷口遷延愈合〔10〕，在高糖環(huán)境下，CXCL-8對MSC等細(xì)胞的作用效果如何，卻鮮見研究。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成功轉(zhuǎn)染CXCL-8的MSC會分泌CXCL-8蛋白，CXCL-8結(jié)合于MSC細(xì)胞膜表面的CXCR1/2，會激活A(yù)kt等信號通路而發(fā)生一系列信號傳遞效果，雖然添加Akt抑制劑阻滯了Akt信號通路的傳導(dǎo)，但是Akt抑制劑組MSC分泌的CXCL-8依然比CXCL-8-MSC組表達(dá)降低，這可能是由于CXCL-8對MSC的作用尚存在Erk等其他分子作用機(jī)制〔13〕，相關(guān)機(jī)制還有待深入研究。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境可以使MSC等細(xì)胞的增殖降低，Caspase-3凋亡蛋白增多等現(xiàn)象，與Sargent〔6〕的研究類似。

2014年Nature雜志報道磷酸化Akt蛋白可以導(dǎo)致下游mTOP、STAT3等信號通路的活化〔14〕。本文也發(fā)現(xiàn)，CXCL-8轉(zhuǎn)染MSC后，Akt、STAT3磷酸化蛋白(p-Akt、p-STAT3)明顯升高，可能是由于MSC高表達(dá)的CXCL-8結(jié)合于MSC表面的CXCR1/2〔15〕，通過PI3K-Akt信號通路，導(dǎo)致STAT3磷酸化，激活PI3K-Akt-STAT3信號通路，使STAT3下游的VEGF基因活化〔16〕。在CXCL-8-MSC組添加Akt抑制劑后，發(fā)現(xiàn)STAT3蛋白和VEGF蛋白明顯降低，間接證明了Akt-STAT3信號通路在CXCL-8作用于MSC，促使MSC旁分泌VEGF等細(xì)胞活性因子的作用。Liang等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可以抑制糖尿病環(huán)境下MSC凋亡，對糖尿病性心臟病具有改善心肌功能、促進(jìn)血液循環(huán)的重要作用。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下，CXCL-8刺激MSC旁分泌VEGF蛋白增多，抑制了Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)，提高了細(xì)胞增殖，對抑制高糖導(dǎo)致的MSC損傷具有重要保護(hù)作用。綜上，CXCL-8轉(zhuǎn)染的MSC可以發(fā)揮抗高糖導(dǎo)致的MSC損傷，對MSC具有保護(hù)性作用。如果移植CXCL-8轉(zhuǎn)染的MSC到糖尿病者體內(nèi)，高表達(dá)的CXCL-8還會促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞歸巢〔14〕，加快修復(fù)糖尿病性組織損傷。

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