沈 薇 隋 璐 湯曉琳 呂 鑫

(沈陽醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，遼寧 沈陽 110034)

膠質(zhì)瘤約占大腦及神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的45%，且大多數(shù)呈惡性發(fā)展，預(yù)后不理想〔1〕。研究證實，膠質(zhì)瘤具有細胞異常增殖、細胞凋亡減慢等生物學(xué)特性，使膠質(zhì)瘤的治療面臨巨大困難〔2〕。S100A4蛋白通過調(diào)節(jié)細胞存活，運動和侵襲在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮生物學(xué)功能。有報道S100A4對膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、遷移起促進作用〔3〕，但對膠質(zhì)瘤細胞生長及凋亡特性的影響目前尚不清楚。本研究利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制S100A4表達，觀察下調(diào)S100A4表達對人膠質(zhì)瘤細胞U251增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 人膠質(zhì)瘤U251細胞株購自中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫。siRNA-S100A4序列5'-CGAGGUGGACUUCCAAGAGTT-3'，陰性對照(siRNA-NC)序列5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'購自上海吉瑪公司。RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，總RNA提取試劑盒，RT-PCR試劑盒，GoTaq Master Mix購自美國Promega公司，細胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK-8)，AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒購自東仁化學(xué)科技公司。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3檢測試劑盒購自凱基生物公司。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000,電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒分別購自美國Invitrogen 公司和Pierce公司。兔抗人S100A4抗體購自美國Lab Vision公司。鼠抗人β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2細胞培養(yǎng)和siRNA瞬時轉(zhuǎn)染 U251細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的U251細胞接種到6孔板中，次日進行轉(zhuǎn)染。實驗分正常對照組(細胞未經(jīng)任何處理)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染siRNA-NC)和siRNA-S100A4轉(zhuǎn)染組。按照lipofectamineTM2000說明書進行細胞轉(zhuǎn)染。

1.3RT-PCR 檢測S100A4 mRNA表達水平 提取轉(zhuǎn)染48 h后3組細胞的總RNA,RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA和RT-PCR擴增。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照。S100A4上游引物：5'-CCCTGGATGTGATGGTGTC-3'，下游引物：5'-CTCGTTGTCCCTGTTGCTG-3'；GAPDH上游引物：5'-CCCTTCATTGACCTCAACTA-3'，下游引物：5'-CCAAAGTTGTCATGGATGAC-3'。擴增體系20 μl。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s和72℃ 30 s，共40個循環(huán)。應(yīng)用2-△△CT法計算CT值。各組均設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次。

1.4Western印跡檢測S100A4 蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染48 h后3組細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白含量。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，分別加入S100A4抗體(1∶1 000)、β-actin抗 體(1∶2 000)4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗10 min，共3次；加入相應(yīng)二抗(1∶2 000)37℃孵育2 h。TBST溶液漂洗10 min，共3次。ECL化學(xué)發(fā)光劑孵育，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并進行灰度值分析。

1.5CCK-8檢測細胞增殖變化 將各組細胞按1 500/孔接種96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，測定A450 nm波長OD值，連測3 d，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。以上實驗重復(fù)3次。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率變化 轉(zhuǎn)染48 h后，用胰酶消化各組細胞，制成單細胞懸液，再用PBS離心洗滌，調(diào)整待測細胞密度為1×106個/ml。1 000 r/min,4℃離心10 min，收集細胞，棄上清液，PBS重懸，再次1 000 r/min,4℃離心10 min。100 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC和10 μl PI混勻，避光孵育15 min后，加入400 μl結(jié)合緩沖液，流式細胞儀檢測分析。

1.7細胞內(nèi)caspase-3活性檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，收集3組細胞，按試劑盒說明操作，加入裂解緩沖液，10 000 r/min,4℃離心1 min，取上清加入反應(yīng)緩沖液和caspase-3基底，37℃ 避光孵育4 h后，用酶標儀在405 nm波長下讀取吸光值(A值)。caspase-3活性單位(U)=A實驗組/A對照組×100% 。實驗重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染siRNA后S100A4 mRNA和蛋白表達 轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR結(jié)果顯示，設(shè)正常對照組為1，siRNA-S100A4組S100A4 mRNA表達(0.23±0.06)顯著低于正常對照組和陰性對照組(0.93±0.04，P<0.01)。Western印跡檢測顯示，正常對照組、陰性對照組、siRNA-S100A4組灰度比值分別為1.05 ± 0.11、1.02±0.09、0.46±0.10。siRNA-S100A4組S100A4蛋白表達顯著低于正常對照組和陰性對照組(P<0.01)。見圖1。

2.2S100A4 siRNA對U251細胞增殖的影響 在轉(zhuǎn)染后第1～3天分別收集細胞，CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48、72 h后，與正常對照組和陰性對照組比較，siRNA-S100A4組細胞生長明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 Western印跡檢測S100A4蛋白表達

圖2 S100A4表達下調(diào)對U251細胞增殖的影響

2.3S100A4 siRNA對U251細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA-S100A4組細胞凋亡率(27.48%±1.96%)顯著高于正常對照組(8.54%±2.68%)和陰性對照組(11.95%±2.28%，P<0.05)。

2.4S100A4 siRNA對U251細胞caspase-3活性的影響 U251細胞轉(zhuǎn)染48 h后，設(shè)正常對照組為100%，siRNA-S100A4組caspase-3酶活性(357.40%±48.42%)顯著高于正常對照組和陰性對照組(138.73%±17.11%，P<0.01)。

3 討 論

S100A4是S100蛋白家族成員之一，一般以同源二聚體或異二聚體形式存在于細胞內(nèi)，具有調(diào)節(jié)血管生成、細胞存活、細胞運動和侵襲等廣泛的生物學(xué)功能。研究表明，S100A4的表達與胃癌、乳腺癌、喉癌等多種腫瘤的預(yù)后有密切聯(lián)系〔4～6〕。2008年Harris等〔7〕首次發(fā)現(xiàn)S100A4 在大鼠腦膠質(zhì)瘤干細胞中有豐富的表達。研究報道證實，S100A4通過促進膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展〔3〕。除了侵襲轉(zhuǎn)移，膠質(zhì)瘤細胞同時具有無限復(fù)制潛能，逃避凋亡等惡性生物學(xué)特性，分子靶向抑制其增殖，促進凋亡的特性。

腫瘤細胞過度增殖促使腫瘤生長迅速，成為腫瘤發(fā)生最突出的特征之一。本研究結(jié)果提示，采用siRNA下調(diào)S100A4表達可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖。S100A4在腫瘤的增殖過程中起重要促進作用。有報道S100A4 siRNA轉(zhuǎn)染喉癌細胞能有效抑制細胞增殖，降低裸鼠體內(nèi)成瘤能力〔6〕。本研究結(jié)果與之一致，提示沉默S100A4表達能夠抑制膠質(zhì)癌細胞的生長、增殖。細胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本實驗結(jié)果提示，siRNA下調(diào)S100A4表達可明顯增加膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。與S100A4 siRNA在其他腫瘤中促凋亡的作用類似，Hua等〔4〕報道RNAi沉默S100A4基因促進胃癌BGC823細胞凋亡。Mahon等〔8〕證實S100A4 siRNA誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡。caspase家族在調(diào)控細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。其中caspase-3是關(guān)鍵激酶之一。Mahon等〔8〕報道敲除S100A4可通過激活caspase-3，多聚ADP-核糖聚合酶誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究結(jié)果提示，S100A4 siRNA通過活化caspase-3促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。S100A4可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的重要癌基因，在轉(zhuǎn)錄后水平特異性抑制S100A4基因的表達，可能成為膠質(zhì)瘤治療的新靶點。

1Stupp R,Mason WP,van den Bent MJ,etal.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma〔J〕.N Engl J Med,2005;52(10):987-96.

2Tahara S,Nojima S,Ohshima K,etal.S100A4 accelerates the proliferation and invasion of endometrioid carcinoma and is associated with the "MELF" pattern〔J〕.Cancer Sci,2016;107(9):1345-52.

3趙鵬飛，楊學(xué)軍，張 辰，等.敲低S100A4表達對膠質(zhì)瘤細胞系SNB19侵襲和遷移的影響〔J〕.中國神經(jīng)精神疾病雜志,2014;40(12):746-51.

4Hua J,Chen D,Fu H,etal.Short hairpin RNA-mediated inhibition of S100A4 promotes apoptosis and suppresses proliferation of BGC823 gastric cancer cells in vitro and in vivo〔J〕.Cancer Lett,2010;292(1):41-7.

5Egeland EV,Boye K,Park D,etal.Prognostic significance of S100A4-expression and subcellular localization in early-stage breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2017;162(1):127-37.

6Liu J,Fu S,Xu Y,etal.RNA interference targeting inhibition of S100A4 suppresses cell growth and promotes apoptosis in human laryngeal carcinoma Hep 2 cells〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(3):1389-94.

7Harris MA,Yang H,Low BE,etal.Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma〔J〕.Cancer Res,2008;68(24):10051-9.

8Mahon PC,Baril P,Bhakta V,etal.S100A4 contributes to the suppression of BNIP3 expression,chemoresistance,and inhibition of apoptosis in pancreatic cancer〔J〕.Cancer Res,2007;67(14):6786-95.