李麗娜，徐瑞，王玉珍，陳琳

(1陜西省腫瘤醫(yī)院，西安710061；2 陜西省人民醫(yī)院)

近年來，分子靶向治療在具有驅動基因的晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者的治療中取得顯著療效，其中最具代表性的是針對表皮生長因子受體(EGFR)的靶向治療。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是一種小分子EGFR抑制劑，可通過內(nèi)源性配體競爭性結合EGFR，抑制酪氨酸激酶的活化，阻斷EGFR信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖、轉移并促進腫瘤細胞凋亡等一系列生物學效應。因此，EGFR-TKI類藥物是目前EGFR基因敏感突變晚期NSCLC的主要治療方法。臨床最常用的EGFR-TKI藥物為吉非替尼(Gefitinib)，但患者易發(fā)生繼發(fā)性耐藥，且部分患者緩解期較短。約50%的繼發(fā)耐藥由EGFR20外顯子的T790M突變所致，T790M突變可改變EGFR空間構象，使EGFR-TKIs與EGFR結合受阻，從而導致耐藥；另外約20%的獲得性耐藥與間充質(zhì)上皮轉化因子受體(c-MET)的擴增有關，c-MET通過癌基因ErbB3繞過gefitinib作用靶點，介導PI3K通路持續(xù)激活，導致獲得性耐藥[1，2]。本研究檢測了50例EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者血清c-MET基因表達，分析其與NSCLC患者臨床病理參數(shù)關系以及與TKI治療療效的相關性，旨在為血清c-MET預測EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者臨EGFR-TKI治療的效果提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2017年4月間在陜西省腫瘤醫(yī)院接受吉非替尼單藥一線治療的EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者50例，其中男22例、女28例，<60歲23例、≥60歲27例；吸煙者21例，不吸煙者29例；腫瘤分化程度為高、中分化20例、低分化30例；腺癌43例(含3例細支氣管肺泡癌)、鱗癌7例；按照ECOG一般身體狀況評分標準為PS 0～1分者22例；均符合UICC第7版肺癌TNM分期標準，影像學檢查初步診斷為肺癌Ⅳ期；均為首次來我院確診，未接受過任何抗腫瘤治療；無手術指征。50例患者均穿刺活檢取腫瘤組織進行EGFR基因18～21號外顯子突變檢測，均為19DEL或L858R突變者，確定為EGFR基因敏感突變。根據(jù)RESIST1.1評價標準，至少有一個可評價測量病灶，預計生存時間>12周。治療期間患者僅可接受骨轉移止痛治療和其它對癥處理外，不接受其他抗腫瘤治療和生物治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，患者或家屬在入組前均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 Pfu PCR MasterMix(天根科技生化有限公司)；E.Z.N.A.?Blood DNA Kit(美國 Omega 公司)；瓊脂糖(西班牙 Biowes 公司)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha innotech 公司)

1.3 血清c-MET基因表達檢測 50例患者均于吉非替尼治療前采集空腹外周靜脈血3 mL，室溫靜置6 h，3 000 r/min離心 10 min，取上清，-70 ℃保存?zhèn)溆?。采用實時定量PCR法檢測血清c-MET表達，提取血清DNA， 紫外分光光度儀測定DNA的OD260和OD280，OD260/OD280值在1.7～2.0為提取DNA合格。合成PCR引物c-MET基因上游引物：5′-TCACATCTCTCACCTCATCTG-3′，下游引物：5′-GAAGGCAGGCATTTCTGTA-3′；內(nèi)參基因Line-1上游引物：5′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3′，下游引物：5′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3′。退火溫度60 ℃。以上引物均由大連寶生物工程有限公司合成。反應體系為20 μL：PCR Mix 10 μL，上游引物(10 μM) 0.5 μL，下游引物(10 μM) 0.5 μL，模板DNA 2 μL，去離子水 7 μL。反應條件： 95 ℃預變性1 min，40個循環(huán)，95 ℃10 s；60 ℃30 s。每個樣品均設3個復孔以減少實驗誤差。試劑盒購買自西安化學試劑廠。以2-△△Ct代表c-MET的相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

1.4 吉非替尼治療及預后方法 50例患者于首日晚上服用吉非替尼(Iressa,阿斯利康公司產(chǎn)品)250 mg，以后每日早晨空腹服用吉非替尼 250 mg，直至疾病進展或出現(xiàn)無法耐受的不良反應。治療后觀察并記錄進展生存時間(PFS)、總生存時間(OS)。PFS定義為首次服用吉非替尼至有客觀證據(jù)證明疾病進展或任何原因導致死亡的時間。OS定義為從服用吉非替尼開始至任何原因死亡的時間。主要研究終點為0S和PFS。截止研究終點仍未進展或死亡患者以最后一次隨訪評價時間作為截尾數(shù)據(jù)。

2 結果

50例患者血清c-MET基因相對表達量為0.046 1±0.011，<60歲、≥60歲者血清c-MET基因相對表達量分別為0.059±0.013、0.043±0.021；男、女性血清c-MET基因相對表達量分別為0.042±0.025、0.056±0.018；吸煙、不吸煙者血清c-MET基因相對表達量分別為0.048±0.016、0.053±0.029；腺癌、鱗癌血清c-MET基因相對表達量分別為0.047±0.019、0.052±0.025；高中分化、低分化者血清c-MET基因相對表達量分別為0.055±0.014、0.052±0.023；血清c-MET表達與EGFR敏感突變NSCLC患者年齡、性別、吸煙情況、腫瘤類型、分化情況間差異無統(tǒng)計學意義(t分別為0.283、-0.835、0.748、0.917、1.063；P均>0.05)。

50例患者血清c-MET基因相對表達量中位數(shù)為0.050，以0.050為界限將50例患者分為c-MET高表達組24例、低表達組26例，血清c-MET基因相對表達量分別為0.062±0.014、0.031±0.015，二者比較，P<0.05。

50例患者的PFS、OS分別為11.2、23.4個月，c-MET基因高、低表達組PFS分別為8.5、13.9個月；OS分別為22.9、24.3個月。Kaplan-Meier生存曲線顯示，血清c-MET基因相對表達量與EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者吉非替尼治療后PFS有關(χ2=3.989，P<0.05)，與患者OS無關(χ2=0.712，P>0.05)。

Cox風險回歸模型分析結果顯示，血清c-MET基因相對表達量是EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者非EGFR-TKI治療的獨立不良預后因素(P<0.05)。

3 討論

肺癌是我國發(fā)病率和病死率絕對數(shù)最高的惡性腫瘤，其中85%以上為NSCLC[3～7]。EGFR-TKIs使NSCLC的治療從細胞毒藥物廣譜治療模式進入個體化、靶向治療模式[8，9]。EGFR-TKI治療肺癌的療效與EGFR突變密切相關。EGFR突變位點主要為18～21外顯子，最常見的為19外顯子的缺失突變(導致delE746-A750氨基酸殘基片段缺失)和21外顯子的點突變(L858R氨基酸殘基的置換)。EGFR突變可增強NSCLC患者對EGFR-TKI的敏感性。EGFR-TKI是目前EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者的一線治療方案。但EGFR基因敏感性突變的NSCLC患者在服用EGFR-TKI治療8～10個月后也會發(fā)生獲得性耐藥，且部分患者緩解期非常短。因此耐藥基因的檢測對治療模式的選擇及臨床預后判斷尤為重要。

c-MET由MET原癌基因編碼，是一類具有自主磷酸化活性的跨膜受體，屬于酪氨酸激酶受體超家族，肝細胞生長因子(HGF)是目前發(fā)現(xiàn)其唯一配體。當c-MET與HGF結合后，酪氨酸殘基可出現(xiàn)自身磷酸化，酪氨酸激酶被激活，c-MET梭基末端酪氨酸發(fā)生磷酸化，激活下游RAS-MAPK /ERK、PI3K-PKB /AKT等信號通路，參與誘導多種上皮細胞有絲分裂、增加細胞存活時間、增強細胞遷移及向胞外基質(zhì)侵襲能力、促進腺管狀形態(tài)發(fā)生，在胚胎發(fā)育、上皮生長、組織分化、損傷修復等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10，11]。c-MET參與調(diào)控多個生物學功能，包括增殖和侵襲，當失調(diào)的c-MET異常激活，可以導致腫瘤的生長和轉移。許多惡性腫瘤都伴有c-MET基因的擴增和過度表達[12]。c-MET基因突變、擴增、c-MET蛋白過表達在NSCLC的發(fā)生發(fā)展及EGFR-TKI耐藥性方面發(fā)揮重要作[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)，具有EGFR19外顯子缺失突變的HCC827 細胞株對吉非替尼敏感，但長時間吉非替尼誘導后，HCC827細胞對吉非替尼產(chǎn)生耐藥，檢測c-MET 基因拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)其擴增5～10倍；進一步研究證明 c-MET 的基因擴增激活了c-MET/ ERBB3/PI3K信號通路，從而引起非小細胞肺癌對吉非替尼耐藥。Noonan等[15]通過熒光原位雜交技術檢測了447例NSCLC患者的腫瘤組織中EGFR、c-MET基因表達情況后發(fā)現(xiàn)，435例進行c-MET基因檢測的患者中48例出現(xiàn)基因拷貝增高(≥5拷貝/細胞)，其中18例為真性c-MET基因擴增，c-MET基因擴增陽性患者較陰性患者生存期短，差異具有統(tǒng)計學意義，c-MET基因擴增是術后NSCLC患者的獨立不良預后因素。c-MET 擴增作為除EGFR突變之外的另一種NSCLC 驅動基因，是體現(xiàn)不良預后的因子，同時也是EGFR-TKI 治療繼發(fā)耐藥基因之一。研究[16]報道，在c-MET擴增的耐藥肺癌細胞中，c-MET抑制劑可明顯提高EGFR TKI耐藥肺癌細胞的敏感性。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，血清c-MET基因相對表達量與NSCLC性別、年齡、吸煙史、病理類型等臨床病理特點均無關。生存分析顯示，治療前血清c-MET基因相對表達量情況與EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者EGFR-TKI治療后PFS有關，但與OS無關。進一步分析發(fā)現(xiàn)，血清c-MET基因表達是晚期NSCLC EGFR-TKI治療的獨立不良預后因素。并說明血清c-MET參與了EGFR-TKI的獲得性耐藥，檢測EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者EGFR-TKI治療前血清c-MET基因的擴增情況可預測EGFR-TKI療效。

綜上所述, EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者治療前血清c-MET基因表達水平與吉非替尼治療后PFS有關。血清c-MET基因表達可能成為EGFR基因敏感突變晚期NSCLC患者EGFR-TKI治療療效的預測因素。