辛筱筱，栗孟飛，劉 媛，程宏波，常 磊，陳菁菁，柴守璽，楊德龍

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室,甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國四大糧食作物之一，常年播種面積約2.67×107hm2，占糧食作物播種總面積的27.0%左右，占糧食作物總產(chǎn)量的22.0%左右[1]。隨著農(nóng)業(yè)用水資源的日益匱乏，干旱已成為小麥減產(chǎn)的最主要的環(huán)境影響因子，每年我國因不同程度干旱導(dǎo)致的小麥減產(chǎn)在30%以上，其危害相當(dāng)于其他自然災(zāi)害的總和[2]。研究表明，小麥產(chǎn)量形成是源-流-庫協(xié)同互作的復(fù)雜生理生化過程，主要取決于功能葉片的持綠性[3]。尤其是，小麥生育后期(抽穗期至灌漿期)是其產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時期，同時也是對水分響應(yīng)極為敏感的時期，該時期旗葉已成為小麥最為主要的光合器官[3-4]。在此條件下，小麥旗葉保持較高的葉綠素含量和一定的綠葉面積往往具有較高的產(chǎn)量潛勢，表現(xiàn)出較強的抗旱性[4]，這種性狀有利于植株延緩葉片衰老，改善蒸騰效率和延長光合作用時間[5]，從而有效地促進(jìn)干物質(zhì)積累、轉(zhuǎn)運和籽粒灌漿，提高粒重和產(chǎn)量[6]。因此，解析干旱脅迫條件下小麥生育后期旗葉持綠性與粒重關(guān)系及其遺傳特征對提高小麥抗旱遺傳改良效率具有重要意義。

小麥持綠性是一個復(fù)雜的生理代謝過程[7]?，F(xiàn)已證明，葉綠素合成主要受谷氨酰tRNA還原酶、膽色素原合酶、尿葉琳原Ⅲ合酶、NADPH原葉綠素酸醋氧化還原酶、葉綠素合酶、葉綠素酸醋a氧化酶等關(guān)鍵酶及其基因表達(dá)調(diào)控[8]；且其表型易受基因型、環(huán)境、基因型×環(huán)境互作等因子的顯著影響[9-11]。借助分子數(shù)量遺傳學(xué)手段發(fā)現(xiàn)，小麥持綠性和千粒重屬于多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，遺傳力低，易受水分環(huán)境影響[9,12-13]。前人利用初級作圖群體，如重組近交系群體(recombinant inbred line，RIL)[11-12]、加倍單倍體群體(doubled haploid line，DH)[13]等，對小麥持綠性和千粒重進(jìn)行數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus，QTL)定位發(fā)現(xiàn)，控制這些性狀的QTL在小麥整個基因組上均有分布，其遺傳受加性、上位性及其與水分環(huán)境互作效應(yīng)控制，且不同的環(huán)境和遺傳背景數(shù)量遺傳基礎(chǔ)有顯著差異。因此，利用不同背景小麥材料，設(shè)置不同的水分處理，有利于挖掘更多控制這些性狀的抗旱遺傳信息。

小麥回交導(dǎo)入系(introgression lines，ILs)群體的建立為小麥基因從初級定位向精細(xì)定位發(fā)展奠定了良好的材料基礎(chǔ)。通過多次回交建立的小麥ILs群體表現(xiàn)高比率的輪回親本基因型，同時保留少量供體親本染色體片段(基因)，有效排除了不同遺傳背景對導(dǎo)入基因的干擾，是檢測目標(biāo)性狀QTL/基因，進(jìn)行基因精細(xì)定位與克隆的理想遺傳材料。施偉等[14]利用晉麥47和長6878分別作為供體親本，魯麥14作為輪回親本，分別構(gòu)建了兩套ILs群體，并對其進(jìn)行了抗旱性相關(guān)性狀QTL定位分析。陳穩(wěn)良等[15]以晉麥47為輪回親本，魯麥14為供體親本，構(gòu)建ILs群體，通過分子標(biāo)記技術(shù)檢測，對不同水分條件下小麥抗旱相關(guān)重要性狀和生理性狀進(jìn)行了QTL定位。Ibrahim等[16]利用2套小麥ILs群體(Triso×Syn084和Devon×Syn084)對小麥抗旱相關(guān)性狀進(jìn)行了精細(xì)定位。以上研究為揭示小麥抗旱性相關(guān)復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳特性和抗旱相關(guān)性狀精細(xì)定位奠定了良好的材料基礎(chǔ)和理論依據(jù)。因此，本研究以西峰20×?xí)x麥47雜交創(chuàng)建的ILs群體作為供試材料，研究干旱脅迫和灌溉條件下不同發(fā)育時期小麥旗葉葉綠素含量和千粒重相關(guān)性及其數(shù)量遺傳特性，并對ILs群體的遺傳變異進(jìn)行評價，旨在為小麥抗旱性研究和遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以強抗旱性的冬小麥西峰20為供體親本，以抗旱高產(chǎn)品種晉麥47為輪回親本，創(chuàng)建的ILs(BC3F4)群體160個株系為供試材料，群體兩親本在抗旱性和千粒重上遺傳差異較大。其中，供體親本西峰20是以西峰18作為母本，CA8055作為父本，通過有性雜交、分離世代的單株選擇，育成的具有抗旱、抗寒、抗病性強的新品種。輪回親本晉麥47是以12057為母本，(522×K37-20)為父本，經(jīng)雜交，采用后裔育種選育而成，高產(chǎn)，抗寒耐凍性好，分蘗較強，灌漿速度快，現(xiàn)為國家黃淮旱地、山西省旱地、陜西省旱地區(qū)試的對照品種。

試驗于2013年10月—2014年6月在甘肅省蘭州市榆中縣小麥試驗點(35°51′N，104°07′E，平均海拔1 900 m，平均氣溫6.6℃，年降雨量450 mm，年蒸發(fā)量1 450 mm，無霜期140 d)進(jìn)行。小麥播前基肥施用量為純N 180 kg·hm-2，P2O5120 kg·hm-2，K2O 75 kg·hm-2，在整個生育期內(nèi)均不再施肥。田間試驗水分管理分為雨養(yǎng)，即干旱脅迫(drought stress，DS)和灌溉(well watered，WW)兩種處理，播前均統(tǒng)一灌底墑水900 m3·hm-2。灌溉處理按正常的田間水分管理進(jìn)行，分別在越冬前、翌年拔節(jié)期和開花期補充灌水，每次灌水量均為600 m3·hm-2。雨養(yǎng)的試驗材料僅越冬前灌水750 m3·hm-2，其余生育期依靠自然降水，全生育期(播種至收獲)降水量為103 mm。以上試驗為隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，6行區(qū)，均為稀條播，行長1 m，行距0.2 m，每行點播小麥60粒。

1.2 試驗方法

1.2.1 目標(biāo)性狀的測定 在小麥的抽穗期、開花期和灌漿期，利用便攜式葉綠素測定儀(SPAD-502Plus，日本)測定不同水分條件下ILs群體親本和各株系的旗葉葉綠素含量(ChlC)，分別記為ChlCh，ChlCf和ChlCg。在小麥?zhǔn)斋@脫粒后，風(fēng)干種子，測定各株系及其親本的千粒重(TGW)。以上表型測定均5次重復(fù)，求平均值，計算干旱脅迫系數(shù)(drought stress coefficient，DSC)，即干旱脅迫下表型值與灌溉條件下表型值的比值(DS/WW)，代表材料的抗旱性[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥ILs群體與其親本葉綠素含量和千粒重的表型分析

在兩種水分條件下，小麥ILs群體兩親本不同發(fā)育階段旗葉ChlC和TGW表型值均呈顯著或極顯著差異(表1)。供體親本西峰20不同發(fā)育時期旗葉ChlC表型值顯著高于輪回親本晉麥47，而TGW表型值反之。ILs群體各性狀的表型值均介于兩親本之間，群體內(nèi)各株系變異廣泛，存在超親分離現(xiàn)象，不同發(fā)育時期旗葉ChlC的變異系數(shù)在9.89%～16.71%(DS)和11.4%～16.54%(WW)之間；TGW的變異系數(shù)分別為8.39%(DS)和8.61%(WW)。表明，小麥ILs 群體雙親對所考察性狀有貢獻(xiàn)的等位基因在后代群體中得到廣泛分離，呈現(xiàn)出多基因控制的數(shù)量性狀特點，且目標(biāo)性狀表型多偏于輪回親本晉麥47，體現(xiàn)出導(dǎo)入系群體的遺傳特性。同時，小麥ILs 群體所有目標(biāo)性狀偏度和峰度系數(shù)的絕對值普遍小于1，表型符合正態(tài)分布，表明這些性狀系典型的多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀。

小麥ILs群體及其雙親WW條件下的目標(biāo)性狀表型值顯著高于DS條件下(表1)，各目標(biāo)性狀的旱脅迫系數(shù)在0.79～0.91之間(圖1)。其中，西峰20的旗葉ChlC旱脅迫系數(shù)隨著生育期的推移穩(wěn)定增大，千粒重的旱脅迫系數(shù)較高(0.90)。晉麥47的旗葉ChlC旱脅迫系數(shù)隨著生育期的推移而下降，千粒重的旱脅迫系數(shù)較低(0.87)。小麥ILs群體的旗葉ChlC旱脅迫系數(shù)在開花期最高(0.91)，千粒重的旱脅迫系數(shù)介于雙親之間(0.89)。由此看出，在個體和群體水平上反映出小麥旗葉ChlC和TGW的表型變異易受水分環(huán)境的影響。

2.2 小麥ILs群體葉綠素和千粒重的相關(guān)分析

從表2看出，在不同水分環(huán)境條件下，小麥ILs群體不同發(fā)育時期旗葉ChlC間呈不同程度的正相關(guān)(r=0.256～0.505**，DS；0.312*～0.429**，WW)。而ChlC與TGW間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(r=0.500**～0.629**，DS；0.488**～0.622**，WW)，其中灌漿期的旗葉ChlC與TGW表現(xiàn)出較高的相關(guān)性(r=0.629**，DS；0.622**，WW)，且DS條件下的相關(guān)系數(shù)普遍高于WW。說明在DS條件下，小麥灌漿期維持較高的葉綠素含量對千粒重具有重要作用。

表1 不同水分條件下小麥ILs及其親本的性狀表型值 Table 1 Phenotypes of the ILs and its parents under different water conditions

注：ChlCh, ChlCf和ChlCg分別表示抽穗期、開花期和灌漿期旗葉葉綠素含量；TGM表示千粒重，DS和WW分別表示干旱脅迫和灌溉處理。*P<0.05; **P<0.01.下同

Note: ChlCh, ChlCf and ChlCg mean chlorophyll content of wheat flag leaves at heading, flowering, and grain-filling stages, respectively; TGW means thousand-grain weight; DS and WW mean drought-stress and well-watered treatment, respectively. *P<0.05; **P<0.01. The same below.

圖1 小麥ILs群體與其親本葉綠素含量和 千粒重的旱脅迫系數(shù)

Fig.1 Drought stress coefficients of chlorophyll content of flag leaf and 1000-grain weight of wheat ILs and its parents

2.3 小麥ILs群體旗葉葉綠素和千粒重的通徑分析

由表3看出，在不同水分條件下，小麥ILs群體的開花期和灌漿期旗葉ChlC對TGW均有極顯著的正向直接作用，且灌漿期正向直接作用較大(0.582**,DS; 0.312**,WW)，而拔節(jié)期的直接作用較小(-0.074,DS;0.087,WW)。在DS條件下，開花期旗葉ChlC對TGW的間接總效應(yīng)呈正向作用，而拔節(jié)期和灌漿期為負(fù)向間接作用；在WW條件下，灌漿期ChlC對TGW的間接總效應(yīng)呈正向作用，而拔節(jié)期和開花期的為負(fù)向間接作用。由此可見，小麥不同發(fā)育時期旗葉葉綠素對千粒重的作用具有復(fù)雜性。對小麥ILs群體不同發(fā)育時期旗葉ChlC對TGW的總效應(yīng)(直接作用與間接作用之和)

表2 不同水分條件下小麥ILs群體各性狀之間的相關(guān)系數(shù) Table 2 Correlation coefficients among traits of wheat ILs under different water conditions

注：**, 相關(guān)性在0.01水平上顯著；*相關(guān)性在0.05水平上顯著。

Note: **, correlation is significant at the 0.01 level; *, correlation is significant at the 0.05 level.

進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，DS條件下總效應(yīng)分別為-0.231、0.464和0.429；WW條件下分別為-0.137、0.130和0.425。說明在不同水分條件下開花期和灌漿期旗葉葉綠素對千粒重有促進(jìn)作用，且在干旱脅迫下的作用更為顯著。

2.4 小麥ILs群體旗葉葉綠素和千粒重遺傳力及表型多樣性分析

由表4可以看出，在不同水分條件下，小麥ILs群體在不同發(fā)育時期ChlC遺傳力在0.29～0.62(DS)和0.20～0.43(WW)之間，表型多樣性指數(shù)在0.74～0.78(DS)和0.71～0.76(WW)之間，相比較開花期的ChlC具有較高的遺傳力和表型多樣性指數(shù)。TGW的遺傳力為0.52(DS)和0.50(WW)，表型多樣性指數(shù)為0.83(DS)和0.82(WW)。各目標(biāo)性狀整體表現(xiàn)出表型多樣性指數(shù)較高，遺傳力低的數(shù)量性狀的特點，且DS條件下的各性狀遺傳力和表型多樣性指數(shù)高于WW條件下的，表明干旱脅迫在一定程度上豐富了各目標(biāo)性狀表型多樣性。

表3 不同水分條件下小麥ILs群體不同發(fā)育時期葉綠素含量對千粒重的通徑分析 Table 3 Path analysis of flag leaf chlorophyll contents at different growth stages to thousand-grain weight of wheat ILs under different water conditions

表4 不同水分條件下小麥ILs群體各性狀的 遺傳力和多樣性指數(shù) Table 4 Heritability and diversity index of traits in wheat ILs under different water conditions

3 討 論

小麥持綠性和千粒重是小麥重要的生理和農(nóng)藝性狀，是產(chǎn)量形成的重要影響因子[13,19-20]。小麥功能葉片持綠性，即較高的葉綠素含量與光合速率與強度，干物質(zhì)的積累與轉(zhuǎn)運，籽粒灌漿和產(chǎn)量的形成密切相關(guān)[4-6,21-22]。然而，小麥持綠性和千粒重對水分環(huán)境響應(yīng)極為敏感，干旱脅迫可以加速葉綠素降解，促進(jìn)葉片衰老，削弱光合作用能力，影響籽粒灌漿，從而導(dǎo)致千粒重和產(chǎn)量顯著降低，并且具有顯著基因型差異和基因型×水分環(huán)境互作差異[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫條件下，小麥ILs群體及其親本旗葉葉綠素含量和千粒重較正常灌溉顯著下降，但供體親本西峰20不同發(fā)育階段旗葉葉綠素含量顯著高于輪回親本晉麥47；群體表型介于雙親之間，更偏向輪回親本晉麥47，且各目標(biāo)性狀表型旱脅迫系數(shù)有顯著差異，說明小麥ILs群體所考察的目標(biāo)性狀表型對水分環(huán)境敏感，存在顯著的基因型和發(fā)育階段差異。同時發(fā)現(xiàn)，小麥ILs群體不同發(fā)育時期旗葉葉綠素含量與千粒重間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，其中灌漿期旗葉葉綠素含量與千粒重表現(xiàn)出較高的相關(guān)性(r=0.629**,DS;0.622**,WW)，且干旱脅迫條件下的相關(guān)系數(shù)普遍高于灌溉的。通徑分析進(jìn)一步表明，小麥ILs群體旗葉葉綠素對千粒重均具有顯著的正向直接作用，且灌漿期正向直接作用較大(0.582**,DS;0.312**,WW)，干旱脅迫條件下的總效應(yīng)大于灌溉的。說明在干旱脅迫條件下，小麥灌漿期維持較高的葉綠素含量對千粒重貢獻(xiàn)尤為重要。從而在小麥群體水平上進(jìn)一步證實了小麥不同基因型品種間比較得出的，在干旱脅迫條件下保持小麥生育后期旗葉較高的葉綠素含量和較多綠葉面積有利于延長光合作用時間和干物質(zhì)的積累轉(zhuǎn)運，促進(jìn)籽粒灌漿，增加粒重和產(chǎn)量[6,10,23]的觀點。

小麥持綠性和千粒重是典型的微效多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀[9,12-13,20-21]。前人利用初級作圖群體DH群體[20]和RIL群體[9,12,21]對小麥持綠性和千粒重遺傳剖析發(fā)現(xiàn)，控制這些性狀的QTL在小麥整個基因組上均有分布，其遺傳受加性、上位性、加性與水分環(huán)境互作和上位性與水分環(huán)境互作效應(yīng)控制，不同的水分環(huán)境和發(fā)育階段所檢測到的QTL的數(shù)目、定位區(qū)間，以及各遺傳因子的效應(yīng)顯著不同。說明控制這些數(shù)量性狀的基因可能以一定的時空方式表達(dá)，在不同環(huán)境和不同的發(fā)育階段下具有不同的表達(dá)模式[9,12,24-25]。因此，加速開展不同水分環(huán)境、不同遺傳背景小麥材料后代群體的持綠性和千粒重數(shù)量遺傳研究，有利于發(fā)掘該性狀更為豐富的抗旱遺傳信息。本研究利用1套ILs群體對不同水分條件下該群體不同發(fā)育時期的持綠性和千粒重表型變異發(fā)現(xiàn)，各目標(biāo)性狀的表型值介于雙親之間，群體內(nèi)株系表型變異廣泛，存在超親分離現(xiàn)象，多樣性指數(shù)高，遺傳力低，易受水分環(huán)境的影響。表明該群體雙親對所考察性狀有貢獻(xiàn)的等位基因在其后代群體中得到廣泛分離，呈現(xiàn)出多基因控制的數(shù)量性狀特點，且目標(biāo)性狀表型多偏向于輪回親本晉麥47，體現(xiàn)出導(dǎo)入系群體的遺傳特性。這些研究結(jié)果將為進(jìn)一步解析干旱調(diào)控小麥持綠性和千粒重表型變異的遺傳基礎(chǔ)，及其QTL精細(xì)定位奠定良好的材料和理論基礎(chǔ)，對小麥抗旱遺傳改良具有重要意義。

致謝：感謝中國農(nóng)科院作物科學(xué)研究所景蕊蓮研究員為本試驗提供實驗材料。

[1] 邢素麗,劉孟朝,彭青偉.我國小麥資源與綜合生產(chǎn)能力研究[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2006,24(2):169-172.

[2] 張 娟,謝惠民,張正斌,等.小麥抗旱節(jié)水生理遺傳育種研究進(jìn)展[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2005.23(3):231-238.

[3] Biswal AK, Kohli A. Cereal flag leaf adaptations for grain yield under drought: knowledge status and gaps[J]. Molecular Breeding, 2013,31(4):749-766.

[4] Zhang K, Zhang Y, Chen G, et al. Genetic analysis of grain yield and leaf chlorophyll content in common wheat[J]. Cereal Research Communication, 2009,37(4):499-511.

[5] Borrell A K, Hammer G L, van Oosterom E. Stay-green: a consequence of balance between supply and demand for nitrogen during grain filling?[J]. Annals of Applied Biology, 2001,138:91-95.

[6] 李永攀,羅培高,任正隆.小麥持綠性及其與產(chǎn)量關(guān)系研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,21(5):1221-1225.

[7] Rampino P, Spano G, Pataleo S, et al. Molecular analysis of a durum wheat ‘stay green’ mutant: Expression pattern of photosynthesis-related genes[J]. Journal of Cereal Science, 2006,43(2):160-168.

[8] Tanaka A, Tanaka R. Chlorophyll metabolism[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2006,9(3):248-255.

[9] Yang D L, Li M F, Liu Y, et al. Identification of quantitative trait loci and water environmental interactions for developmental behaviors of leaf greenness in wheat[J]. Frontiers in Plant Science, 2016,7(7):273.

[10] Hafsi M, Hadji A, Guendouz A, et al. Relationship between flag leaf senescence and grain yield in durum wheat grown under drought conditions[J]. Journal of Agronomy, 2013,12(2):67-77.

[11] Naruoka Y, Sherman J D, Lanning S P, et al. Genetic analysis of green leaf duration in spring wheat[J]. Crop Science, 2012,52(1):99-109.

[12] 胡亮亮,葉亞瓊,呂婷婷,等.不同水分環(huán)境下小麥粒重QTL定位及遺傳分析[J]．草業(yè)學(xué)報,2015,24(8):118-129.

[13] Yang D L, Jing R L, Chang X P, et al. Quantitative trait loci mapping for chlorophyll fluorescence and associated traits in wheat(TriticumaestivumL.)[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2007,49(5):646-654.

[14] 施 偉,昌小平,景蕊蓮.不同水分條件下小麥生理性狀與產(chǎn)量的灰色關(guān)聯(lián)度分析[J].麥類作物學(xué)報,2012,32(4):653-659.

[15] 陳穩(wěn)良,景蕊蓮,劉惠民,等.晉麥47背景回交導(dǎo)入系的遺傳選擇與性狀分析[J].麥類作物學(xué)報,2009,29(2):206-211.

[16] Ibrahim S E, Schubert A, Pillen K, et al. Comparison of QTLs for drought tolerance traits between two advanced backcross populations of spring wheat[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2012,2(3):237-243.

[17] Wu X S, Wang Z H, Jing R L, et al. Genetic dissection of the developmental behaviours of plant height in wheat under diverse water regimes[J]. Journal of Experimental Botany, 2010,6l(11):2923-2937.

[18] Shannon C E, Weaver W. The Mathematical Theory of Communication[M]. Urbana, Chicago, USA: The University of lllinois, 1949:3-24.

[19] Xue Q, Zhu Z, Musick J T, et al. Physiological mechanisms contributing to the increased water-use efficiency in winter wheat under deficit irrigation[J]. Journal of Plant Physiology, 2006,163(2):154-164.

[20] Yang D L, Jing R L, Chang X P, et al. Identification of quantitative trait loci and environmental interactions for accumulation and remobilization of water-soluble carbohydrates in wheat (TriticumaestivumL.) stems[J]. Genetics, 2007,176:571-584.

[21] Verma V, Foulkes M J, Worland A J, et al. Mapping quantitative trait loci for leaf senescene as a yield determinant in winter wheat under optical and drought-stressed environments[J]. Euphytica, 2004,135:255-263.

[22] 侯賢清,賈志寬,韓清芳,等.輪耕對寧南旱區(qū)冬小麥花后旗葉光合性能及產(chǎn)量的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(15):3108-3117.

[23] Gong Y H, Zhang J, Gao J F, et al. Slow export of photoassimilate from stay-green leaves during late grain-filling stage in hybrid winter wheat (TriticumaestivumL.)[J]. Journal of Agronomy & Crop Science, 2005,191(4):292-299.

[24] Sun X Y, Wu K, ZhaoY, et al. QTL analysis of kernel shape and weight using recombinant inbred lines in wheat[J]. Euphytica, 2009,165:615-624.

[25] Wang R X, Hai L, Zhang X Y, et al. QTL mapping for grain-fillling rate and yield-related traits in RILs of the Chinese winter wheat population Heshangmai×Yu8679[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2009,118:313-325.