任海龍

（西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏拉薩 850000）

大黃（Rheum L.）是蓼科多年生高大草本植物[1]。大黃是一種很常見的中藥材[2]，其功效與作用是很突出的[3]。大黃具有很強(qiáng)的抗感染作用、瀉下作用、保肝作用、退熱作用、治療慢性腎衰竭等用途[4-5]。大黃對(duì)根癌土壤桿菌[6]和青霉孢子[7]具有明顯的抑制作用。近年來，對(duì)于大黃化學(xué)成分的研究相對(duì)較多，南海江等[8]對(duì)大黃屬植物的有效化學(xué)成分進(jìn)行總結(jié)，研究發(fā)現(xiàn)，大黃屬植物中有將近200種化學(xué)成分；廖華衛(wèi)等[9]對(duì)大黃含片中的大黃酚進(jìn)行了提取、分離和純化方法的研究；龔云麒等[10]通過各種色譜方法從拉薩大黃乙醇提取物中分離的化合物經(jīng)現(xiàn)代波譜技術(shù)進(jìn)行了分別鑒定。劉喜綱等[11]對(duì)購于北京同仁堂大黃的總蒽醌的提取精制工藝進(jìn)行了研究，找到了一種相對(duì)適合提取大黃總蒽醌的提取工藝。目前在分子方面研究相對(duì)比較少，程小麗等[12]對(duì)重慶產(chǎn)大黃總RNA提取方法進(jìn)行了研究，獲得了質(zhì)量較高的總RNA樣品。而對(duì)于DNA提取方面的研究甚少，若要詳細(xì)了解其分子機(jī)理，最佳DNA的提取方法是必不可少的。

本研究用5種方法對(duì)大黃種子基因組DNA進(jìn)行提取，旨在篩選出最適宜的提取方法，即得到高濃度、高純度的DNA樣品。

1 材料和方法

1.1 材料

大黃種子采于西藏山南瓊結(jié)縣（E91°40′，N29°1′），將大黃種子用中草藥粉碎機(jī)粉碎，于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

將處理保存后的大黃種子樣品分別通過以下5種方法進(jìn)行基因組DNA的提取。

1.2.1 傳統(tǒng)CTAB法[13]稱取大黃種子粉末50 mg，裝入1.5 mL離心管中，加入500 μL于65℃預(yù)熱的緩沖液（0.015 mol/L EDTA（pH 值 8.0），0.075 mol/L Tris-HCl（pH值8.0），1.5%CTAB，1 mol/L NaCl），于65℃保溫30 min，每隔3～5 min輕輕顛倒混勻，使得大黃樣品與提取液充分接觸，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，再加入等體積（由上清液體積決定）的氯仿/異戊醇（24∶1），重復(fù)離心至中間無白色物質(zhì)。取上清液，加入2倍體積的無水乙醇，于-20℃放置30min；室溫下14000r/min離心17min，去上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，干燥后溶于50 μLTE。

1.2.2 改良CTAB法[14-15]稱取大黃種子粉末50mg，裝入1.5 mL離心管中，加500 μL 65℃預(yù)熱的提取緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl pH值8.0，0.1 mol/L EDTA pH 值 8.0，0.5 mol/L NaCl，2%CTAB，3%PVP，2%DTT），65℃水浴 30 min，不時(shí)顛倒混勻；稍冷卻后，4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min；取上清，加 500 μL的氯仿 /異戊醇（24∶1），振蕩混勻，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，4℃離心10 min；取上清，加等體積的異丙醇（-20℃預(yù)冷），輕輕顛倒混勻，-20℃靜置 30 min；轉(zhuǎn)速 14 000 r/min，4 ℃離心 30 min。去上清液，70%乙醇洗沉淀2次，干燥后溶于50 μLTE。

1.2.3 改良SDS法[16]稱取大黃粉末約50 mg，裝入1.5 mL離心管中，加500 μL零度預(yù)冷的提取液（50 mmol/L EDTA（pH值 8.0），50 mmol/L Tris-HCl（pH 值 8.0），3%可溶性 PVP，2%DTT），充分混勻后于0℃放置10 min，6 000 r/min離心10 min；去上清液，沉淀中加入500 μL預(yù)熱（65℃）的裂解液，混勻后65℃水浴30 min，不時(shí)輕輕顛倒混勻；稍冷卻后，加入 500 μL的氯仿 /異戊醇（24∶1），振蕩至出現(xiàn)乳濁狀（或近乳濁狀），于4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，重復(fù)2遍；取上清，加入0.25倍體積的無水乙醇和0.11倍體積5 mol/L NaAc溶液（pH值4.8），即刻10 000 r/min離心10 min；取上清，加入預(yù)冷的異丙醇（-20℃），-20℃放置30 min；4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速14 000 r/min；去上清液，70%乙醇洗滌2次，干燥后溶于50 μLTE。

1.2.4 高鹽低pH法[17]稱取大黃種子粉末約50mg，裝入1.5 mL離心管中，加入800 μL于65℃水浴鍋中預(yù)熱的提取液[11]（100 mmol/L NaAc，3%可溶性PVP，2%DTT，25 mmol/L EDTA （pH 值 8.0），2%SDS），混勻后65℃保溫30 min，不時(shí)輕輕顛倒混勻；冷卻后于4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速10 000 r/min；取上清液，加入2/3倍體積的2.5 mol/L NaAc溶液（pH值4.8），冰上放置15min；然后4℃離心10min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min。取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），振蕩混勻后4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min；取上清液，加等體積的異丙醇（-20℃預(yù)冷），充分混勻，-20℃靜置30 min；4℃離心20 min，轉(zhuǎn)速14 000 r/min，用70%乙醇洗滌，干燥后溶于50 μLTE。

1.2.5 試劑盒法 植物組DNA提取試劑盒購于上海生工生物工程有限公司。具體操作過程根據(jù)試劑盒提供的說明進(jìn)行。

1.3 DNA提取液結(jié)果檢測(cè)

1.3.1 紫外分光光度法檢測(cè) 取2 μL DNA提取液稀釋50倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品的濃度，以及在波長260，280 nm處的吸光值，通過其比率可以判斷DNA的純度及提取效果。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 配制0.8%的瓊脂糖凝膠，110 V條件下進(jìn)行電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.3.3 PCR擴(kuò)增檢測(cè) 25 μL體系：ddH2O 15.8 μL 10×Buffer（不含 Mg2+）2μL，MgCl22μL，dNTP2μL，ITS2 F（ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT）1 μL，ITS2 R（GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT）1 μL，Taq 酶 0.2 μL，樣品 DNA1 μL。

PCR反應(yīng)程序設(shè)定：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

擴(kuò)增結(jié)果用1.5%的瓊脂糖凝膠在110 V條件下進(jìn)行電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種不同DNA提取方法紫外分光光度法檢測(cè)結(jié)果

獲得高質(zhì)量的DNA提取液是對(duì)植物樣品進(jìn)行分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵步驟。本研究采用常用的DNA提取方法（CTAB法、SDS法、高鹽低pH值法和試劑盒法）提取大黃種子基因組DNA。5種不同提取方法均能提取出基因組DNA，但濃度和得率有些差別。經(jīng)紫外分光光度法檢測(cè)，結(jié)果列于表1。由表1可知，傳統(tǒng)CTAB法所提取的質(zhì)量濃度最大，為1 450 μg/mL，其次為改良CTAB法，質(zhì)量濃度為980，960 μg/mL，高鹽低 pH法居于中間，質(zhì)量濃度為560，564 μg/mL，而改良SDS法和試劑盒法所提取的DNA質(zhì)量濃度都比較少，都低于300 μg/mL。5種方法（除試劑盒法外）的A260/A230均小于2.0，說明有殘存鹽和小分子雜質(zhì)污染。其中，傳統(tǒng)CTAB法和改良CTAB法的A260/A230遠(yuǎn)小于2.0，說明小分子雜質(zhì)特別多。高鹽低pH值法、改良SDS法、試劑盒法的A260/A280均在1.7～1.9，其中，高鹽低pH法為1.82和1.81，最接近1.8，說明只是略有雜質(zhì)污染；而改良SDS法的A260/A280和A260/A230分別為1.76和1.74，試劑盒法的A260/A280和A260/A230分別為1.72和1.70，它們相對(duì)高鹽低pH法雜質(zhì)略多一點(diǎn)。

表1 5種方法所提取DNA的質(zhì)量濃度和純度

2.2 5種不同DNA提取方法瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

從圖1可以看出，改良SDS法、高鹽低pH法、試劑盒法在20 000 bp左右均能看到明顯條帶，其中，高鹽低pH法所提取的DNA條帶最亮、最完整、亮度是改良SDS法的2倍，正好與前面濃度比相對(duì)應(yīng)；試劑盒法有條帶但不完整；而傳統(tǒng)CTAB法和改良CTAB法均無明顯條帶，可能是由于CTAB法不適合大黃種子基因組DNA的提取。因此，從圖中可以得出，DNA的量從大到小依次為高鹽低pH法、改良SDS法、試劑盒法、改良CTAB法、傳統(tǒng)CTAB法。

2.3 5種不同DNA提取方法PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

從圖2可以看出，改良SDS法、高鹽低pH法和試劑盒法的PCR檢測(cè)效果都很好，條帶在500 bp左右，都可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。CTAB法沒有條帶，充分證明CTAB法不適合大黃種子基因組DNA的提取。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，CTAB法不適合大黃種子基因組DNA的提取；改良SDS法、高鹽低pH法和試劑盒法提取的大黃種子基因組DNA的純度和完整性都較好，PCR檢測(cè)結(jié)果也很好，都可以用來進(jìn)行大黃種子基因組DNA的提取。但改良SDS法所提取的DNA含量太少，時(shí)間太長，試劑盒比較昂貴；高鹽低pH法提取的DNA得率最好，時(shí)間較短，價(jià)格便宜，PCR擴(kuò)增條帶清晰，能滿足分子標(biāo)記的要求。另外，由于大黃中含酚類物質(zhì)比較多，因此，在試驗(yàn)過程中加入PVP可以更有效地去除酚類物質(zhì)，得到的DNA純度更高[18]。

對(duì)于種子基因組DNA的提取，齊剛等[19]和莊蓉等[20]研究認(rèn)為，SDS法更適合。而本研究中，在高鹽低pH法基礎(chǔ)上提高SDS含量進(jìn)行嘗試，取得了不錯(cuò)的效果。西藏大學(xué)生物分子實(shí)驗(yàn)室也進(jìn)行過燕麥種子基因組的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高鹽低pH法適合種子基因組DNA的提取[21]。

因此，本研究認(rèn)為，提取大黃種子基因組DNA的最佳方法是高鹽低pH法。

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