程慧麗，趙慧琳，楊蘇蘇，郝曉娟，楊 春，曹 揮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

八角（Illicium verum Hook.f.）是雙子葉植物綱木蘭科八角屬的一種[1]，又稱八角茴香、大茴香、大料、五香八角等[2]，主要分布于我國的廣西、廣東、云南等以及東南亞地區(qū)，大部分為野生種，生長于天然雜木林內(nèi)，是一種多年生的常綠喬木。其干燥成熟的果實中含有5%～8%的芳香油、約22%的脂肪油以及少量的蛋白質(zhì)、樹脂等[3]，是優(yōu)良的食品調(diào)料和中藥。八角作為香辛料在我國已使用數(shù)百年，其可增香調(diào)味和配制鹵湯[4]；作為中藥，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛[5]、抑菌等作用[6-7]，還被廣泛應(yīng)用于化妝品中（如牙膏、香皂等[11]）。

八角熟材不僅氣味宜人，而且不受蟲蛀。近年來，有研究表明，從天然八角茴香中提取得到的精油，具有較好的殺蟲活性和抗自由基氧化的作用[8]，可作為食品天然防腐劑和抗菌劑。此外，八角茴香水煎劑對結(jié)核桿菌及枯草桿菌具有抑制作用，其乙醇提取液對金黃色葡萄球菌、肺炎球菌及一些常見的致病性念珠菌具有抑制作用[9-10]。劉志希等[11]研究發(fā)現(xiàn)，八角茴香精油及其主要成分反式茴香醚對棉花枯萎病菌的菌絲生長具有明顯的抑制作用。陸寧海等[12]研究結(jié)果表明，八角茴香的4種不同溶劑提取物對水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、大蔥紫斑病菌（Alternaria porri）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）和棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）4 種植物病原菌都具有一定的抑制作用，丙酮和二甲苯提取八角茴香抑菌活性相對較強，甲醇次之，乙醇相對較弱。

本試驗根據(jù)八角茴香精油及其主要成分對植物病原真菌的抑制作用，采用生長速率法，測定八角提取物對不同供試菌種的抑制效果[13-14]，以篩選出作用效果較好的菌種，為進一步研究、開發(fā)八角的農(nóng)用價值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 供試植物材料為八角果實提取物（購自太谷縣中藥市場）。

1.1.2 供試菌種 香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）、番茄早疫病菌（Alterrnaria solani）、番茄黑斑病菌（Pesudomonas syringae）、蘭花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengeriana）、核枯梢病菌（Phomopsis macrospora）、三七根腐病菌（Cylindrocaipon destructans）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、甜瓜枯萎病菌（Fasarium oxysporum）、梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、豆角炭疽病菌（Colletotrichum lindemuthianum）、棗炭疽病菌 （Colletotrichum gloeosporioidies）、葡萄根腐病菌（Fusarium oxysporum）、番茄枯萎病菌（Colletotrichum gloeosporioidies）、辣椒灰霉病菌 （Botrytis cinerea）、 茄子 枯 萎病 菌（Colletotrichum gloeosporioidies）、蘋果樹腐爛病菌（Cytospora mandshurica）西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）等20種病菌，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實驗室提供，經(jīng)分離純化后，在PDA培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑和主要儀器 化學(xué)試劑為丙酮分析純。主要儀器為1702-MP8型電子天平、100～1 000 mL移液器、微波爐、滅菌鍋、培養(yǎng)箱、超凈操作臺、成像顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 稱取馬鈴薯200 g，加入1 000 mL水，煮沸0.5 h，用紗布過濾汁液，然后加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，加水補充到1 000 mL，分裝錐形瓶，放入滅菌鍋中進行滅菌，常溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 八角初提取物的制備 稱量45 g八角回香，研磨成粉末后，與225 mL的丙酮裝入浸提缸內(nèi)；用超聲波（室溫、1 h）提取[15]，靜置 12 h 后，用真空抽濾泵進行抽濾；將抽濾液放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮至一定濃度，測定其濃度；將抽濾完的八角回香再次在相同條件下提取，重復(fù)以上操作3次；將3次的提取物質(zhì)量相加，計算八角茴香的提取率及測定其濃度。

1.2.3 1 mg/mL八角提取物的制備 取八角丙酮提取物1 mL于離心管中，進行離心真空抽提后稱質(zhì)量，測定八角丙酮提取物的質(zhì)量濃度為40 mg/mL。取0.5 mL的藥物提取液于離心管中，加入滅菌后的培養(yǎng)基定容至20 mL，用振蕩器混合均勻，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的備用藥液。丙酮對照用相同方法配制。

1.2.4 抑菌活性測定 八角茴香提取物對20種病原菌絲生長的抑制作用采用生長速率測定法[16]進行，用打孔器（6 mm）在菌落邊緣菌絲生長茂盛的地方打孔，用接種針接種至加藥的PDA平板上培養(yǎng)（藥與培養(yǎng)基比為1∶19），同時以培養(yǎng)基內(nèi)加入一定比例的丙酮為對照，每個處理重復(fù)3次，置于25℃下恒溫培養(yǎng)。用十字交叉法測定每個菌落的直徑，以其平均值代表菌落的直徑（上述一系列操作必須在嚴(yán)格無菌條件下進行）。

菌絲生長抑制率＝（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－0.6 cm）×100%（1）

1.2.5 八角提取物對菌絲形態(tài)的影響 在PDA培養(yǎng)基中加入一定量的八角提取物，配制成含八角提取物濃度為0.1 mg/mL的PDA培養(yǎng)基，用打孔器（直徑6 mm）在生長旺盛的番茄灰霉病菌的菌落邊緣打取菌餅，用接種針將菌餅接入事先準(zhǔn)備好的含藥培養(yǎng)基上，以培養(yǎng)基內(nèi)加同等比例的丙酮培養(yǎng)基作為對照，在適宜的條件下振蕩培養(yǎng)（150 r/min，25℃）。處理72 h之后，分別挑取處理組和對照組的菌絲，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗菌絲表面的培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角提取物對不同病菌生長速率的影響

試驗分別對比了1 mg/mL八角提取物不同病菌的抑制作用，結(jié)果列于表1。

從表1可以看出，在八角提取物質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，對番茄灰霉病菌和辣椒灰霉病菌的抑制效果最為明顯，對這2種病原菌的抑制率都在96%以上，而且隨著時間的延長，抑菌效果相對穩(wěn)定；對其他18種病原真菌的抑菌率也都在45%以上。所以，以番茄灰霉病菌為供試菌，研究不同質(zhì)量濃度的八角提取物對番茄灰霉病菌生長速率的抑制效果。

表1 八角提取物對不同病菌的抑制作用 %

2.2 不同濃度八角提取物對番茄灰霉病菌的毒力作用

根據(jù)上述試驗對番茄灰霉病菌的抑制效果，設(shè)置 1（A），0.5（B），0.25（C），0.125（D），0.062 5（E），0（F）mg/mL不同濃度梯度的八角提取物溶液，觀察其經(jīng)過48，72，96 h的抑菌效果，其結(jié)果如圖1所示。為進一步研究本試驗中八角茴香提取物對番茄灰霉病菌抑制最佳時間和最強抑制效果，分別計算出八角茴香提取物在48，72，96 h時，番茄灰霉病菌的毒力回歸方程（y＝ax＋b）、抑制作用的有效濃度（EC50）以及相關(guān)系數(shù)（表2）。

由表2可知，在不同時間內(nèi)，當(dāng)相關(guān)系數(shù)無限趨近于1時，變數(shù)間的關(guān)系接近于直線相關(guān)。此外，以番茄灰霉病菌作為供試菌，在48 h時，有效中濃度EC50值為0.135 3 mg/mL，與72，96 h時的EC50值相比最小。由此可知，八角提取物對番茄灰霉病菌在48 h內(nèi)抑菌效果較好。

表2 八角提取物對番茄灰霉病菌的毒力

2.3 八角提取物對菌絲形態(tài)的影響

圖2為供試菌在不含八角提取物的培養(yǎng)基中的生長狀況，圖3為供試菌在含有八角提取物濃度為0.125 mg/mL時的生長狀況。與圖2（對照組）相比，在含藥培養(yǎng)基中生長的菌絲粗細程度不一，菌絲表面多有凹凸，菌絲內(nèi)溶物變少或者流失（圖3）。

3 結(jié)論與討論

本試驗以20種供試菌種作為篩選樣本，檢驗八角提取物的抑制作用，結(jié)果表明，其提取物對多種病原菌的抑制效果較好，其中，對于番茄灰霉病和辣椒灰霉病效果顯著，抑制率均達到96%以上，而且隨著時間的延長，作用效果相對比較穩(wěn)定。此外，以番茄灰霉病菌作為供試菌，在48 h時，有效中濃度EC50值為0.135 3 mg/mL，所以，八角提取物對番茄灰霉病菌在48 h內(nèi)抑菌效果明顯。通過在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)，可以明顯地觀察到菌絲的變化，菌絲表面出現(xiàn)凹凸，內(nèi)溶物流失，為進一步研究八角提取物對番茄灰霉病的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

我國物產(chǎn)豐富，許多植物資源尚未得到充分利用。八角為我國南方的特產(chǎn)香辛料，不僅是一種“藥食同源”的經(jīng)濟物種，而且其代謝產(chǎn)物中富含多種活性成分，開發(fā)價值巨大[18]。本試驗從人們關(guān)注的環(huán)保出發(fā)，對八角茴香果實提取物進行抑菌活性測定，但并未對其他部位的提取物進行藥效試驗，不能確定其抑菌活性。八角茴香提取物在室內(nèi)試驗中表現(xiàn)出很好的抑菌效果，但其是否在活體盆栽試驗以及室外試驗中也能表現(xiàn)出顯著的抑菌效果，還需要進一步研究證實。

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