張樹紅，覃超喜，孫燕

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530022)

在婦產(chǎn)科領(lǐng)域，胚胎停育發(fā)生率約1%[1]。其原因眾多，一部分原因歸結(jié)于胚胎染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、免疫因素、子宮結(jié)構(gòu)異常、感染、化學制劑和心理因素[2]，但仍近50%的患者病因不明。因此，原因不明的胚胎停育是目前研究的熱點[3]。成功的妊娠依賴于胎盤良好的發(fā)育和生長，在胎盤植入與胎盤形成的過程中，血管生成對于成功妊娠非常關(guān)鍵。有文獻報道，胚胎發(fā)育過程中，胎盤血管功能不全可能是引起胚胎停育的原因之一[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可參與胎盤血管生成的信號通路，影響胎盤血管的生成，介導(dǎo)早期的胚胎發(fā)育[5]。hsa-miR-2276-3p作為miRNA的一種，在血管內(nèi)皮細胞中有特異性高表達。整合素9(ITGA9)作為細胞表面黏附分子介導(dǎo)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細胞分化、胚胎發(fā)育及細胞黏附等方面發(fā)揮重要作用；其配體很多，可與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)相互作用。本研究檢測了胚胎停育患者絨毛組織中miR-2276-3p及ITGA9、VEGF mRNA的表達情況，進而探討三者的相關(guān)性，為胚胎停育發(fā)病機制的研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年11月～2018年2月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院計劃生育科就診的胚胎停育和正常早孕行人工流產(chǎn)患者各30例，術(shù)中均留取絨毛組織。胚胎停育患者年齡(28.4±3.3)歲，孕齡49～65 d，均經(jīng)B超確診；正常早孕者年齡(27.7±3.8)歲，孕齡49～69 d。兩者的既往月經(jīng)均規(guī)律，月經(jīng)周期(28±3)d；近3月未服用激素類藥物，且排除生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌異常、孕期感染、自身免疫性疾病等，無肝炎、結(jié)核、性病等傳染病史，夫妻雙方均無遺傳病史。兩者年齡及孕齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 絨毛組織中hsa-miR-2276-3p及ITGA9、VEGF mRNA檢測方法 采用實時熒光定量PCR法。取100 mg絨毛組織,勻漿研磨，加入細胞裂解液裂解，TRIzol法提取組織總RNA。用NanoDrop2000紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，OD260/OD280均在1.8～2.1。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)說明書進行，將總mRNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈模板鏈cDNA，以cDNA為模板用PCR反應(yīng)試劑盒進行PCR。引物序列：hsa-miR-2276-3p上游為5′-TGCGCTCTGCAAGT-GTCAGAGG-3′，下游為5′-GTCGTATCCAGTGCAGG-GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTCGCCT-3′；ITGA9 mRNA上游為5′-AACCCAGAAGAGGTG-ACGG-3′，下游為5′-GAGGATTCCCACCAACAAAC-3′；VEGF mRNA上游為5′-CAAAGCCAGCACATAGGAGAGAT-3′，下游為5′-TTTTTGCAGGAACATTTACACGTC-3′；GAPDH上游為5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，下游為5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，行 40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，進行歸一化。用2-ΔΔCt計算相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 絨毛組織中hsa-miR-2276-3p及ITGA9、VEGF mRNA表達情況比較 胚胎停育患者絨毛組織中hsa-miR-2276-3p相對表達量為2.05±0.52，高于正常早孕者的1.12±0.27(P<0.05)；ITGA9、VEGF mRNA相對表達量分別為1.72±0.33、1.77±0.15，均低于正常早孕者的2.34±0.48、2.48±0.19(P均<0.05)。

2.2 胚胎停育患者絨毛組織中hsa-miR-2276-3p與ITGA9、VEGF mRNA表達的相關(guān)性 在胚胎停育患者絨毛組織中，has-miR-2276-3p與ITGA9、VEGF mRNA的表達均呈負相關(guān)(r分別為-0.679、-0.528，P均<0.05)。

3 討論

目前，胚胎停育的發(fā)病機制不明，導(dǎo)致臨床治療困難。越來越多的證據(jù)表明，胎盤血管發(fā)育不良和內(nèi)皮功能障礙可能導(dǎo)致胚胎停育的發(fā)生[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些特異性表達在血管內(nèi)皮細胞中的miRNA與胚胎的血管生成有密切關(guān)系，通過影響胎盤血管形成、細胞遷移和細胞侵襲、表觀調(diào)控特別是DNA甲基化，影響早期胎盤發(fā)育和功能表達,在滋養(yǎng)細胞的增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[7]，增加了胚胎停育的發(fā)生風險。

研究發(fā)現(xiàn),hsa-miR-2276-3p特異性高表達于內(nèi)皮細胞上,調(diào)控內(nèi)皮細胞對VEGF的反應(yīng)[8]。hsa-miR-2276-3p在國內(nèi)外研究較少，僅有較少文獻報道其在乳腺癌[9，10]、結(jié)腸癌[11]組織中表達下調(diào)，參與其腫瘤細胞的血管增生、侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，我們就has-miR-2276-3p是否也參與胚胎絨毛血管的生成進而調(diào)控胚胎的發(fā)育進行研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，has-miR-2276-3p在胚胎絨毛組織中的血管內(nèi)皮細胞中有特異性表達；本研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-2276-3p在胚胎停育組絨毛組織中的表達量高于正常早孕者。這表明has-miR-2276-3p的上調(diào)可能與胚胎發(fā)育中血管生成減少有關(guān)，進而引起胚胎停育發(fā)生。我們推測，hsa-miR-2276-3p可能通過調(diào)控其他基因的表達影響絨毛滋養(yǎng)細胞成血管能力，包括增殖、遷移和成小管能力，作用于孕早期胚胎的發(fā)育。

整合素是細胞表面重要的黏附因子，可通過與配體的結(jié)合介導(dǎo)細胞之間以及細胞、胞外基質(zhì)之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細胞分化、胚胎發(fā)育及細胞黏附等方面發(fā)揮非常重要的作用[12]。整合素種類有很多，在機體內(nèi)各種細胞內(nèi)廣泛表達，ITGA9是整合素α9β1重要組成成分。整合素α9β1的配體很多，可與神經(jīng)生長因子、血管細胞黏附分子1、肌腱蛋白C、VEGF等相互作用?，F(xiàn)已證實，整合素α9β1在細胞黏附和遷移、肺發(fā)育、淋巴管瓣和靜脈瓣膜發(fā)育及傷口愈合過程中具有重要功能。整合素α9β1在不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中調(diào)控細胞的增殖和分化，以及抗血管生成，起著不可或缺的作用[13]。目前，有關(guān)ITGA9的研究較少，其主要參與多種腫瘤細胞的生長、血管形成[14，15]，可能是新的抗腫瘤、抗血管生成的靶點[16]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，ITGA9突變可能嚴重影響胚胎發(fā)育[17，18]。本研究顯示，ITGA9 mRNA在胚胎停育患者絨毛組織中的表達量低于正常早孕者。這提示ITGA9作為信號傳導(dǎo)分子，其下調(diào)與胚胎停育發(fā)生有關(guān)。

VEGF是一類能夠與肝素結(jié)合的糖蛋白，能夠促使血管內(nèi)皮細胞的分裂、增殖，促進新生血管的形成，并且能增強血管通透性[19]。在胚胎發(fā)育過程中，VEGF主要分布在胎盤的細胞滋養(yǎng)層細胞、合體滋養(yǎng)層細胞和絨毛間質(zhì)細胞中。這提示在胎盤形成及植入過程中，VEGF具有促進胎盤絨毛血管網(wǎng)形成的作用。如果VEGF表達失衡，將會導(dǎo)致胎盤絨毛組織血管生成減少，胎盤血管生成障礙，胎兒供血不足，不能滿足胎兒生長發(fā)育所需的足夠氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，使胎兒的生長發(fā)育受限，最終引起胚胎停育的發(fā)生[20]。本研究顯示，VEGF mRNA在胚胎停育患者絨毛組織中的表達量低于正常早孕者，提示我們VEGF表達減少與胚胎停育有關(guān)。

我們前期通過基因芯片測序發(fā)現(xiàn)，ITAG9是hsa-miR-2276-3p的一個靶基因；本次研究發(fā)現(xiàn)，胚胎停育患者絨毛組織中hsa-miR-2276-3p與ITGA9、VEGF mRNA呈負相關(guān)。因此，我們推測hsa-miR-2276-3p與ITGA9可能存在靶向關(guān)系。本研究提示，hsa-miR-2276-3p與ITGA9在胚胎停育的發(fā)生過程中有負向調(diào)節(jié)作用，ITGA9作為中間信號分子，可作用于與其配體VEGF。因此，我們推測hsa-miR-2276-3p在胚胎停育患者絨毛組織中的上調(diào)可能通過抑制ITGA9的表達進而下調(diào)VEGF的表達，影響血管新生，最終導(dǎo)致胚胎停育。因此，hsa-miR-2276-3p/ITGA9/VEGF可能是胚胎停育的一條新的信號通路。本研究具有很強的創(chuàng)新性及研究價值，可為胚胎停育發(fā)生提供新的理論基礎(chǔ)。