朱聰，賈秀紅，劉迎雪

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256603)

慢性髓系白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一種起源于多能干細(xì)胞的血液系統(tǒng)腫瘤，其治療以化療為主。阿霉素(adriamycin，ADR)是CML的常用化療藥物，但多藥耐藥的發(fā)生，嚴(yán)重影響CML治療效果及療程[1～3]。多藥耐藥是影響CML化療療效的重要原因，尋找選擇性多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑已成為研究熱點(diǎn)。根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的統(tǒng)計(jì)，目前批準(zhǔn)的抗腫瘤藥中有25%～48%來(lái)自植物，因此，天然化合物被認(rèn)為是抗腫瘤藥物的潛在來(lái)源[4，5]。芍藥苷是從白芍中提取的一種多酚類化合物，具有抗腫瘤作用。芍藥苷可以通過(guò)抑制Notch-1信號(hào)通路而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[6]，通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB信號(hào)通路而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖[7]，通過(guò)上調(diào)HTRA3表達(dá)而抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[8]，通過(guò)誘導(dǎo)MAPK家族蛋白ERK、JNK、p-38表達(dá)而誘導(dǎo)白血病Jurkat細(xì)胞的凋亡[9]。但芍藥苷對(duì)白血病多藥耐藥的影響尚未有報(bào)道。2017年10月1日～2018年1月30日，我們觀察了芍藥苷對(duì)CML耐ADR細(xì)胞株K562/ADR多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，并探討其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用芍藥苷輔助治療白血病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、細(xì)胞及試劑 芍藥苷購(gòu)自鄭州卓峰制藥有限公司，純度>98%，溶解在二甲基亞砜(DMSO)中配成100 μmol/L的原液，貯存于-20 ℃冰箱中，實(shí)驗(yàn)前用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至目的濃度；ADR購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，用雙蒸水配成2 mg/mL的溶液。K562細(xì)胞株、K562/ADR細(xì)胞株由濱州醫(yī)學(xué)院腫瘤分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自上海博升生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；細(xì)胞裂解緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、PVDF膜購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人MRP1、p38、p-p38多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；GADPH多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 ADR對(duì)K562/ADR細(xì)胞、K562細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)測(cè)算 采用CCK-8法檢測(cè)。K562細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640+10%胎牛血清培養(yǎng)液中，K562/ADR細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640+10%胎牛血清+4 μg/mL的ADR培養(yǎng)液中，均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的無(wú)菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前1周，K562/ADR細(xì)胞培養(yǎng)液更換為不含ADR的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞、K562/ADR細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整至每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)。實(shí)驗(yàn)分為2組：K562細(xì)胞組(分別加入0、0.2、0.4、0.8、1.6 μg/mL的 ADR)、K562/ADR細(xì)胞組(分別加入0、16、32、64、128 μg/mL的ADR)。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，每孔加入10 μL 的CCK溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值，并計(jì)算ADR的IC50，K562/ADR細(xì)胞對(duì)ADR的耐藥倍數(shù)=K562/ADR細(xì)胞組IC50/K562細(xì)胞組IC50。

1.3 芍藥苷對(duì)K562/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)算 采用CCK-8法檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/ADR細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整至每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)。將K562/ADR細(xì)胞分為2組：空白對(duì)照組(加入等量DMSO)、實(shí)驗(yàn)組(分別加入2、4、6、8、10、12、14、16 μmol/L的芍藥苷100 μL)，均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定各組吸光度值。K562/ADR細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值)×100%。選擇用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的芍藥苷濃度應(yīng)無(wú)明顯細(xì)胞毒性，即細(xì)胞增殖抑制率<10%。

1.4 加入芍藥苷后ADR對(duì)K562/ADR細(xì)胞的IC50測(cè)算 采用CCK-8法檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/ADR細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整至每孔細(xì)胞數(shù)為4×105個(gè)。將K562/ADR細(xì)胞分為A、B、C三組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。A組分別加入0、4、8、16、32 μg/mL的ADR；B組分別加入0、4、8、16、32 μg/mL的ADR，然后加入2 μmol/L的芍藥苷；C組分別加入0、4、8、16、32 μg/mL的ADR，然后加入4 μmol/L的芍藥苷。三組均置無(wú)菌培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各組吸光度值，計(jì)算ADR的IC50。B、C組的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=A組IC50/B組IC50或C組IC50。

1.5 加入芍藥苷后K562/ADR細(xì)胞內(nèi)ADR濃度變化觀察 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/ADR細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整至每孔細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)。將K562/ADR細(xì)胞分為a、b、c三組，a組加入3 μg/mL 的ADR；b組加入3 μg/mL 的ADR和2 μmol/L的芍藥苷；c組加入3 μg/mL的 ADR和4 μmol/L的芍藥苷。常規(guī)避光培養(yǎng)1 h，以750 g離心5 min，PBS洗滌去除游離ADR。流式細(xì)胞儀檢測(cè)485/580 nm波長(zhǎng)處ADR熒光強(qiáng)度，即細(xì)胞內(nèi)ADR濃度。

1.6 加入芍藥苷后K562/ADR細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1、MAPK信號(hào)通路蛋白p38和磷酸化p38(p-p38)檢測(cè) 采用Western blotting法。將“1.5”中a、b、c三組的K562/ADR細(xì)胞置于不同離心管，離心后收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入100 μL的蛋白裂解液，離心后提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)各受檢蛋白濃度。配制8%的SDS-PAGE凝膠，每孔加入50 μg蛋白樣品，將蛋白質(zhì)電泳并反轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶+0.2% Tween20封閉2 h，與特異性抗體4 ℃孵育過(guò)夜。次日，室溫下用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(1∶5 000)密封PVDF膜2 h,暗室中分別顯影、定影，將膠片用掃描儀掃描至電腦，并用Image J軟件進(jìn)行受檢蛋白光密度值分析。受檢蛋白相對(duì)表達(dá)量=受檢蛋白光密度值/內(nèi)參蛋白光密度值×100%。

2 結(jié)果

2.1 ADR對(duì)K562/ADR細(xì)胞、K562細(xì)胞的IC50比較 ADR對(duì) K562/ADR細(xì)胞、K562細(xì)胞的IC50分別為(48.37±2.10)、(1.47±0.36)μg/mL，兩者相比，P<0.05。K562/ADR細(xì)胞對(duì)ADR的耐藥倍數(shù)為32.91倍。

2.2 芍藥苷對(duì)K562/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性比較 2、4、6、8、10、12、14、16 μmol/L的芍藥苷對(duì)K562/ADR細(xì)胞的增殖抑制率分別為2.67%±0.82%、9.20%±1.32%、18.94%±1.84%、30.62%±1.73%、44.13%±2.28%、61.38%±2.68%、74.68%±3.98%、85.39%±5.12%，兩兩相比，P均<0.05。芍藥苷濃度為2、4 μmol/L時(shí)，對(duì)K562/ADR細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性(細(xì)胞增殖抑制率小于10%)。

2.3 加入芍藥苷后ADR對(duì)K562/ADR細(xì)胞的IC50比較 A、B、C組ADR對(duì)K562/ADR細(xì)胞的IC50分別為(29.97±1.72)、(20.03±0.75)、(13.78±0.63)μg/mL，兩兩相比，P均<0.05。B、C組對(duì)ADR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.51、2.17，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)與芍藥苷的濃度呈正相關(guān)(r=0.43，P<0.05)。

2.4 加入芍藥苷后K562/ADR細(xì)胞內(nèi)ADR濃度變化 a、b、c組熒光強(qiáng)度分別為320±14、676±62、883±28，兩兩相比，P均<0.05。

2.5 加入芍藥苷后K562/ADR細(xì)胞中MRP1、p38、p-p38蛋白的表達(dá)比較 a、b、c組中MRP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為87.69%±1.54%、80.95%±4.10%、67.72%±5.98%，兩兩相比，P均<0.05； p38蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為66.7%±1.22%、60.18%±2.78%、59.82%±4.02%，兩兩相比，P均>0.05；p-p38蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為72.43%±2.67%、63.18%±2.32%、52.23%±6.02%，兩兩相比，P均<0.05。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先觀察了K562/ADR細(xì)胞對(duì)ADR的穩(wěn)定耐藥性，并檢測(cè)了芍藥苷對(duì)K562/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性，按照細(xì)胞增殖抑制率<10%的標(biāo)準(zhǔn)，選擇2 μmol/L、4 μmol/L濃度的芍藥苷用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芍藥苷在無(wú)毒劑量下可明顯增強(qiáng)ADR對(duì)K562/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性,且逆轉(zhuǎn)效果與芍藥苷的濃度呈正相關(guān)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了加入芍藥苷后K562/ADR細(xì)胞內(nèi)ADR濃度變化情況，結(jié)果顯示，加入芍藥苷后K562/ADR細(xì)胞內(nèi)ADR濃度顯著升高，說(shuō)明芍藥苷可通過(guò)增加K562/ADR細(xì)胞內(nèi)ADR藥物濃度起到逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。

實(shí)驗(yàn)還對(duì)多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1、MAPK信號(hào)通路蛋白p38和p-p38蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，加入芍藥苷后K562/ADR細(xì)胞中MRP1、p-p38蛋白的表達(dá)水平顯著下降。多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1蛋白屬于ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)子家族成員，是化療藥物作用于腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵屏障。MRP1可阻止藥物作用于靶細(xì)胞，從而降低腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性[10～12]。MRP1在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，可導(dǎo)致化療藥物治療失敗[13，14]。本研究結(jié)果表明，與不含芍藥苷組比，ADR與芍藥苷聯(lián)用組MRP1的表達(dá)明顯降低，MRP1的表達(dá)下降增加了K562/ADR細(xì)胞內(nèi)ADR的濃度。p38是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的一員，具有多種生物活性，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)炎癥介質(zhì)合成、釋放等[15～18]。p38 MAPK信號(hào)通路活化標(biāo)志為p-p38。研究[19，20]顯示，p38 MAPK信號(hào)通路在CML的多藥耐藥產(chǎn)生中具有重要作用。同時(shí)，p38 MAPK信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)MRP1的蛋白表達(dá)水平[21]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)芍藥苷處理24 h后，p38蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)明顯改變，而p-p38表達(dá)水平明顯降低，即p38活性降低，表明芍藥苷通過(guò)p38 MAPK通路抑制MRP1蛋白表達(dá)。

綜上，芍藥苷能逆轉(zhuǎn)K562/ADR細(xì)胞對(duì)ADR的耐藥性，逆轉(zhuǎn)作用與抑制P38 MAPK信號(hào)通路及下調(diào)MRP1蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為臨床應(yīng)用芍藥苷治療CML奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。