林蔚紅，陳偉國，陸水根，楊一平，戴建忠，孫海燕

（1.海寧市蠶桑技術(shù)服務(wù)站，浙江 海寧 314400； 2.嘉興市綠嘉農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司，浙江 嘉興 314000）

100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌（Empedobacter brevis）懸浮劑是我國自主創(chuàng)制的新型微生物殺蟲劑，對(duì)鱗翅目害蟲有較高的致病致死效果，對(duì)人、畜、禽及其他非靶標(biāo)生物較安全，已登記在蔬菜、水稻、茶樹、棉花、煙草上防治小菜蛾、斜紋夜蛾、稻縱卷葉螟、茶尺蠖、棉鈴蟲、煙青蟲等害蟲［1～2］。浙江省農(nóng)業(yè)廳推薦的2017年主要農(nóng)作物病蟲草害防治藥劑名單中首次將100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑用于茶尺蠖防治［3］。近年來，各地開展的田間試驗(yàn)表明短穩(wěn)桿菌對(duì)稻縱卷葉螟、茶尺蠖、菜青蟲的防效良好［4～7］。海寧作為典型的“糧—?！被煸詤^(qū)，也在探索短穩(wěn)桿菌微生物農(nóng)藥防治水稻害蟲的效果。為明確短穩(wěn)桿菌對(duì)養(yǎng)蠶生產(chǎn)的安全性，我們于2017年秋季開展了100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑對(duì)家蠶的急性食下毒性和在桑葉上的殘留毒性測(cè)定，以評(píng)價(jià)其在蠶桑地區(qū)使用的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 供試農(nóng)藥與家蠶品種

供試農(nóng)藥：100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑，鎮(zhèn)江潤(rùn)宇生物科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)，農(nóng)藥登記證號(hào)：PD20130365；77.5%敵敵畏乳油，南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司生產(chǎn)，農(nóng)藥登記證號(hào)PD85105-2。

供試家蠶：蠶品種為白玉×秋豐，由浙江省海寧市新興蠶種制造有限公司生產(chǎn)。按常規(guī)方法飼養(yǎng)至2齡、3齡和5齡，分別供試。

供試桑樹：海寧市蠶桑站試驗(yàn)桑園，荷葉白品種，12年生，中桿養(yǎng)成，每667 m2桑園栽800株。

1.2 短穩(wěn)桿菌對(duì)家蠶的急性毒性測(cè)定

經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)，將100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑稀釋成5～7個(gè)等比級(jí)差濃度的藥液，取3齡起蠶適用桑葉浸入各稀釋濃度的藥液中1 min后取出，自然晾干后的桑葉放入保鮮盒內(nèi)，各濃度處理區(qū)給入20頭3齡起蠶，在26.5℃±1℃、相對(duì)濕度75%～85%的恒溫室內(nèi)飼養(yǎng)，重復(fù)3次，以清水處理為空白對(duì)照。添毒24 h后更換成新鮮無毒桑葉，飼養(yǎng)至4齡餉食，每天調(diào)查發(fā)病死亡率。采用DPS（15.10版）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)藥液質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與家蠶幼蟲死亡率概率值進(jìn)行線性回歸分析［8］，求出對(duì)家蠶的致死中濃度（LC50）和95%置信限。

1.3 短穩(wěn)桿菌在桑葉上的殘毒期測(cè)定

設(shè)噴藥濃度和養(yǎng)蠶采葉間隔時(shí)間雙向處理組合。參照100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑推薦使用濃度設(shè)2種試驗(yàn)噴藥濃度：500倍（2000萬孢子/mL）和1000倍（1000萬孢子/mL）。噴藥前在桑枝條的頂端成長(zhǎng)葉位處做好采葉標(biāo)記，防止采摘噴藥后新生長(zhǎng)的桑葉。

養(yǎng)蠶采葉間隔時(shí)間從噴藥后1 d起，每天為一個(gè)間隔處理，采摘不同濃度藥液處理的桑葉飼喂3齡起蠶，以無毒桑葉為對(duì)照，每小區(qū)30頭蠶，重復(fù)3次，飼養(yǎng)至4齡，逐日調(diào)查記載各小區(qū)死亡蠶數(shù)量。

1.4 家蠶中毒癥狀觀察

將100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑稀釋成500倍液（2000萬孢子/mL），桑葉在藥液中浸漬約1 min后取出，晾干后分別飼喂3齡蠶和5齡蠶，觀察記錄供試家蠶的中毒癥狀。

1.5 試驗(yàn)期間天氣條件

殘毒試驗(yàn)期間天氣：平均氣溫27.1℃，最高氣溫31.4℃，最低氣溫23.9℃，平均日照4.5 h，累計(jì)降雨量11.8 mm。

2 結(jié)果與分析

2.1 短穩(wěn)桿菌對(duì)家蠶的急性食下毒性與風(fēng)險(xiǎn)性

采用浸葉法測(cè)定短穩(wěn)桿菌對(duì)3齡起蠶的急性食下毒性，毒力回歸方程為Y＝-34.6228+5.5649X（相關(guān)系數(shù)r=0.9937），LC50為1319萬孢子/mL（即100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑稀釋758倍），95%置信限為1234～1436萬孢子/mL。與田間常規(guī)使用濃度500～1000倍（2000～1000萬孢子/mL）相比，短穩(wěn)桿菌對(duì)3齡起蠶的毒性比為1.52～0.76，介于中等風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)［9］。

2.2 短穩(wěn)桿菌在桑葉上的殘毒期

100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑500倍和1000倍稀釋液噴霧處理的桑葉，噴藥后分別間隔1 d～5 d采摘桑葉，從3齡起蠶開始連續(xù)飼喂1個(gè)齡期，2種濃度藥液處理的桑葉均無致病致死現(xiàn)象。結(jié)果表明：在試驗(yàn)濃度下，100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑在桑葉上的毒性殘留較低，對(duì)養(yǎng)蠶無明顯不良影響。

2.3 家蠶的中毒癥狀

100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑500倍液處理的桑葉飼喂3齡蠶，初期食?；菊?，24 h左右開始出現(xiàn)頭胸伸出，靜伏，蠶體麻痹等癥狀，48 h后有少量個(gè)體吐褐色污液。飼喂5齡蠶，約24 h有少量吐液，蠶體麻痹、軟癟，靜伏或側(cè)倒。3齡蠶和5齡蠶48 h均無死亡，但呈假死狀，中毒后的死亡時(shí)間較長(zhǎng)。

3 小結(jié)與討論

3.1 短穩(wěn)桿菌對(duì)家蠶的急性毒性與風(fēng)險(xiǎn)性

本試驗(yàn)測(cè)定的短穩(wěn)桿菌對(duì)3齡起蠶的急性食下毒性（LC50），因其有效成份計(jì)量單位與常規(guī)農(nóng)藥不同，根據(jù)LC50無法判定急性毒性等級(jí)。采用毒性比評(píng)價(jià)法，即100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑稀釋758倍（其1319萬孢子/mL的LC50值），與田間推薦使用濃度500～1000倍（2000～1000萬孢子/mL）相比，短穩(wěn)桿菌的毒性比為1.52～0.76，介于中等風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)。在［10］中，100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑對(duì)2齡家蠶的LC50為2200萬孢子/mL（約為供試藥劑稀釋455倍），與本試驗(yàn)結(jié)果相近。

對(duì)比孫海燕等［11］47種殺蟲劑對(duì)家蠶的毒性比數(shù)據(jù)，短穩(wěn)桿菌懸浮劑對(duì)家蠶的急性毒性風(fēng)險(xiǎn)較低，僅大于吡蚜酮和樂果。

3.2 短穩(wěn)桿菌在桑葉上的殘毒期短

100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑500倍和1000倍稀釋液噴霧處理的桑葉，噴藥后分別間隔1 d～5 d采摘桑葉，從3齡起蠶開始連續(xù)飼喂1個(gè)齡期，均無中毒致病致死現(xiàn)象。表明100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑供試濃度下，在桑葉上的殘留毒性較低。盡管急性食下毒性測(cè)定的LC50值介于殘毒試驗(yàn)2種稀釋濃度之間，但殘毒試驗(yàn)的高濃度（500倍）處理并沒有出現(xiàn)中毒死亡蠶。可能是兩方面原因所致，一是，急性食下毒性試驗(yàn)采用浸葉法，而田間殘毒期試驗(yàn)采用噴霧法，前者接觸藥液更全面，即桑葉上附著的藥物量（致病菌）更多；二是，殘毒期試驗(yàn)在9月份高溫季節(jié)進(jìn)行，而短穩(wěn)桿菌在田間應(yīng)用時(shí)受到溫度、濕度和光照等多種環(huán)境因素的影響［1］，其藥效和毒性與實(shí)驗(yàn)室測(cè)定存在一定差異。杭忠寶等［12］試驗(yàn)報(bào)道100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑12000倍藥液噴灑后18 d的桑葉飼喂4齡起蠶仍有中毒，與本試驗(yàn)結(jié)果相差懸殊。也有報(bào)道中提到短穩(wěn)桿菌懸浮劑對(duì)家蠶高毒，蠶室、桑園及其附近禁用［13］。生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品介紹中100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑對(duì)家蠶中毒［10］?？梢姸谭€(wěn)桿菌對(duì)家蠶的毒性及其在桑葉上的殘毒期判定并不一致。

3.3 短穩(wěn)桿菌對(duì)養(yǎng)蠶生產(chǎn)的安全風(fēng)險(xiǎn)

短穩(wěn)桿菌是從罹病死亡的四齡斜紋夜蛾幼蟲尸體中分離、篩選、純化而來的生物農(nóng)藥創(chuàng)制新品種，是活體菌，其殺蟲機(jī)理是害蟲在取食過程中將足量的短穩(wěn)桿菌帶進(jìn)腸胃內(nèi)，迅速繁殖后產(chǎn)生組織病變致害蟲罹病死亡，因此藥效較慢，一般藥后3 d害蟲死亡率達(dá)到高峰［7，14］，同樣，本試驗(yàn)觀察到100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑500倍對(duì)3齡蠶和5齡蠶的致死時(shí)間也在3 d左右。本試驗(yàn)結(jié)果表明，100億孢子/mL短穩(wěn)桿菌懸浮劑對(duì)家蠶急性食下毒性和在桑葉上的殘毒均較低，對(duì)養(yǎng)蠶生產(chǎn)的安全性風(fēng)險(xiǎn)較低。鑒于短穩(wěn)桿菌是一種活體菌的特點(diǎn)，有必要深入探討其在自然環(huán)境中的繁殖特性及其對(duì)養(yǎng)蠶生產(chǎn)的影響。