梁君偉，李青山，呂喜英，連相堯，劉蘭芳，方志華

(1 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2 承德市第三醫(yī)院)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率和死亡率明顯上升，并且呈現(xiàn)明顯年輕化趨勢，發(fā)病率位居城市女性惡性腫瘤第一位，嚴重威脅女性健康和生活質量[1]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制尚未完全闡明，盡管手術和術后輔助治療取得明顯進步，乳腺癌患者的預后有了一定的改善，但乳腺癌仍具有較高的復發(fā)率[2]。近年來國內外研究[3]表明，二甲雙胍除了降糖作用外，還具有明顯抗腫瘤活性。體內及體外實驗證實其能夠抑制腫瘤細胞生長及侵襲、遷移能力，使其成為目前腫瘤學領域新的研究熱點，但二甲雙胍抗乳腺癌方面的研究較少，并且作用機制尚不清楚。第10號染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)是目前公認的抑癌基因之一，在包括乳腺癌在內的眾多腫瘤中均起著明確的抑制腫瘤細胞生長的作用[4]。研究[5，6]表明，上調PTEN基因的表達水平能夠顯著抑制腫瘤細胞的增殖及侵襲，并促進其凋亡。研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，許多藥物或化學合成物能夠通過提高PTEN的表達水平從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究觀察不同濃度的二甲雙胍對人乳腺癌細胞系SK-BR-3增殖、凋亡、侵襲及PTEN表達水平的影響，并探討二甲雙胍對乳腺癌細胞的調控機制。

1 材料與方法

1.1 二甲雙胍、細胞及試劑 二甲雙胍原藥粉劑購自美國Sigma公司。人乳腺癌細胞系SK-BR-3購自美國ATCC公司。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自大連寶生物公司，PTEN及內參β-actin引物購自廣州銳博生物公司， CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物公司，Matrigel膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司，一抗PTEN、β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng) SK-BR-3細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d換液1次，細胞呈單層貼壁生長，待融合度達90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 各組細胞增殖抑制率測算 采用CCK-8法。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期SK-BR-3細胞接種于96孔板，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，PBS清洗細胞。將SK-BR-3細胞分成4組，每組設5個平行孔，分別加入0、5、10、20 mmol/L的二甲雙胍，記為0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組。各組細胞置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液后繼續(xù)孵育3 h，酶標儀測定波長450 nm 處的OD值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-各組OD值450nm)/0 mmol/L組OD值450nm×100%。

1.4 各組細胞凋亡率測算 采用流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染法。細胞分組及藥物干預方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS緩沖液洗滌細胞，胰蛋白酶消化后以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液。取細胞懸液置于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC，混合均勻后再加入5 μL PI，室溫避光反應10 min后流式細胞儀檢測，計算各組細胞凋亡率。

1.5 各組細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 侵襲實驗。細胞分組及藥物干預方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS緩沖液洗滌細胞，胰蛋白酶消化后以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液。Matrigel膠4 ℃過夜融化，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基按1:8稀釋后，均勻涂抹至Transwell小室上室的通透膜。取各組細胞制備的單細胞懸液，于Transwell小室上室分別加入200 μL含有2×105個細胞的無血清DMEM培養(yǎng)基，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦拭去上室的細胞，4%多聚甲醛固定10 min，倒置、室溫風干，0.1%結晶紫染色。在顯微鏡下隨機取10個視野，計算穿過通透膜的細胞數(shù)目，以穿膜細胞數(shù)表示細胞侵襲能力。

1.6 各組細胞PTEN mRNA檢測 采用qRT-PCR法。細胞分組及藥物干預方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，應用TRIzol試劑按說明書操作提取細胞總RNA，取5 ng總RNA應用逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA。以cDNA為模板，參照qRT-PCR試劑盒說明書配制PCR反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增。引物序列：PTEN上游引物為5′-TTGTGGCAACAGCTGAATCTGCAGTTGGCTAAGAGAGGTT-3′，下游引物為5′-ATGTAGCAAAACCCTTCGGAAACCTCTCTTA-GCCAACTGC-3′；內參β-actin上游引物為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。PCR反應條件：95 ℃ 30s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。用2-△△Ct表示各組細胞中PTEN mRNA的相對表達量。

1.7 各組細胞PTEN蛋白檢測 采用Western blotting法。細胞分組及藥物干預方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS洗滌細胞，應用預冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心15 min后提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量法測定各組細胞蛋白濃度。按每孔50 μg蛋白上樣，10% SDS-PAGE電泳分離，蛋白質電轉至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂牛奶封閉2 h，分別加入合適濃度的一抗PTEN單克隆抗體(濃度1∶1 000)或β-actin單克隆抗體(濃度1∶3 000)，4 ℃搖床輕搖孵育過夜，漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(濃度1∶5 000)，ECL化學發(fā)光、顯影、定影、壓片、灰度掃描，以灰度值表示PTEN蛋白的相對表達水平，以β-actin 校正。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細胞增殖抑制率分別為0.0%±0.0%、23.7%±2.2%、43.2%±2.9%、63.9%±5.6%，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍對SK-BR-3細胞增殖有明顯的抑制作用，且細胞增殖抑制作用具有一定的濃度依賴性。

2.2 各組細胞凋亡率比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細胞凋亡率分別為5.1%±0.2%、18.2%±1.9%、26.3%±2.0%、40.1%±2.6%，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍對SK-BR-3細胞凋亡有明顯的促進作用，且細胞凋亡促進作用具有一定的濃度依賴性。

2.3 各組細胞侵襲能力比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細胞穿膜細胞數(shù)分別為(170±23)個、(112±14)個、(74±9)個、(30±5)個，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍對SK-BR-3細胞侵襲能力有明顯的抑制作用，且細胞侵襲能力抑制作用具有一定的濃度依賴性。

2.4 各組細胞PTEN mRNA和蛋白表達比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細胞PTEN mRNA的相對表達量分別為1.01±0.04、2.89±0.27、4.12±0.23、5.45±0.49，PTEN蛋白的相對表達水平分別為0.13±0.05、0.41±0.06、0.61±0.10、0.94±0.11，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍能夠上調SK-BR-3細胞PTEN mRNA和蛋白的表達，且表達上調作用具有一定的濃度依賴性。

3 討論

研究[9]顯示，胰島素抵抗和高血糖癥明顯增加乳腺癌的發(fā)病風險，特別是對于絕經(jīng)后合并體質量超重的患者。研究[10]表明，合并糖尿病的乳腺癌患者生存期明顯短于未合并糖尿病的患者。二甲雙胍是目前臨床廣泛應用的治療2型糖尿病的一線降糖藥物。近年來研究[11]證實,二甲雙胍可降低2型糖尿病患者腫瘤發(fā)病風險及腫瘤相關死亡率。在乳腺癌的研究[12]中也證實，二甲雙胍可降低2型糖尿病患者乳腺癌的發(fā)病率。Jiralerspong等[13]發(fā)現(xiàn)，合并糖尿病的乳腺癌患者，服用二甲雙胍患者的預后明顯優(yōu)于未服用二甲雙胍者，但至今二甲雙胍對乳腺癌發(fā)生及預后影響的具體作用機制尚未明確。

乳腺細胞的異常增生、凋亡受阻、侵襲增強是導致乳腺癌發(fā)生發(fā)展的主要因素。抑制癌細胞的增殖和侵襲并誘導其凋亡，是目前藥物治療惡性腫瘤重要的作用機制之一。近年有研究[14]證實，二甲雙胍能夠抑制腫瘤生長和增殖，并且能夠減小荷瘤裸鼠的腫瘤體積，且對機體正常細胞不產(chǎn)生破壞作用，在抗腫瘤方面具有很大的應用前景，引起了學者的關注。但二甲雙胍對乳腺癌生長、侵襲影響的研究較少。本研究用不同濃度的二甲雙胍處理人乳腺癌SK-BR-3細胞后，檢測結果顯示，二甲雙胍對SK-BR-3細胞的增殖和侵襲有著明顯的抑制作用，對SK-BR-3細胞的凋亡有著明顯的促進作用，提示二甲雙胍對乳腺癌細胞的生長有著明顯抑制作用，并且這些作用都具有一定的濃度依賴性，隨著二甲雙胍濃度的增高，作用逐漸增強。

目前有關二甲雙胍對乳腺癌細胞生長侵襲抑制作用的具體作用機制尚不清楚。近年研究[15,16]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在胃癌、腎細胞癌等多種惡性腫瘤中可以上調PTEN的表達而發(fā)揮抑癌基因的作用。PETN基因位于染色體10q2313上，含有9個外顯子和8個內含子，是至今發(fā)現(xiàn)的惟一具有磷酸酶活性和蛋白脂酶活性的抑癌基因。研究[17]發(fā)現(xiàn),PETN能夠通過調控PI3K/AKT、FAK/P130CAS、SHC/Gab、P53/MDM2、PRAP/mTOR、RAS/ERK等機體多個重要信號通路，參與細胞增殖、分化、凋亡、侵襲和遷移的調控。研究[18]顯示，50%的乳腺癌患者存在PTEN基因缺失、突變或者啟動子甲基化。Stambolic等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)，條件性敲除PTEN基因的雌性小鼠，49%在6個月后發(fā)生乳腺癌。提高乳腺癌細胞PTEN基因的表達水平能夠抑制乳腺癌細胞的增殖及侵襲遷移，并促進其凋亡[20]。在對耐藥性乳腺癌細胞的研究[21]中發(fā)現(xiàn)，提高PTEN基因的表達可以明顯提高乳腺癌細胞對化療藥物阿霉素的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠明顯上調乳腺癌細胞PTEN mRNA和蛋白的表達，并且對PTEN mRNA和蛋白表達的上調作用具有一定的濃度依賴性，隨著二甲雙胍濃度的增高，作用逐漸增強，說明二甲雙胍能夠通過上調PTEN基因的表達水平發(fā)揮抑制乳腺癌細胞生長侵襲的作用。

綜上所述，二甲雙胍能夠明顯抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲，促進其凋亡，對乳腺癌細胞的生長起著明顯的抑制作用，并且抑制作用與二甲雙胍濃度有關，其機制可能與上調PTEN的表達有關。