李 玥 齊亞靈 楊 哲 張澤宇 向 雨 賈琳琳 王偉群

(佳木斯市大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

宮頸癌(UCC)發(fā)病率居于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第一位，此外，在女性全部惡性腫瘤中，UCC也僅次于乳腺癌，高居第二位〔1〕。隨著經(jīng)濟(jì)水平的提升和婦女衛(wèi)生保健制度的相對(duì)完善，UCC的5～10年存活率在不斷提高，然而其發(fā)病率卻呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)〔2〕。研究顯示，在多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中，炎癥反應(yīng)具有不可低估的作用，其已被提升到癌癥發(fā)生的第七大要素〔3〕。作為細(xì)胞因子超家族成員，趨化因子是分泌性的小分子多肽(8～10 kD)，在免疫和炎癥反應(yīng)中可控制白細(xì)胞黏附和跨內(nèi)皮遷移，在趨化聚集、刺激血管生成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用〔4〕。本研究探討外源性趨化因子CXC配體(L)12對(duì)UCC Hela細(xì)胞增殖作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要材料 試劑Hela細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó) HyClone 公司)；胎牛血清(FBS，美國(guó)Gibco公司)；青鏈霉素(碧云天生物技術(shù)公司)；胰蛋白酶、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)8(武漢博士德生物工程有限公司)；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)抗體(美國(guó)Affinity公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(北京金西盟儀器有限公司)；超級(jí)潔凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；重組人 CXCL12(美國(guó)PeproTech公司)。

1.2CCK8檢測(cè)UCC Hela細(xì)胞的增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞重懸于含10%FBS和100 μg/ml青鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中；將細(xì)胞接種于96孔板中(1.5×103/孔)，孔板置于飽和濕度為5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h；待細(xì)胞完全貼壁后，棄去上層培養(yǎng)基將細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS和不同濃度外源性重組CXCL12(0、10、20、40 ng/ml)的100 μl 的RPMI1640培養(yǎng)基中；分別在培養(yǎng)24、48和72 h后，用CCK8試劑盒檢測(cè)UCC Hela細(xì)胞增殖的情況。

1.3蛋白免疫印跡法檢測(cè)ERK表達(dá)量 將Hela細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上后，收集其細(xì)胞沉淀，按比例加入甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞，待測(cè)量各樣本濃度后，取50 μg總蛋白加入到12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣孔中，90 V電壓使溴酚藍(lán)電泳至濃縮膠與分離膠交界處，然后改為110 V電壓使溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部；利用轉(zhuǎn)移槽使蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(300 mA，2 h)；5%的脫脂奶粉室溫封閉3 h，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBS-T)洗膜3×5 min； 加入一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS-T洗膜3×5 min；加入二抗37℃作用45 min，PBS-T洗膜4×15 min；用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液作用PVDF膜，并用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀曝光、拍照。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1外源性CXCL12促進(jìn)UCC Hela細(xì)胞增殖 培養(yǎng)48 h，濃度40 ng/ml的外源性CXCL12對(duì)Hela細(xì)胞增殖作用明顯高于0 ng/ml(P<0.05)；培養(yǎng)72 h，濃度20 ng/ml的外源性CXCL12對(duì)Hela細(xì)胞增殖作用明顯高于0 ng/ml(P<0.05)，且濃度40 ng/ml時(shí)尤其明顯(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2外源性CXCL12上調(diào)Hela細(xì)胞ERK表達(dá) 0、20和40 ng/ml CXCL12 ERK相對(duì)表達(dá)量分別為0.743±0.068、0.978±0.174和0.994±0.150。與0 ng/ml CXCL12比較，20和40 ng/ml CXCL12均明顯上調(diào)Hela細(xì)胞ERK表達(dá)(均P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間外源性CXCL12促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖

與0 ng/ml比較：1)P<0.05；2)P<0.01

圖1 不同濃度外源性CXCL12上調(diào)Hela細(xì)胞ERK水平

3 討 論

全球每年約有52萬(wàn)UCC新增病例，而每年新增病例死亡率大于50%〔5〕。我國(guó)成為UCC的高發(fā)區(qū)，每年約有30%的新增病例和死亡病例發(fā)生〔6〕。CXCL12是一種可以由卵巢癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞及腹膜間皮細(xì)胞等多種腹腔腫瘤細(xì)胞分泌的趨化因子〔7〕。Scotton等〔8〕發(fā)現(xiàn)CXCL12在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮多種作用，其中重要一點(diǎn)是通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖。ERK是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上一個(gè)重要細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白，包括ERK1和ERK2，能夠?qū)⑿盘?hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核。磷酸化激活的ERK1/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)EST域蛋白(Elk)-1、活化轉(zhuǎn)錄因子(ATF)、活化蛋白(Ap)-1、原癌基因c-fos和c-Jun轉(zhuǎn)錄活化，參與細(xì)胞增殖、分化、維持細(xì)胞形態(tài)、構(gòu)建細(xì)胞骨架、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞癌變等多種生物學(xué)效應(yīng)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提高CXCL12表達(dá)量可以顯著促進(jìn)ERK表達(dá)，CXCL12可以通過(guò)上調(diào)ERK表達(dá)量來(lái)促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖。

1楊琳琳，王 薇，張紅平，等.宮頸癌患者治療前檢測(cè)外周血細(xì)胞角蛋白19mRNA和鱗狀細(xì)胞癌抗原的臨床意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2017;37(8):1940-1.

2Quinn MA，Benedet JL，Odicino F，etal.Carcinoma of the Cervix Uteri〔J〕.Int J Gynaecol Obstet，2006;95(1):S43-S103.

3Mantovani A.Cancer:inflaming metastasis〔J〕.Nature，2009;457(7225):36-7.

4Jang TL，Schaeffer AJ.The role of cytokines in prostatitis〔J〕.World J Urol，2003;21(2):95-9.

5Koh WJ，Greer BE，Abu-Rustum NR，etal.Cervical cancer，version 2.2015〔J〕.J Natl Compr Canc Netw，2015;13(4):395-404.

6江恩利，譚寒星，冉光偉，等.老年宮頸癌組織中人類(lèi)白細(xì)胞抗原-蛋白的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2017;37(15):3779-81.

7馬蓮環(huán)，劉 建.ERK1/2的研究進(jìn)展〔J〕.臨床與病理雜志，2005;25(3):279-82.

8Scotton CJ，Wilson JL，Scott K，etal.Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer〔J〕.Cancer Res，2002;62(20):5930-8.